蛋白质免疫印迹技术

免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（Western Blotting，简称WB）是一种常用的分子生物学技术，主要用于检测和鉴定蛋白质的存在以及其在不同样本中的表达水平。

下面将详细介绍WB实验的具体步骤。

1.细胞裂解和蛋白质提取：首先将待检测的组织样本或细胞样本通过离心将其收集，并添加适量的裂解缓冲液。

使用超声波或机械破碎手段将细胞打乱，使蛋白质溶解在裂解缓冲液中。

再通过离心去除细胞碎片和细胞核等。

2.蛋白质浓度测定：根据实验需要，采用BCA法、Lowry法或Bradford法等方法测定蛋白质浓度，以确定后续实验的载体中待加载的蛋白质量。

3.蛋白质电泳：将相同量的蛋白质样品加入SDS-凝胶槽中，进行电泳。

电泳时蛋白质在凝胶中向阴极迁移，分子量小的蛋白质迁移速度较快，分子量大的较慢。

电泳结束后，将凝胶转移到膜上。

4.膜上瞬时染色：在转移至膜上后，可以使用Ponceau S染色或其他瞬时染色方法，以确认蛋白质在膜上的存在和转移效果。

5.阻断：在膜上的蛋白质检测之前，需要对膜进行阻断处理，以防止非特异性结合。

常用的方法是在膜上加入牛血清蛋白或脱脂奶粉的溶液，进行阻断。

6.一抗反应：加入已稀释好的一抗抗体，与目标蛋白质特异性结合。

一抗的选择要根据待检测蛋白的特异性来确定。

7.清洗：一抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的一抗抗体。

8.二抗反应：9.清洗：二抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的二抗抗体。

10.显色和成像：使用显色剂（如ECL）使膜上的蛋白质发生化学发光反应，然后将膜放入X射线片中，进行曝光。

最后使用化学显影废片机或Gel Doc System等设备进行成像。

11.数据分析：使用专业的成像软件分析成像结果，计算蛋白质的相对表达水平，并与内参蛋白进行比较。

需要注意的是，在进行WB实验的过程中，要严格操作，避免污染和交叉反应的出现。

同时，应根据实验需求选择适当的试剂和抗体，并进行标记、保存和储存等操作。

免疫印迹法原理免疫印迹法（immunoblotting）是一种用于检测特定蛋白质的方法，它是通过将待检测蛋白质与特异性抗体结合，然后通过电泳分离蛋白质，并将其转移到固体支持物上进行检测的技术。

这项技术在生物化学和分子生物学研究中得到了广泛的应用，尤其在检测蛋白质表达和定量方面具有重要意义。

免疫印迹法的原理基于免疫学和生物化学的知识，其步骤主要包括制备蛋白质样品、SDS-PAGE电泳分离、转膜、孵育抗体、显色和定量分析等。

首先，待检测的蛋白质样品需要经过裂解和处理，以保持其天然的构象和功能。

然后，蛋白质样品经过SDS-PAGE电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。

接下来，将分离后的蛋白质转移到固体支持物上，通常是通过电泳转膜或吸附法进行。

转膜完成后，需要将固相支持物进行孵育，以结合特异性的一抗和二抗。

一抗与待检测蛋白质特异性结合，而二抗与一抗结合的部位标记有酶或荧光素，用于检测和定量。

在显色步骤中，通过酶标记或荧光素标记的二抗，可以将待检测蛋白质显示出来，并且可以通过光密度仪或成像系统进行定量分析。

免疫印迹法的结果通常以蛋白质的相对分子质量和表达水平呈现，可以用于比较不同条件下蛋白质的表达差异，或者用于验证特定蛋白质的存在和表达水平。

免疫印迹法的优点在于其高灵敏度和特异性，可以检测低表达水平的蛋白质，同时也能够识别不同大小和电荷的蛋白质。

此外，该技术还可以用于检测蛋白质的修饰状态，如磷酸化、甲基化等。

然而，免疫印迹法也存在一些局限性，如对蛋白质的结构和构象要求较高，同时也需要特异性抗体的选择和优化。

总的来说，免疫印迹法是一种重要的蛋白质检测和定量方法，其原理简单清晰，操作相对容易，同时具有高灵敏度和特异性，因此在生物医学研究和临床诊断中得到了广泛的应用。

随着生物技术的不断发展，免疫印迹法也在不断地完善和改进，为科研工作者提供了更多的选择和可能性。

蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。

因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

BCA法。

2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。

煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。

煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。

蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。

(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

免疫印迹怎么测定磷酸化的蛋白免疫印迹（Western blot，WB）是利用抗原抗体特异性结合的原理，基于SDS-PAGE凝胶电泳进行蛋白质分离、纯化以及相互作用研究的技术，也是评估蛋白磷酸化状态的最常用方法。

蛋白印迹技术先利用SDS-PAGE分离蛋白质样品，随后将电泳条带转移到固相载体膜上（如PVDF或尼龙膜），再利用磷酸化特异的抗体（一抗）来鉴定目的蛋白，能与磷酸化特异抗体结合的蛋白质即为磷酸化蛋白，最后通过标记的二抗识别一抗可以指示一抗的位置，即是待研究的磷酸化蛋白质的位置。

免疫印迹法不适用放射性32P标记，避免了使用放射性同位素时的危险品和废物处理。

此外，磷酸化抗体的灵敏性较强，可以轻松的检测常规细胞提取物中的磷酸化蛋白，对样品的用量要求不算严格。

WB除了能定性检测磷酸化蛋白外，还能一定程度上评估磷酸化蛋白质的水平，由于受到不同实验处理和凝集上样误差的影响，通常先用一个抗体来检测同源蛋白的总水平(而不考虑磷酸化状态)，以确定磷酸化组分相对于总组分的比例，并充当上样内对照。

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蛋白质免疫印迹法原理
蛋白质免疫印迹法（Western Blot）是一种常用于检测蛋白质的方法。

其原理基于蛋白质电泳分离和特定抗体与目标蛋白质的特异性结合。

1. 样品制备：首先，待检样品经过蛋白质提取，然后经过电泳分离，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将样品中的蛋白质根据其分子量大小分离。

2. 蛋白转膜：随后，将分离得到的蛋白质通过电泳转印到聚合物（如聚偏氟乙烯）膜上，形成蛋白质膜。

3. 阻断：将膜置于含有蛋白质阻断剂（如牛血清白蛋白）的缓冲液中，阻止非特异性结合。

4. 抗体结合：将膜与特异性抗体一起孵育，抗体与目标蛋白质特异性结合。

这些抗体通常是经过免疫动物制备，针对目标蛋白质的特定抗原位点。

5. 靶蛋白检测：使用荧光标记或酶标记的二抗（即与第一抗体结合的抗体）与第一抗体结合。

这些二抗能够使特定结合的蛋白质与检测标记发生反应。

6. 信号检测：使用荧光标记物或底物，通过荧光检测或发色反应检测结合的蛋白质。

常用方法是使用化学发光底物，比如辣根过氧化物酶和酮硫磺胺基碳酸红等底物。

通过这个原理，蛋白质免疫印迹法可以提供关于特定蛋白质的存在、相对丰度以及蛋白质分子量等信息。

它在分子生物学和生物医学研究中被广泛应用于蛋白质分析和诊断。

蛋白质免疫印迹的原理蛋白质免疫印迹是一种常用的实验技术，用于检测特定蛋白质在混合物中的存在并确定其分子量。

该技术基于蛋白质与特异性抗体之间的特异性结合原理，通过将抗体与蛋白质结合，然后使用特定的检测方法来观察和分析蛋白质的存在与性质。

蛋白质免疫印迹技术需要获取感兴趣的蛋白质样本。

这些样本可以来自细胞、组织、血清等。

通常，需要先对样本进行蛋白质提取和纯化，以获得高质量的蛋白质样本。

接下来，将蛋白质样本进行电泳分离。

常用的电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶电泳法（2-DE）。

通过电泳分离，可以将蛋白质样本按照其分子量和电荷大小进行分离。

分离完成后，将电泳胶中的蛋白质转移到固定膜上。

这通常通过半湿式或干式转移的方法实现。

在半湿式转移中，将电泳胶和膜以间隔层叠放置，通过电流将蛋白质从胶体转移到膜上。

在干式转移中，将电泳胶和膜分开，使用特定的设备将蛋白质转移到膜上。

转移完成后，膜上的蛋白质被固定在膜上，形成蛋白质膜。

为了防止非特异性结合，膜上的蛋白质被处理成一定的条件，如用乙酸酐等进行酰化处理。

这样可以增加膜上蛋白质与抗体之间的特异性结合。

接下来，将蛋白质膜进行免疫染色。

首先，在蛋白质膜上加入特异性抗体。

这些抗体与目标蛋白质结合，形成抗原-抗体复合物。

然后，用荧光标记的或酶标记的二抗与抗原-抗体复合物结合。

这些二抗可以识别并结合一定类型的抗体，从而实现对蛋白质的检测和定量。

使用相应的检测方法观察和分析蛋白质的存在与性质。

常用的检测方法包括荧光成像、放射免疫测定和酶联免疫测定。

这些方法可以通过测量光信号、放射性信号或酶反应产物的生成来确定目标蛋白质的存在与性质。

总结起来，蛋白质免疫印迹技术是一种基于蛋白质与特异性抗体之间的特异性结合原理的实验技术。

通过将抗体与蛋白质结合，然后使用特定的检测方法来观察和分析蛋白质的存在与性质。

这项技术在生物医学研究和临床诊断中被广泛应用，对于研究蛋白质功能和疾病机制具有重要意义。

蛋白质免疫印迹实验（Western Blot）蛋白质免疫印迹（Western Blot）实验原理蛋白质免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的一种蛋白质检测方法。

对已知的表达蛋白，可以用相应的抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可以融合部分的已知片段进行检测，如HA-tag，Flag-tag，c-myc-tag等。

Western Blot采用的是聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，被检测的是蛋白质，其中检测探针是相应的抗体，显色是使用的标记后的二抗。

经过PAGE凝胶分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，如醋酸纤维素膜，固相载体以非共价键的形式吸附蛋白质。

然后以固相载体上的蛋白质作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，然后再与标记后的二抗起反应，经过底物显色以检测目的蛋白。

蛋白质免疫印迹（Western Blot）原理蛋白免疫印迹法主要分为三个阶段进行第一阶段是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在这个阶段，经过变性处理的蛋白质样品经SDS处理后会带上阴性电荷,在聚丙烯酰胺凝胶中在电场的作用下从阴极向阳极泳动,且分子量越小,泳动速度就越快。

所以在此阶段，根据蛋白的泳动速度可以将样品中的蛋白质根据其分子量的大小进行分离，此阶段分离效果肉眼不可见。

如果想观察蛋白的电泳情况，可以在电泳完成后进行考马斯亮蓝染色进行观察；第二阶段为电转移，又称为转膜。

即将在凝胶中已经分离的蛋白质条带通过电场的作用转移至硝酸纤维素膜上, 一般选用恒流300 mA，通电90 min即可将凝胶中的蛋白条带转移到醋酸纤维素膜载体上。

转移到载体上的蛋白条带也是肉眼不可见的，如果想观察转移的效果，可以在转移后对载体进行丽春红染液染色。

第三阶段为酶联免疫显色检测将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使目的条带蛋白显色。

免疫印迹wb的原理免疫印迹（Western Blotting，简称WB）是一种常用的蛋白质分析技术，广泛应用于生命科学研究领域。

它可以用来检测特定蛋白质在复杂的混合物中的存在与表达水平，具有高灵敏度和高特异性的优势。

免疫印迹的原理基于蛋白质的分子量、电荷和亲和性等特性。

首先，需要将待分析的蛋白质样品经过SDS-PAGE电泳进行分离，将蛋白质按照分子量大小分成不同的带状条带。

然后，将蛋白质从凝胶转移到聚合物膜（通常为聚偏氟乙烯膜）上，这个步骤称为电转移。

电转移过程中，蛋白质会被定向转移到膜上，形成与凝胶上相对应的蛋白质条带。

接下来，进行与待检测蛋白质特异性结合的抗体处理。

将膜浸泡在含有特异性一抗的抗体溶液中，一抗与待检测蛋白质结合形成免疫复合物。

为了增强对抗体-蛋白质复合物的检测灵敏度，通常需要进行洗涤步骤，以去除未结合的抗体和其他非特异性结合的物质。

然后，加入与第一抗体结合的二抗，这个二抗通常是与酶结合的二抗。

这种酶可以与染色底物发生反应，产生明显的信号。

这一步骤被称为二抗结合。

经过洗涤去除未结合的二抗后，加入染色底物，底物与酶发生反应后会生成可见的信号，形成蛋白质检测结果。

这种信号可以通过暗室或者专用的设备进行可视化，并进行定量分析。

免疫印迹技术的优点在于其高度特异性和高灵敏度。

通过使用特异性抗体，可以准确地检测目标蛋白质的存在与表达水平。

此外，免疫印迹还可以同时检测多个蛋白质，通过在膜上分别施加不同的抗体可以同时检测多个目标蛋白质。

然而，免疫印迹也存在一些限制。

首先，免疫印迹需要特异性抗体来检测目标蛋白质，这对于一些没有合适抗体的蛋白质来说是一个挑战。

其次，免疫印迹需要较长的实验时间，从样品制备到最终结果的获取需要几天时间。

此外，免疫印迹对于蛋白质分子量较大的蛋白质检测效果较差。

总结起来，免疫印迹是一种常用的蛋白质分析技术，通过将蛋白质从凝胶转移到膜上，并使用特异性抗体进行检测，可以准确地检测目标蛋白质的存在与表达水平。

蛋⽩质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验⽅法原理步骤及注意事项实验⽅法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋⽩质转移到膜上，然后利⽤抗体进⾏检测的⽅法。

对已知表达蛋⽩，可⽤相应抗体作为⼀抗进⾏检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

与Southern或Northern杂交⽅法类似，但Western Blot采⽤的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋⽩质，“探针”是抗体，“显⾊”⽤标记的⼆抗。

经过PAGE分离的蛋⽩质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质，且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。

以固相载体上的蛋⽩质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第⼆抗体起反应，经过底物显⾊或放射⾃显影以检测电泳分离的特异性⽬的基因表达的蛋⽩成分。

该技术也⼴泛应⽤于检测蛋⽩⽔平的表达。

实验材料蛋⽩质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基⼄醇ddH2O⽢氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰⼄酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离⼼机离⼼管硝酸纤维素膜匀浆器剪⼑移液枪刮棒实验步骤⼀、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基⼄醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。

3. 转膜缓冲液：⽢氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容⾄1000 ml。

4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O⾄1000 ml。

5. 膜染⾊液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；⼄酸2 ml；ddH2O118 ml。

蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB ）标签：western-blot免疫印迹 蛋白质蛋白质免疫印迹可应用于：（1）从蛋白质混合物中检出目标蛋白质；（2）定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况；（3）用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。

实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒裂解液 PBS SDS上样缓冲液 电泳缓冲液 转移缓冲液 丽春红染液 TBST TBS 洗脱抗体缓冲液 抗体仪器、耗材电泳仪移液器脱色摇床显影仪实验方法原理Western免疫印迹，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，探针是抗体，显色用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。

3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO40.24 g；加ddH2O至1000 ml。

蛋白质印迹技术蛋白质印迹（Western blotting）是一种检测固定在固相基质上的蛋白质的免疫化学办法，又称免疫印迹（immunoblotting )。

1979年，Towbin等将分析DNA的Southern blotting技术扩展到蛋白质的讨论领域，并且和特异、敏捷的免疫分析技术相结合，称之为“Western blotting"（蛋白质印迹）。

免疫印迹可分为两个步骤：将蛋白质由凝胶转移至固相基质上；特异性抗体检测。

试验原理蛋白质印迹法是将蛋白质混合样品经SDS-PAGE后，分别为不同的条带，其中含有能与特异性抗体相结合的待检测的蛋白质（抗原蛋白），将凝胶上的蛋白质以电转印的方式，转印至固相支持物（如硝酸纤维素膜，NC膜）上，再用特异抗体作为探针对靶蛋白举行检测的办法。

因为该办法结合了PAGE的高辨别率和固相免疫反应的高特异性等多种优点，可检测到低至1-5 ng的中等分子量大小的靶蛋白。

仪器和材料电转移装置（电源）；摇床；暗匣；转印夹；浅盘（30cm×15cm×3cm)；玻璃棒；杂交袋或杂交盒；胶片；保鲜膜；滤纸；0. 22μm孔径的硝酸纤维素膜。

试剂 (1) Running Buffer (Tris-甘氨酸电泳缓冲液，1×2500ml) ; 25 mmol/L Tris 7. 55g 250mmol/L甘氨酸 47. 0g 10%SDS 25m1 (2) Transfer Buffer ( Tris-甘氨酸电转膜缓冲液，1× 2500m1，pH＝8.3）：48 mmol/L Tris 14. 50g 39mmol/L 甘氨酸 7. 25g 10% SDS 9. 25ml 20％甲醇 500m1 (3) TTBS缓冲液（pH 7.5，2 ×2500ml)： 20 mmol/L Tris 12. l l g 0. 5 M NaCl 146. 1 g 0.05%Tween 20 2. 5 ml (4) Stripping Buffer（pH2. 0，1000m1)：甘氨酸 1. 8768 SDS 10. 0g (5) 10％牛奶封闭液：称取10. 0g脱脂奶粉，溶于80m1 TTBS（pH7.5 )中，搅拌彻低溶解，后加入TTBS定容至100m1，再加入10μl Thimerosal混匀。

蛋白质免疫印迹（Western Blot ，WB ）标签： western-blot 免疫印迹 蛋白质蛋白质免疫印迹（Western Blot ）可以：（1）从蛋白质混合物中检出目标蛋白质；（2）定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况；（3）用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA 、蛋白质-RNA 相互作用后续分析。

实验方法∙底物化学发光ECL 法∙ Western 印迹法∙ 图解 实验方法原理 Western 免疫印迹（Western Blot ）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

与Southern 或Northern 杂交方法类似，但Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒 丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB 试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤 一、试剂准备1. SDS-PAGE 试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml ；10%SDS 6.0 ml ；β-巯基乙醇 0.2 ml ；ddH 2O 2.8 ml 。

免疫印迹检测方法
免疫印迹检测方法，又称蛋白质印迹或Western Blotting，是一种利用抗
原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。

以下是其基本步骤：
1. 取样：取上清液作为样品。

2. 电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。

3. 转移：通过半干式转移，将电泳后的凝胶上的蛋白质转移到膜上。

这个过程包括割胶、平衡、膜处理、转膜等步骤。

其中，转膜是关键步骤，需要将凝胶上的蛋白质精确转移到NC膜上，滤纸、凝胶、NC膜需要精确对齐，
去除气泡，并在恒流1mA/cm2下转移小时。

4. 免疫检测：在转移后的膜上，利用抗体进行检测。

这一步通常包括一抗和二抗的结合，以及通过化学发光检测或其他方法检测到结合的抗体。

5. 结果分析：通过对比染色结果和标准条带，可以分析出样品中特定蛋白质的表达情况。

此外，阴性对照是以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。

以上信息仅供参考，具体步骤可能会根据实验需求和条件有所不同，建议咨询专业人士获取具体信息。