蛋白质免疫印迹技术58页PPT

主要试剂
1.ddH2O 2.30% 丙烯酰胺混合液 丙烯酰胺(arc)29g和N，N’-亚甲双丙烯酰胺(bis)1g加H2O 至100ml。储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超 过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用 期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可 以过滤。 为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电 泳成功与否。
常见问题
8.二抗的选择根据一抗的种属来源，如：一抗是兔抗大鼠目 的蛋白的抗体，则二抗应选择山羊或其他来源抗兔的抗体， 而且二抗要标记有同位素或酶。 9.条带两边扩散：加样量过多 10.条带两边高，中间凹 原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏 高
常见问题
11.条带呈皱眉状，中间高，两边低 原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡 板底部有气泡，或者两边聚合不完全 12.条带有拖尾现象 原因：样品溶解不好 13.混合搅拌速度时不宜太快，容易产生气泡影响聚合，导致 电泳带畸形。 太慢不均匀，特别是甘油
主要试剂
11.三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液Tris buffer saline（1×TBS） 洗去Tween,因为Tween会影响发光 • 10 mM Tris-HCl （pH=8.0）1 M 10 mL • 150 mM NaCl 5 M 30 mL • 三蒸水定容至 1000 mL 12. Tris buffer saline Tween（ TBST）缓冲液 洗去未结合的抗体 • 1×TBS 1000 mL • 0.05 % Tween-20 0.5 mL
蛋白浓度测定
SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳
一抗
封闭
转膜
洗涤
二抗
洗涤分析扫描 NhomakorabeaECL检测

.
20
膜的选择
1. PVDF膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹 法中常用的一种固相支持物。
2. PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔 径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 大于20KD的蛋白选用0.45um的膜，小于20KD的 蛋白选用0.2um的膜。
1.含HRP的抗体； 2.发光试剂； 3.反应的杂质;
.
27
洗脱抗体
一抗洗脱 二抗洗脱 一抗种属来源不同时，strip二抗即可
.
28
三、显色
暗室曝光 Tanon 5200 全自动化学发光图像分析系统
.
29
Tanon 5200---性能特点
适用于高分辨率和高灵 敏度的图像拍摄；
可设定连续采样的次数、 起始及终止曝光时间， 进行动态连续拍摄，拍 摄得高质量的图片；
在裂解液中加入合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准
确性！ .
7
蛋白样品的制备
① SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分 子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
② 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二 硫键，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚 成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形 成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束。
对
电转仪长期使用导致海绵变薄，
策
“三明治”结构不紧凑导致。
确保膜和胶块之间没有气泡
缓冲液中离子浓度太低，电流或电
压太高。转膜过程注意降温
.
34
四、SDS-PAGE常见问题
背景太高
原因
1. 膜没有均匀浸湿 2. 膜或者缓冲液污染 3. 封闭不充分 4. 抗体与封闭剂出现交叉

常用的固定化膜： NC膜（硝酸纤维素膜）和 PVDF膜。
《蛋白质印迹》PPT课件
优点
硝酸纤维素膜
(nitrocellulose filter membrane，NC膜)
1. 蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有较强的结合能力（80－100ug/cm2)。 2. 适用于各种显色方法，
同位素，化学发光（Luminol类）、常规显色、荧光显色； 3.背景低，信噪比高。 4. 转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间。
分离很宽分子量范围（6200KD）的蛋白质
适于分离小分子蛋 白质（10KD）
《蛋白质印迹》PPT课件
蛋白分子量标准 (marker)
未染色 marker
是最简单,最准确的marker。由于没有附带染料分子或者是标记 分子，所示大小正好是蛋白原本的大小。
现在的Marker多数都选用预混和的Marker，方便不同大小的蛋 白比较。
Schleicher & Schull公司的实验表明，转移到NC膜上的蛋白4℃条件下保存5年依 然保持免疫识别特性，可以得到清晰可信的Western Blot结果。
《蛋白质印迹》PPT课件
➢ PAGE胶的孔径随 “Bis～Arc” 比率的增加而变小， ➢ 比率接近 1：20 时孔径达到最小值。 ➢ SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“Bis～Arc” 为1：29 配
制，研究表明它能分离分子量大小相差只有3% 的 蛋白质。
《蛋白质印迹》PPT课件
凝胶浓度与蛋白分离范围
考马斯亮蓝G-250与 高 蛋白质结合呈蓝色， （约1～ 在波长595nm吸收峰， 5μg/ml）, 在一定的范围内与蛋
白质的含量呈线性关 系
易受强碱性缓冲液， TritonX-100，SDS 等去污剂的影响

二、蛋白样品的定量
BCA法蛋白浓度测定
试剂：BCA工作液 ，双蒸水，蛋白标准液（ 将2mg/ml蛋白 溶 液 稀 释 至 2mg/ml,1mg/ml,0.5mg/ml, 0.125mg/ml, 0.0625mg/ml。）
管号 蛋白标准 液 ddH2O 样品 BCA(ML ) 0 100 0 10 2 1 50 50 10 2 2 25 75 10 2 3 12.5 87.5 10 2 4 6. 25 93.5 10 2 5 3.125 96.8 10 2
二、蛋白样品的定量
Lowry法
其原理为：蛋白质与碱性铜溶液中的Cu2+络合使得肽
链伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条 件下与福林酚试剂反应，产生蓝色，在一定浓度范围 内，其颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含 量成正比，由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含 量各不相同，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准 。
额外的二抗孵育
Western blot应用
目的蛋白的表达量（定量）分析 目的蛋白的表达特性（定性）分析 目的蛋白的组织定位 目的蛋白与其它蛋白的互作
实验流程
实验成功要素
蛋白分离
转膜 封闭 洗涤 抗体孵育
蛋白抽提，蛋白定量，蛋白电泳
杂交膜的选择与处理，转膜条件的优化 封闭液的选择，封闭条件的优化 洗涤液的配制，洗涤时间及次数的选择 抗体的选择，抗体稀释倍数的优化
0.25mg/ml,
二、蛋白样品的定量
Bradford法敏感度高，并且与一系列干扰Lowry、 BCA法的还原剂（如DTT、巯基乙醇）相容。
与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受常用 浓度去垢剂的影响。
与Lowry法相比，BCA法操作更简单且稳定性更好

(2) 上样与电泳 将制备好的样品溶解后，把蛋白样品直接上样到
SDS-PAGE胶加样孔内即可。跑上层胶，70V 35Ma/块 45 min；跑下层胶，100V 35Ma/块胶 1 h左右。
转膜(Transfer)
半干转移法 将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸间。 －|纸|胶|膜|纸|＋
凝胶浓度（％） 6 8 10 12 15
最佳分离范围（KD) 50-150 30-90 20-80 12-60 10-40
(1) SDS-PAGE凝胶配制 1、配制下层胶〔别离胶〕
静置1h后制上层胶〔浓缩胶〕 2、配制上层胶〔浓缩胶〕
加完后插上梳子，静置1h
制胶
制胶过程本卷须知：
➢操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。 ➢加完别离胶后胶，加水液封时要很慢，否那么胶会 被冲变型。 ➢灌胶时开场可快一些，胶面快到所需高度时要放慢 速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不 会有气泡。 ➢别离胶充分凝固就倒去胶上层水并用吸水纸将水吸 干。 ➢插梳子时要使梳子保持水平。
Western Blot流 程
收集蛋白样品
(Protein sample preparation)
〔1〕贴壁细胞蛋白样品收集
分屡次将细 胞收至一个 管中
A 收集培养瓶或六孔板中的培养液转移至离心管中。
B 参加PBS冲洗2-3遍，再将PBS转移至离心管中，离心
收集细胞。
C 将细胞培养瓶或六孔板置于冰上，然后将离心好的离心
Western Blot 介 绍
蛋白质印迹的创造者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯 塔克〔George Stark〕。在尼尔·伯奈特〔Neal Burnette〕于 1981年所著的?分析生物化学?〔Analytical Biochemistry〕中首 次被称为Western Blot。

Western Blot
2.转移膜的选择
（1）最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素 （Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜 做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。
挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。
③拖尾
样品溶解不好
④纹理（纵向条纹）样品中含有不溶性颗粒。
⑤条带偏斜
电极不平衡或者加样位置偏斜。
⑥条带两边扩散 加样量过多
需要注意：
Western Blot
（1）凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀， 动作轻缓，放置加样孔出现不平。
（2）拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把 上样带扭曲。
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％） 15 10 7.5 5.0
线性分离范围（KD) 12-43 16-68 36-94 57-212
Western Blot
（2）避免电泳中出现以下情况
①条带呈笑脸状 凝胶不均匀冷却，中间冷却不好或电泳系统温
度偏高。
②条带呈皱眉状 可能是由于装置不合适，特别是 凝胶和玻璃
Western Blot
Western Blot基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种 固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
Western Blot 一般流程
蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳
Western Blot
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
Western Blot（间接）一般流程:
三种膜的比较
Western Blot

硝酸纤维素薄膜和六层Whatman 3MM滤纸，在硝酸纤维素薄膜左下角 剪去一角作为标记。将硝酸纤维素薄膜漂浮于去离子水的表面，使水从 膜的下部浸透以去除其间气泡，将Whatman 3MM滤纸在电转移缓冲液 中浸湿，用蒸馏水淋洗石墨电极，先将三层浸湿的滤纸放在阳极上，在 滤纸表面滚动玻璃棒以除去其间的气泡，再将浸湿的硝酸纤维素薄膜小 心平铺在滤纸上，用玻璃棒小心去除气泡。随后将12%SDS-PAGE凝胶 舒展平铺在硝酸纤维素薄膜上，用玻璃棒小心去除气泡，再将三层浸湿 的滤纸平铺在凝胶上，沁心去除气泡，最后加上石墨电极板，接通电源 进行电转移，电流的大小由凝胶的大小决定，为0.65mA/平方厘米。电 转移2小时后，停止通电，卸掉电转移装置，取下凝胶进行考马斯亮兰 染色，以检测电转移是否完全。小心取下硝酸纤维素薄膜，放在一张干 滤纸上，吸干30-60分钟后，开始进显色反应。
蛋白质免疫印迹实验
（Western Blotting）
.
1
一 实验原理
Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离， 然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固 体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。 随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第 一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反 应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗 第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应， 只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体 发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存 在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的 待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。
缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST

根据实验结果和反馈，不断优化和改 进实验条件和方法，提高实验质量。
改进实验方法
积极探索和尝试新的实验方法和技术， 提高实验效率案例一：病毒抗原的检测
总结词
高效、准确
详细描述
免疫印迹法在病毒抗原检测中具有高效、准确的优点，能够快速识别病毒抗原， 为临床诊断和治疗提供有力支持。
疾病诊断
药物研发
通过检测患者血清或其他体液中的蛋白质 表达水平，辅助医生对疾病进行早期诊断 、分型和监测病情进展。
在药物筛选和药效评估过程中，利用免疫 印迹法检测药物对特定蛋白质表达的影响 ，从而评估药物的疗效和安全性。
生物标志物研究
蛋白质相互作用研究
通过免疫印迹法检测生物样本中特定蛋白 质的表达水平，有助于揭示生物标志物与 疾病发生、发展之间的关系。
存。
03
实验操作流程
样品处理与分离
样品选择
选择适当的组织或细胞样品，确保其具有代 表性。
蛋白提取
使用适当的缓冲液和蛋白提取试剂，确保蛋 白质的完整性和活性。
细胞分离
根据细胞类型和实验需求，采用不同的分离 方法，如组织匀浆、离心等。
蛋白定量
采用BCA法、Bradford法等方法对提取的蛋 白进行定量，以便后续操作。
转印与封闭
01
02
03
转印膜选择
根据实验需求选择适当的 转印膜，如NC膜、PVDF 膜等。
转印条件
设置适当的电流、电压和 转印时间，确保蛋白质成 功转移至膜上。
封闭操作
采用合适的封闭液对转印 膜进行封闭，以减少非特 异性结合。
免疫反应与显色
一抗选择
根据实验目的选择特异性的一抗，确 保与目标蛋白的结合。
案例二：肿瘤标志物的检测

实验案例二：蛋白质相互作用分析
总结词
蛋白质相互作用分析有助于了解蛋白质之间的相互作用关系，进一步揭示生物学过程的分子机制。
详细描述
在实验中，首先将蛋白质样品进行分离和提纯，然后通过电泳分离蛋白质，再将其转移到膜上。接下 来，利用抗体技术检测两种蛋白质是否相互作用。这种方法可以用于研究蛋白质之间的相互作用关系 ，为生物学过程的研究提供重要信息。
归一化处理
将目标蛋白的密度与内参蛋白的密 度进行归一化，消除实验误差。
统计学分析
对实验组和对照组的数据进行统计 分析，比较组间差异。
数据分析的注意事项
数据可靠性
确保数据来源可靠，避免数据污染和误差。
数据可比性
确保实验条件一致，使数据具有可比性。
数据解读
结合生物学背景和实验目的，对数据进行合理解 读。
凝胶电泳
01
02
03
确定电泳条件
根据蛋白大小和分离需求， 选择合适的凝胶浓度和电 泳电压。
加样与电泳
将稀释后的蛋白样品加入 凝胶的加样孔中，开始电 泳分离蛋白质。
染色与脱色
电泳结束后，对凝胶进行 染色，使蛋白质条带显现 出来，然后进行脱色处理。
转膜

选择合适的转移膜
根据需要，选择NC膜、 PVDF膜等适合的转移膜。
实验操作流程
1. 样品制备
将细胞或组织提取蛋白，进行浓 度测定。
2. 阻断
将膜置于脱脂奶粉或BSA中，封 闭非特异性结合位点。
3. 抗体孵育
将抗体与膜在适当条件下孵育， 使抗体与目标蛋白结合。
6. 结果观察
通过荧光显微镜或其他成像设备 观察蛋白条带。
5. 显影
将荧光染料或其他标记物与抗体 结合，使蛋白在膜上显像。

子时要使梳子保持水平。）
④ 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，
槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
27
清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
①测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋 白加入4：15*Loading Buffer于离心管，100℃水中煮5min使蛋白 变性。放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4℃。
2.结果分析
3.注意事项
四
实验室常见问题解答
20
蛋白样品制 备 蛋白含量测
定
21
在六孔板中，按照一 个孔添加150μL的比 例添加适量RIPA裂解 液，用枪吹打均匀以 充分接触细胞。
样品放置冰上 30min（中间混 匀5-6次）直至 裂解完全。
充分裂解后，1000014000g离心3-5分钟， 取上清，即可进行后续 的PAGE、Western和免 疫沉淀等操作
②加足够的1*电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃 板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样 器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气
泡也可能使样品溢出。）
28
清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
浓缩胶80V电压跑20 分钟，可多跑几分钟； 分离胶180V电压跑 至底端。
疾病早期诊断
例：诸延慧，容瓘等.酶联免疫印迹术(EITB)在小鼠日本血吸虫感染早期 诊断中的应用[J]. 中国人兽共患病杂志,1993,9(3):26-29.
5
检测样品中特异性蛋白质是否