二、蛋白样品的定量
BCA法蛋白浓度测定
试剂:BCA工作液 ,双蒸水,蛋白标准液( 将2mg/ml蛋白 溶 液 稀 释 至 2mg/ml,1mg/ml,0.5mg/ml, 0.125mg/ml, 0.0625mg/ml。)
管号 蛋白标准 液 ddH2O 样品 BCA(ML ) 0 100 0 10 2 1 50 50 10 2 2 25 75 10 2 3 12.5 87.5 10 2 4 6. 25 93.5 10 2 5 3.125 96.8 10 2
二、蛋白样品的定量
Lowry法
其原理为:蛋白质与碱性铜溶液中的Cu2+络合使得肽
链伸展,从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条 件下与福林酚试剂反应,产生蓝色,在一定浓度范围 内,其颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含 量成正比,由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含 量各不相同,因此在测定时需使用同种蛋白质作标准 。
额外的二抗孵育
Western blot应用
目的蛋白的表达量(定量)分析 目的蛋白的表达特性(定性)分析 目的蛋白的组织定位 目的蛋白与其它蛋白的互作
实验流程
实验成功要素
蛋白分离
转膜 封闭 洗涤 抗体孵育
蛋白抽提,蛋白定量,蛋白电泳
杂交膜的选择与处理,转膜条件的优化 封闭液的选择,封闭条件的优化 洗涤液的配制,洗涤时间及次数的选择 抗体的选择,抗体稀释倍数的优化
0.25mg/ml,
二、蛋白样品的定量
Bradford法敏感度高,并且与一系列干扰Lowry、 BCA法的还原剂(如DTT、巯基乙醇)相容。
与Bradford法相比,BCA法的显著优点是不受常用 浓度去垢剂的影响。
与Lowry法相比,BCA法操作更简单且稳定性更好