烟曲霉感染诊断方法

荧光定量PCR法检测烟曲霉DNA毛璞;余志辉;黄红川;杨淳;黎毅敏【摘要】目的建立检测烟曲霉DNA的荧光定量PCR方法,评价其在小鼠侵袭性烟曲霉肺部感染诊断中的意义.方法根据烟曲霉ITSI区域基因组序列,设计合成引物和荧光标记探针,优化荧光定量PCR条件,从特异性、扩增效率、灵敏度及重复性方面进行评价.建立小鼠烟曲霉肺部感染模型,用荧光定量PCR对36只实验小鼠肺组织及支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)进行检测.结果本研究设计的引物和探针特异性扩增烟曲霉DNA,最低检出量为每毫升10<'2>个烟曲霉孢子,在10<'3>～10<'7>拷贝数(Cp)内具有良好的线性关系(R<'2>=0.999).在0.5×10<'3>Cp/mL与0.5×10<'5>Cp/mL两个浓度时,批内变异系数为0.39%、0.53%,批间变异系数为2.22%、4.58%.结果成功建立了荧光定量PCR 检测烟曲霉DNA方法,该法特异性强、灵敏度高、重复性好,将有助于烟曲霉感染的早期诊断和针对性治疗.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2011(029)003【总页数】3页(P165-167)【关键词】烟曲霉;荧光定量聚合酶链反应;BALB/c小鼠【作者】毛璞;余志辉;黄红川;杨淳;黎毅敏【作者单位】广州医学院第一附属医院,广州呼吸疾病研究所,广州,510120;广州医学院第一附属医院,广州呼吸疾病研究所,广州,510120;广州医学院第一附属医院,广州呼吸疾病研究所,广州,510120;广州医学院第一附属医院,广州呼吸疾病研究所,广州,510120;广州医学院第一附属医院,广州呼吸疾病研究所,广州,510120【正文语种】中文【中图分类】R519烟曲霉是曲霉病中最常见的致病菌,占人类曲霉类感染的80%～90%，病死率达94%～100%[1-2]。

山东畜牧兽医2021年第42卷16一起赛鸽烟曲霉菌病的诊断薛聪1，范颖1，张文鑫1，孟斌1，郭繁霞2，孙培明1* （1.临沂大学农林科学学院，山东临沂276000；2.临沂科技职业学院，山东临沂）中图分类号：S858.39 文献标识码：B 文章编号：1007-1733（2021）04-0016-03 为了鉴定门诊遇到的一起以呼吸困难为主要临诊症状，以肺脏、气囊、腹膜等组织器官灰白色粟粒状结节为主要病变的赛鸽是否感染了霉菌，采集病死鸽组织样本进行霉菌的分离培养、菌落形态观察和染色镜检试验，从赛鸽组织样本中分离鉴定到一株烟曲霉菌。

烟曲霉菌在高盐察氏琼脂培养基上呈现烟绿色绒毛状、棉絮样丝状菌落。

光镜观察可见散在分布的霉菌菌体，每个菌体由分生孢子梗、分生孢子头组成；分生孢子梗光滑，呈微绿色；分生孢子头又包含烧瓶状顶囊、单层辐射状小梗和绿色的球形分生孢子。

鸽曲霉菌病又称鸽曲霉菌性肺炎，是一种真菌性传染病。

曲霉菌病主要是由烟曲霉菌和黄曲霉菌这两种病原体引起[1]。

鸽曲霉菌性肺炎主要侵犯鸽的呼吸器官导致呼吸障碍，偶尔也侵害眼、肝及脑等组织，典型病变为肺部有黄白色或灰白色的霉菌结节。

一般可通过肺部的典型剖检变化对鸽曲霉菌病做初步诊断。

但为了确诊和明确具体病原仍需进行曲霉菌的分离鉴定。

1 材料1.1 样本山东省某赛鸽养殖场饲养赛鸽约3 000羽，2020年6月鸽群陆续发病，主要以2月龄的青年鸽为主，发病率约为5 %。

病鸽初期表现为精神沉郁、食欲不振、反应迟钝、羽毛蓬乱。

随着病程发展，病鸽表现出呼吸困难、张口呼吸有“呼呼”的喘息声。

部分病鸽出现下痢，排黄白色或绿色稀便。

少数赛鸽眼睛一侧或两侧灰白色浑养殖户应将消毒时间放置在10:00~15:00时段[1]。

5 疾病防控肉鸡的疾病预防控制效果不仅反应了肉鸡的饲养水平，同时也反映了养殖户对肉鸡养殖场的管理能力。

养殖户应结合当前养殖场的养殖规模、养殖环境、肉鸡密度和季节等诸多因素，拟定具有针对性的疾病预防控制方案。

“曲霉病”的临床诊断及治疗方法概述曲霉病是感染曲霉所引起的一种慢性霉菌病，可侵犯皮肤、黏膜、眼、外耳道、鼻、鼻窦、支气管、肺、胃肠道、神经系统或骨骼，严重者导致败血症。

由各种曲霉，主要是烟曲霉引起的疾病。

呈世界性分布。

曲霉腐生于植物、土壤等处，可产生大量孢子，由呼吸道进入引起呼吸道疾患，也可引起鼻窦、眼眶部感染，皮肤烧伤后可引起感染。

机体免疫力差者可以发生感染，少数可血行播散至全身，预后不良。

呼吸系统曲霉病可分变应性支气管肺曲霉病、曲霉球（真菌球）及侵袭性肺曲霉病。

系统性曲霉病常为血行播散。

病因曲霉属分为18个群，132个种和18个变种，绝大部分为非致病菌。

可引起人类疾病者有：烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉和构巢裸壳孢菌、棒曲霉、杂色曲霉、米曲霉、灰绿曲霉、聚多曲霉、亮白曲霉、日本曲霉、阿姆斯特丹曲霉、焦曲霉、局限曲霉、黄柄曲霉、多育曲霉等，以烟曲霉最常见。

许多曲霉对植物有致病性，有些能使鸟类、昆虫及家畜感染。

皮毛工作者、饲鸟者及耕种的农民，由于吸入含曲霉孢子的灰尘、皮肤黏膜破损处以及眼部沾染了曲霉孢子而常引起感染。

临床表现曲霉病可发生在任何年龄、性别和种族，尤以农民、园艺工人及免疫功能低下的人群多见。

临床分为：1.肺曲霉病由非侵袭性曲霉病和侵袭性肺曲霉病两大类组成。

2.曲霉性鼻-鼻窦炎在真菌性鼻-鼻窦炎中，以曲霉感染最为常见，最常侵犯上颌窦、筛窦，偶可累及额窦和蝶窦等。

临床分型与肺曲霉病相似，包括非侵袭性和侵袭性曲霉病两大类。

（1）非侵袭性曲霉病①变应性曲霉性鼻-鼻窦炎最常见，好发于具有特异性变应性体质的青壮年，常有反复发作的鼻窦炎、鼻息肉或哮喘史。

②鼻窦曲霉球女性多见，病程较长，多为单发，常有头痛、鼻塞、流脓涕、鼻分泌物恶臭味等。

鼻内镜检查可见黏膜肿胀，黏稠或块状分泌物，CT扫描可见鼻窦内全部或大部分为密度不均的结节状或团块状高密度影，部分患者可见钙化灶。

③寄生性鼻-鼻窦曲霉病多无临床症状，常在鼻内镜检查时发现鼻腔和鼻窦内黏膜样痂皮堆积。

曲霉菌半乳甘露聚糖抗原提取工艺优化近年来，随着科技的发展，广谱抗生素及免疫抑制剂在临床被广泛使用，免疫缺陷患者、癌症患者、器官移植患者及血液病患者等感染侵袭性真菌病概率急剧升高。

真菌病感染如果不能早期治疗，死亡率极高。

其中，曲霉特别是烟曲霉（Aspergillus fumigatus）已经逐渐成为临床上一种重要的致病真菌。

目前传统的侵袭性曲霉菌感染检測的金标准是无菌体液培养和组织活检。

但传统的分离培养的方法阳性率低、周期长，极大的贻误病情，因此，检测烟曲霉抗原是目前临床公认的快速早期诊断烟曲霉菌感染的有效方法。

烟曲霉菌的主要抗原成分是半乳甘露聚糖（Galactomannan，GM），所以血清中GM抗原检测是一种快速、高效、特异性的早期诊断曲霉菌感染的方式。

目前国内对曲霉菌半乳甘露聚糖提取纯化的研究不多，本次研究以烟曲霉的菌体为原料，研究了GM抗原的提取工艺及后期纯化的方式。

通过液氮研磨、超声等方式对曲霉菌半乳甘露聚糖进行提取，获得粗提物后用无水乙醇以及水肼和亚硝酸处理。

并将上述处理得到的溶液用MonoQ层析柱及超滤技术进行抗原纯化，最终获得了GM抗原纯品。

通过紫外分光光度及液相色谱等技术对提取的抗原进行验证，发现通过优化曲霉菌半乳甘露聚糖提取工艺制备得到的半乳甘露聚糖抗体的得率较高且纯度较好。

标签：曲霉菌；半乳甘露聚糖；侵袭性真菌病；优化工艺；生物活性常见的真菌比细菌大几倍甚至几十倍，因此结构也比细菌要复杂得多。

真菌与细菌相比，细胞壁较厚，约占干重的30%以上，但真菌细胞壁缺乏黏肽，而是由结构不同的多糖如甘露糖、葡聚糖、脱乙酰壳多糖及几丁质等组成，部分还含有蛋白质及类脂体成分[1]。

GM抗原广泛存在于曲霉菌属的菌丝及孢子中，在部分植物中也会存在这种成分，比如大豆，GM抗原干粉的外观为白色、粉末状，在酸、盐环境下有极好的耐受性，比较耐热，在水中溶解度非常大，可形成透明溶液，GM抗原是一种以甘露聚糖为主链，以呋喃半乳糖为侧链的多糖。

㊃指南与共识㊃通信作者:宋宁,E m a i l :1469713257@q q.c o m 2015慢性肺曲霉菌病诊断和治疗临床指南解读郭宪立,宋 宁,刘 跃,袁胜芳,贾伟华(河北医科大学第二医院感染性疾病科,河北石家庄050000) 摘 要:慢性肺曲霉菌病(C P A )是一种罕见的肺部疾病,指慢性肺部曲霉菌感染,病程超过3个月㊂C P A 常继发于其他呼吸系统疾病,如肺结核㊁变应性支气管肺曲霉菌病㊁结节病等,如不积极治疗,5年病死率较高(75%~80%),因此需提高临床医师对C P A 的全面认识,以期尽早明确诊断,并给予恰当治疗,以降低其病死率㊂近年来,随着C P A 患病人数的逐渐增多,临床医师对该病的认识不断提高,关于C P A 诊治的研究成果日益增多㊂近期,欧洲临床微生物学和感染性疾病联合会(E S C M I D )㊁欧洲呼吸学会(E R S )合作,总结了关于C P A 的前期研究成果,发布了C P A 临床诊治指南,对C P A 的定义㊁临床分型㊁实验室检查㊁影像学检查㊁诊断标准㊁治疗和随访等进行了系统性阐述,本文对其进行解读,旨在学习并分享关于C P A 领域的最新成果,以指导临床治疗㊂关键词:肺曲霉菌病;诊断;临床方案;指南中图分类号:R 519.1 文献标识码:A 文章编号:1004-583X (2016)03-0325-07d o i :10.3969/j.i s s n .1004-583X.2016.03.022C h r o n i c p u l m o n a r y a s p e r g i l l o s i s :r a t i o n a l e a n d c l i n i c a l g u i d e l i n e s f o r d i a g n o s i s a n dm a n a ge m e n t G u oX i a n l i ,S o n g N i n g ,L i uY u e ,Y u a nS h e n gf a n g,J i aW e i h u a D e p a r t m e n t o f I n f e c t i o u sD i s e a s e s ,t h eS e c o n d H o s p i t a l o fH e b e iM e d i c a lU n i v e r s i t y ,S h i j i a z h u a n g 050000,C h i n a C o r r e s p o n d i n g a u t h o r :S o n g N i n g ,E m a i l :1469713257@q q .c o m A B S T R A C T :C h r o n i c p u l m o n a r y a s p e r g i l l o s i s (C P A )i s a nu n c o mm o n l u n g i n f e c t i o nd i se a s e c a u s e db y t h ef u ng u s A s p e r g i l l u s .Th ed u r a ti o no fC P A i su s u a l l y m o r et h a n3m o n t h s .C P A i so f t e ns e c o n d a r y t oo t h e rr e s p i r a t o r yd i se a s e s ,s u c ha s t u b e r c u l o s i s ,a l l e r g i cb r o n c h o p u l m o n a r y a s p e r g i l l o s i s (A B P A )a n ds a r c o i d o s i s ,e t a l .I fn o t a c t i v e t r e a t m e n t ,5y e a r s o fm o r t a l i t y w i l l b eh i g h (75%-80%).T h e r ef o r e ,i t i sn e c e s s a r y f o r c l i n i c i a n s t oc o m p r e h e n s i v e l yi m p r o v e t h eu n d e r s t a n d i n g o fC P A ,i no r d e rt oc o n f i r m t h ed i a g n o s i sa n d g i v ea p p r o p r i a t et r e a t m e n ta ss o o na s p o s s i b l e ,e v e n t u a l l y t od e c r e a s e t h em o r t a l i t y r a t e .I nr e c e n t y e a r s ,w i t ht h e g r a d u a l i n c r e a s e i nt h en u m b e ro fC P A p a t i e n t s ,t h e c l i n i c i a n s 'u n d e r s t a n d i n g o f t h e d i s e a s e i sm o r e a n dm o r e i m p r o v e d ,t h e r e s e a r c h r e s u l t s o f C P Ad i a gn o s i s a n d t r e a t m e n t a r e i n c r e a s i n g d a y b y d a y .R e c e n t l y ,a n e x p e r t g r o u p f r o mt h eE u r o p e a nS o c i e t y o f C l i n i c a lM i c r o b i o l o g ya n d I n f e c t i o u sD i s e a s e s (E S C M I D ),a n df r o m t h eE u r o p e a n R e s p i r a t o r y S o c i e t y (E R S )s u mm a r i z e dt h er e s u l t so f p r e l i m i n a r y r e s e a r c ho nC P A ,a n dr e l e a s e dar a t i o n a l ea n dc l i n i c a l g u i d e l i n e f o rd i a g n o s i sa n d m a n a g e m e n to fC P A.T h i s g u i d e l i n ec o v e r st h ed e f i n i t i o n ,c l i n i c a l c l a s s i f i c a t i o n ,l ab o r a t o r y e x a m i n a t i o n ,i m a g i n g e x a m i n a t i o n ,d i a gn o s t i c c r i t e r i a ,t r e a t m e n t ,f o l l o w -u p o fC P Aa n d e t c .T h i s a r t i c l e i s a n i n t e r p r e t i o n o f t h e n e w e s t g u i d e l i n e ,a i m s t o l e a r n a n d s h a r e t h e l a t e s t a c h i e v e m e n t s i n t h e f i e l do fC P A ,u l t i m a t e l y t od i r e c t c l i n i c a lm a n a ge m e n t .K E Y W O R D S :l u n g d i s e a s e s ,f u ng a l ;d i a g n o s i s ;c l i n i c a l p r o t o c o l s ;gu i d l i n e 慢性肺曲霉菌病(C P A )是一种罕见的肺部疾病,指慢性肺部曲霉菌感染,病程超过3个月,常继发于其他呼吸系统疾病,欧洲有约240000人罹患此病㊂随着C P A 患病人数的逐渐增多,临床医师对该病的认识不断提高,关于C P A 诊治的研究成果日益增多㊂近期,欧洲临床微生物学和感染性疾病联合会(E S C M I D )㊁欧洲呼吸学会(E R S )合作,总结了关于C P A 的前期研究成果,发布了C P A 临床诊治指南[1]㊂C P A 的临床诊疗指南较为少见,美国感染病学会(I D S A )曾于2000年提出了曲霉菌病的治疗共识,并在2008年进行了更新,此外尚无C P A 临床指南发布㊂本指南针对C P A 的定义㊁临床分型㊁实验室检查㊁影像学检查㊁诊断标准㊁治疗和随访进行了详尽的阐述,我们对其进行解读,旨在学习并分享关于C P A 领域的最新成果,以指导临床诊疗㊂1 证据质量和推荐强度的标准简介推荐等级的强度(S o R )分为4级:A :强推荐应用;B :中等程度推荐应用;C :弱推荐应用;D :推荐反对应用㊂证据质量(Q o E )水平和证据来源分为3类:Ⅰ类:证据至少有一项来源于设计良好的随机对照试验;Ⅱ类:证据至少有一项来源于设计良好的临㊃523㊃‘临床荟萃“ 2016年3月5日第31卷第3期 C l i n i c a l F o c u s ,M a r c h5,2016,V o l 31,N o .3Copyright ©博看网. All Rights Reserved.床试验,非随机队列或病例对照研究(病例最好来源于多个中心);来源于多个时间序列,或来源于非对照研究的令人瞩目的结果;Ⅲ类:证据来源于权威专家的观点㊁临床经验㊁描述性个案研究或专家委员会的报告㊂2关于C P A一些概念的共识2.1曲霉菌球(a s p e r g i l l o m a)曲霉菌球是真菌球的形态学表现,几乎完全由真菌菌丝和细胞外基质构成㊂曲霉菌球是C P A的最具特征性的影像学特征,通常可以在胸部计算机断层扫描(C T)观察到,位于肺内或胸膜腔或扩张的支气管中㊂曲霉菌球是疾病晚期的表现,是沿空洞表面生长的真菌突入空洞腔内而形成的,几乎可见于所有形式的C P A㊂ 空气新月症 也见于侵袭性肺曲霉菌病(I P A),空腔内的物质是含有曲霉菌(或其他真菌)的梗死的肺组织,称之为 真菌性肺腐骨片 (m y c o t i c l u n g s e q u e s t r u m)更为贴切,主要见于免疫功能低下的患者㊂虽然曲霉菌球可高度提示C P A,但对C P A的诊断还需要其他信息来确定㊂2.2单发肺曲霉菌球(s i n g l e/s i m p l e p u l m o n a r ya s p e r g i l l o m a)单发肺曲霉菌球是指在单个肺空洞中含有一个单发真菌球,血清或微生物学证据提示曲霉菌感染,在非免疫功能低下的患者症状轻微或没有症状,随访至少3个月影像学没有任何进展㊂2.3慢性空洞性肺曲霉菌病(c h r o n i cc a v i t a r y p u l m o n a r y a s p e r g i l l o s i s,C C P A) C C P A是C P A最常见的形式,既往称为复杂曲霉菌球,通常表现为1个或多个肺空洞,可为薄壁或厚壁,可包含1个或多个曲霉菌球,或空洞内含有不规则物质,血清学或微生物证据提示曲霉菌感染,具有显著的肺和(或)全身症状,炎症因子增高,随访3个月影像学进展明显,可出现新的空洞㊁空洞周边病变浸润范围扩大或肺纤维化增多㊂未经治疗,数年后这些空洞将不断扩大并融合,浸润周边组织或穿破胸膜,出现新的曲霉菌球或曲霉菌球消失㊂2.4慢性纤维化性肺曲霉菌病(c h r o n i c f i b r o s i n g p u l m o n a r y a s p e r g i l l o s i s,C F P A)C F P A往往是C C P A未经治疗逐渐发展而来的㊂广泛的肺纤维化累及至少两个肺叶伴有C C P A导致肺功能严重受损㊂严重的纤维化累及1个肺叶伴有1个空洞只能叫做C C P A侵及该肺叶㊂2.5曲霉菌结节(a s p e r g i l l u s n o d u l e)曲霉菌结节表现为1个或多个结节(<3c m),通常不出现空洞,是C P A的一种少见表现㊂其与结核球㊁肺癌㊁肺转移癌㊁隐球菌结节㊁球孢子菌病或其他罕见病原体相似,仅能通过组织学确诊㊂类风湿关节炎患者的肺部结节可以是单纯的风湿结节,也可以含有曲霉菌㊂如曲霉菌感染病变直径>3c m,伴中心坏死,这时称之为 曲霉菌所致团块样病变 更为贴切㊂2.6亚急性侵袭性肺曲霉菌病(s u b a c u t e i n v a s i v ea s p e r g i l l o s i s,S A I A)S A I A既往称之为慢性坏死性(c h r o n i c n e c r o t i s i n g p u l m o n a r y a s p e r g i l l o s i s, C N P A)或半侵袭性肺曲霉菌病㊂S A I A发生在轻微免疫功能低下或非常虚弱的患者,如糖尿病㊁营养不良㊁酗酒㊁高龄㊁长期使用激素或其他免疫抑制药物,慢性阻塞性肺疾病(C O P D)㊁结缔组织病㊁放射治疗㊁非结核分枝杆菌(N T M)感染或人类免疫缺陷病毒(H I V)感染者㊂S A I A与C C P A具有相似的临床和影像学特征,但进展相对更快,病程通常在1~3个月㊂S A I A的影像学特点包括空洞㊁结节㊁进展性实变伴有脓肿形成,组织学活检可见菌丝侵及肺组织,微生物学证实为侵袭性曲霉菌感染,血或呼吸道分泌物中曲霉菌半乳甘露聚糖抗原(GM实验)阳性㊂3实验室检查3.1涂片与培养因烟曲霉菌广泛存在于自然界,有其自身的致病特点,痰中检出烟曲霉菌不是诊断曲霉菌感染的依据㊂经支气管镜获得的样本检出烟曲霉感染的概率高于定植㊂痰或支气管镜标本显微镜下发现真菌菌丝强烈提示曲霉菌感染(A I I I)㊂在发表的系列研究中真菌培养的阳性率为56%~81% (A I I)㊂呼吸道样本在真菌特异性培养基培养较在细菌培养基培养的真菌产量更高,诊断敏感性更高㊂多个样本培养可增加变应性支气管肺曲霉菌病(A B P A)患者真菌培养的产量,也可能提高所有肺部真菌病真菌培养的产量㊂高容积培养㊁未稀释的呼吸道样本具有更高的曲霉菌产量㊂在抗真菌治疗期间培养阳性提示唑类药物耐药㊂3.2聚合酶链式反应(P C R)分子生物学方法如P C R检测呼吸道分泌物内真菌比培养更为敏感(C I I)㊂P C R信号强度越强,越提示感染并提示真菌负荷量较高㊂抗真菌治疗过程中检测到强P C R信号提示抗真菌药物耐药,直接检测关键耐药基因突变在技术上已成为可能㊂3.3 GM实验支气管肺泡灌洗液(B A L)中曲霉菌GM实验诊断C P A的敏感度和特异度分别为77.2%和77.0%(截点为0.4),血清中分别为66.7%㊃623㊃‘临床荟萃“2016年3月5日第31卷第3期 C l i n i c a l F o c u s,M a r c h5,2016,V o l31,N o.3Copyright©博看网. All Rights Reserved.和63.5%(截点为0.7)㊂在另一项研究中,B A L中GM抗原检测的敏感度和特异度分别为85.7%和76.3%(截点为>0.5)㊂最近的一项研究中血清GM 实验的敏感度仅为23%㊂因此,应采用B A L(B I I)而不是血清GM(C I I I)诊断C P A㊂3.4抗曲霉菌抗体检测抗曲霉菌抗体是诊断C P A的关键性诊断工具之一㊂抗曲霉抗体可帮助鉴别感染和定植,对感染的阳性预测值为100%㊂目前可采用许多商业化检测,此外还可采用一些机构内部的血清学检测方法,通常通过免疫扩散法及对流免疫电泳法检测曲霉菌沉淀素㊂有3篇文献对比了不同的血清学分析方法检测曲霉菌I g G诊断C P A 的优劣,未能得出明确的结果㊂与其他真菌的交叉反应,如组织胞浆菌㊁球孢子菌可能影响试验结果,但有关研究很少㊂所有怀疑C P A或S A I A者均应检测曲霉菌I g G 抗体或沉淀素(A I I)㊂可存在假阴性结果㊂如临床高度怀疑,特别是哮喘㊁A B P A和囊性纤维化患者,应检测曲霉菌I g E(B I I),也可检测I g G(A I I),同时考虑其他方法获得诊断(痰培养㊁P C R㊁曲霉菌抗原㊁经皮肺活检或针吸活检等)㊂烟曲霉I g G检测对可疑曲霉菌结节的诊断价值尚未阐明㊂偶有C P A患者存在低丙种球蛋白血症等因素而选择性抑制烟曲霉I g G抗体的产生㊂有些C P A患者检出少量肺炎球菌和流感嗜血杆菌功能性抗体㊂一些C P A患者罹患非曲霉菌感染如慢性空洞性肺组织胞浆菌病㊁球孢子菌和赛多孢子菌病,也可检出曲霉菌抗体㊂关于测定烟曲霉I g A或I g M抗体价值的研究数据仍然较少(D I I I)㊂抗体滴度与疾病的严重程度关系不大,虽然非常高的抗体滴度在曲霉菌球更为多见㊂抗体滴度缓慢下降提示治疗成功,但很少下降到不可检测到的范围,除非连续治疗数年㊂抗体滴度急剧上升常常是治疗失败或复发的征象,但在开始更换治疗前应该重复检测,以避免实验室误差㊂4病理组织学检查肺活检能够帮助明确区分S A I A和C C P A,并更好地观察曲霉菌感染后组织的反应(B I I)㊂C C P A在切除的空洞内可发现有隔膜的菌丝,有时将空洞填充或使其闭塞,同时伴有慢性炎症反应,偶尔可见肉芽肿,周围可伴有纤维化或混有炎细胞浸润㊂相反, S A I A组织学表现为菌丝侵入肺实质,伴有急性炎症反应或坏死㊂5影像学诊断5.1常用影像学技术 X线胸片仍然是疑似和确诊C P A患者的首选影像学检查技术㊂如胸片疑诊C P A,建议行胸部C T扫描和血管造影以助诊(A I I)㊂胸部C T扫描可提供更多的数据,更为清晰,可确定病变的部位㊁分布和范围㊂C T血管造影作为治疗前的基础检查是必需的,也对评价新的咯血和可能治疗失败的患者有一定价值(B I I)㊂采用C T平均灰度投影后处理可创建可变厚度从而产生类似于胸片的效果㊂正电子发射断层扫描(P E T)似乎并不适用于C P A的诊断(D I I I)㊂曲霉菌病是除肿瘤转移之外P E T/C T阳性的原因之一,非侵袭性肺曲霉菌病在2 -氟-2-脱氧-D-葡萄糖[2-f l u o r o-2-d e o x y-D-g l u c o s e (F-F D G)]P E T/C T可出现等代谢晕轮征(i s o m e t a b o l i c h a l o p a t t e r n)和等代谢结节征㊂5.2影像学发现 C P A的影像学特征主要包括两个方面:①C P A本身的表现;②与C P A同时存在的相关基础肺疾病的表现㊂C P A可继发于多种基础肺疾病,主要有T B㊁N T M和A B P A,也可见于C O P D㊁气胸㊁肺癌㊁纤维囊性结节病㊁强直性脊柱炎㊁尘肺病和矽肺等㊂C P A最常发生于既往已存在的支气管肺空洞或胸膜腔,也可直接形成并进展为新的空洞或结节,很少形成肺泡实变㊂C P A本身的影像学特征主要包括单发或多发肺曲霉菌球㊁新的和(或)不断进展的洞壁薄厚不一的空洞样病变,常伴有空洞周边肺实质破坏和(或)纤维化,以及明显的胸膜增厚,也可见曲霉菌脓胸㊂支气管或非支气管动脉扩张相对少见,可形成假性动脉瘤,有时可导致致命性咯血㊂如影像学显示空洞㊁真菌球㊁胸膜增厚和(或)上叶间质纤维化中的任何征象,放射科报告必需提及疑似C P A可能(A I I)㊂在形成曲霉菌球之前,一团真菌常沿空洞内表面生长,使空洞内壁凹凸不平,呈现出不规则的独特的外观㊂典型的曲霉菌球开始为表面感染,继之定植在肺或支气管扩张的空洞中㊂曲霉菌球是C P A 的晚期表现,典型的位于上叶,为实性㊁圆形或椭圆形的腔内团块,部分围绕着新月形的空气,称之为空气新月征,可随体位变换而移动,也可表现为固定的㊁不规则的海绵样物质填充于含有空气的空洞内㊂从空腔内表面脱离的真菌团簇,也可形成粗糙的㊁不规则的带有空隙的松散的网络,最终形成成熟的真菌球㊂在真菌球内也可看到钙化,可为斑片样㊁密度㊃723㊃‘临床荟萃“2016年3月5日第31卷第3期 C l i n i c a l F o c u s,M a r c h5,2016,V o l31,N o.3Copyright©博看网. All Rights Reserved.结节或遍布曲霉菌球㊂真菌球在静脉注射造影剂后不被强化㊂常可观察到临近胸膜增厚㊂曲霉菌球可分为 单发性 或 复杂性 ,后者见于C C P A㊂曲霉菌球可与基础疾病同时存在,有些疾病如坏死性肺癌与曲霉菌球有相似的表现,需要鉴别㊂C C P A的典型表现为单侧或双侧实变与多发进展厚壁空洞,可含有一个或多个曲霉菌球,伴有不同程度的胸膜增厚㊂增厚的胸膜常与异常密度的胸膜脂肪有关,某些情况下与邻近的肺泡实变或空洞壁无法区分㊂这些病变往往是非对称性的,主要分布于既往存在的基础肺疾病对应的肺部病变区域㊂随着时间推移的影像学演变通常较S A I A缓慢,可能历经数年也没有明显的进展,如不经治疗,空洞将逐渐增大并融合,曲霉菌球可能消失或再次出现㊂上述影像学表现也可见于活动性T B㊁N I M㊁组织胞浆菌病㊁放线菌病㊁球孢子菌病和肺癌,肺癌常伴有慢性或侵袭性曲霉菌感染,需予以鉴别㊂C F P A是C C P A终末期进展为纤维化的结果㊂纤维化可局限于一个或两个上肺叶,也可累及整个半侧胸腔㊂除了周边可见空洞和真菌球外,C P A相关肺纤维化无显著特征㊂曲霉菌结节在外观上与肿瘤㊁球孢子菌结节㊁N T M㊁放线菌病以及类风湿结节非常相似㊂大多数结节为圆形㊁中心可有密度减低区或空洞,有些边缘有毛刺㊂结节可为单发也可为多发㊂曲霉菌结节可大可小,但偶可见大的团块样病变,常常具有空洞㊂S A I A病变进展较快,既往肺部可没有空洞样病变,起病最初常常表现为上叶单发实变,经数天或数周逐渐进展为空洞,典型的为薄壁空洞,经1~3个月逐渐扩大㊂同时可伴有胸膜增厚㊁曲霉菌球㊁气胸和胸腔积液㊂可见空气新月征,可能是发展为坏死的征象,因此常提示疾病的恶化㊂C P A典型的3种形式:C C P A㊁C F P A㊁S A I A之间可重叠存在,且随着时间的演变,一种形式可转化为另一种形式㊂没有病理学证据和(或)进一步的深入随访追踪,有时区分C C P A和S A I A也很困难,甚至不能区分㊂6诊断C P A的诊断需同时满足以下条件:①胸部影像学的特征性表现;②曲霉菌感染的直接证据或针对曲霉菌的免疫反应阳性;③除外其他疾病,此外,病程至少3个月㊂除少数患者外,通常不存在因H I V 感染㊁肿瘤化疗或免疫抑制剂治疗所导致的免疫功能低下㊂如观察到曲霉菌球,只需曲霉菌I g G或沉淀素阳性,>90%的患者即可确诊曲霉菌感染㊂如果抗体检测阴性,则需其他曲霉菌感染的证据㊂如患者影像学显示1个或多个空洞,且排除其他疾病,则符合以下任何一条可确诊本病:①呼吸道引流液中曲霉菌I g G或沉淀素阳性㊁曲霉菌抗原强阳性或D N A阳性;②经皮或切除活检在空洞内发现真菌菌丝或培养出曲霉菌㊂如镜下显示真菌菌丝侵入肺实质,则诊断为急性或亚急性侵袭性肺曲霉菌病㊂因其他多种情况下也可在呼吸道中检出曲霉菌,仅呼吸道样本中发现曲霉菌菌丝和(或)培养出曲霉菌和(或)曲霉菌P C R阳性不能确诊C P A㊂S A I A的诊断:免疫功能低下或高度衰竭的患者符合侵袭性肺曲霉菌病诊断标准,较急性侵袭性曲霉菌感染的进展更为缓慢,病程为1~3个月,血清中曲霉菌抗原和抗体常为阳性,组织学证实真菌菌丝侵入肺实质㊂7鉴别诊断7.1结核分枝杆菌感染 T B和N TM可在C P A 之前㊁之后或同时与C P A共存㊂肺标本涂片㊁结核分枝杆菌核酸扩增和培养是鉴别C P A的重要手段㊂确诊结核分枝杆菌感染不能除外同时存在C P A㊂7.2细菌感染持续存在的肺部空洞也可能见于细菌如肺炎链球菌㊁流感嗜血杆菌㊁金黄色葡萄球菌㊁铜绿假单胞菌㊁厌氧菌感染㊂确诊细菌感染不能除外同时存在C P A㊂7.3其他真菌感染有3种真菌感染在临床表现上与C P A相似,包括慢性空洞性肺组织胞浆菌感染㊁副球孢子菌病㊁球孢子菌病㊂抗原/抗体检测和呼吸道分泌物培养通常有益于鉴别诊断㊂7.4非感染性肺部疾病包括坏死性肺癌㊁肺梗死㊁血管炎和类风湿结节等㊂8治疗8.1口服三唑类药物除了口服治疗的两项前瞻性Ⅱ期临床试验,关于C P A治疗的多数数据基于队列研究或病例报告㊂一项随机对照试验对比了两种静脉注射抗真菌制剂,另一项为口服唑类药物与非抗真菌治疗的对照㊂多数队列研究没有明确区分C P A的不同亚型㊂没有研究直接对比两种口服唑类药物的临床效果㊂药物的有效性分析依赖于临床复合得分,包括临床表现㊁影像学和微生物学反应,这可能在不同的研究中有所不同㊂药物的安全性分析㊃823㊃‘临床荟萃“2016年3月5日第31卷第3期 C l i n i c a l F o c u s,M a r c h5,2016,V o l31,N o.3Copyright©博看网. All Rights Reserved.除了需要临床不良事件评估外,还需要血药浓度监测,这在已发表的研究中没有充分描述或未进行研究㊂这些缺陷都可影响到本指南的建议㊂是否采用口服唑类药物治疗C P A取决于患者所患疾病的种类㊁临床表型和有无外科手术的适应症㊂一般建议有些进展和(或)有症状的C P A患者门诊口服唑类药物治疗可能有效㊂生活质量评估,如圣乔治评分或呼吸症状评分可指导治疗决策㊂口服伊曲康唑可预防或治疗危及生命的大咯血(A I I)㊂对临床和影像学稳定的C C P A患者,口服伊曲康唑优于保守治疗,治疗风险较低,耐受性较好㊂目前认为口服唑类药物是治疗C C P A的标准治疗㊂口服伏立康唑作为初始治疗(A I I)或用于伊曲康唑治疗失败或不耐受的C C P A也有效且耐受性好(A I I)㊂一项回顾性队列研究表明口服泊沙康唑可能是另一种有效的药物(B I I)㊂C F P A一般是未经治疗的C C P A的终末表现,与继发形成广泛肺纤维化有关㊂伊曲康唑长期治疗可能稳定患者的一般情况,对呼吸困难的改善有限㊂S A I A的治疗等同于急性侵袭性肺曲霉病(A I P A)的治疗㊂有队列研究表明一些S A I A患者长期口服伊曲康唑有效㊂一项前瞻性多中心研究证实了一项初步研究的结果,表明伏立康唑治疗S A I A 的疗效明显优于其治疗C C P A的疗效㊂常用口服治疗C P A抗真菌药物包括:伊曲康唑200m g,每日2次,根据药物监测调整剂量(A I I);伏立康唑150~200m g,每日两次,根据药物监测调整剂量(A I I),建议年龄>70岁者减量,低体质量㊁严重肝病和东北亚血统的人药物代谢减慢㊂泊沙康唑400m g(口服悬液剂),每日两次;300m g,每日1次(片剂)(B I I)㊂C P A患者抗真菌治疗的目的在于控制感染㊁阻止肺纤维化的进行性发展,预防咯血㊁改善生活质量㊂最优化的C P A治疗疗程尚未确定㊂C C P A对抗真菌治疗的反应通常较为缓慢,多数患者到治疗6个月时才会有疗效反应,因此,最初建议口服唑类药物治疗至少4~6个月(A I),本指南建议C P A抗真菌治疗疗程6个月(B I I)㊂在治疗期间病情恶化的患者应被视为治疗失败,应更换为其他治疗方案㊂对治疗反应轻微者应将疗程延长至9个月,这时几乎所有患者都会出现治疗反应(C I I I)㊂如患者治疗有效,应继续治疗,这可能是无限期的长期抑制性治疗,以获得更好的预后(B I I)㊂疾病稳定者可能不能从长期治疗中获益,但每1例患者都必须根据其具体情况权衡利弊,要全面考虑呼吸障碍㊁患者对药物的耐受性㊁抗真菌药与其他药物之间的相互作用和治疗成本等多种因素㊂停止治疗后,疾病反复是常见的,但不是普遍存在的㊂S A I A/C N P A治疗的目的为治愈,推荐的疗程为6个月(B I I),对持续性免疫抑制的患者需要延长治疗时间㊂8.2静脉注射药物静脉注射抗真菌药物治疗C P A可用于疾病进展和治疗失败㊁对唑类药物不耐受或耐药的患者㊂此外,一些研究提出了诱导期静脉注射继之给予口服维持治疗的抗真菌治疗策略㊂两性霉素B或棘白菌素仅有静脉注射剂型,可用于唑类药物的替代治疗㊂C P A患者短期(2~4周)静脉注射米卡芬净与静脉注射伏立康唑等效(有效率分别为60%和53%),安全性明显提高㊂一项小规模双盲随机对照试验表明卡泊芬净与米卡芬净在改善C P A亚组的健康状态方面等效㊂在周期性静脉注射卡泊芬净治疗期间,联合口服唑类药物维持治疗,已用于复杂性结节病相关的C P A的治疗㊂C P A最初接受唑类药物治疗后给予短期静脉注射两性霉素B脂质体(3m g㊃k g-1㊃d-1,17天)临床有效率为65%,急性肾损伤的发生率为32%㊂静脉注射两性霉素B脱氧胆酸对C P A患者的疗效有限甚至无效㊂8.3 C P A空洞的局部治疗如果不能选择手术切除控制反复发生的咯血,对没有出血倾向的患者可考虑空洞内灌注抗真菌药物治疗曲霉菌(C I I)㊂几项研究报告了当全身应用抗真菌药物治疗无效或由于不良反应不能耐受时,通过空洞内灌注抗真菌药物处理真菌球㊂抗真菌药物的灌注可通过气管内插管在纤维支气管镜的引导下,或通过经皮经胸壁穿刺或导管置入含曲霉菌球的空洞内来实现㊂一般情况下,经皮空洞内置入导管可避免反复纤维支气管镜操作并缩短了治疗时间㊂用于灌注的药物包括两性霉素B㊁唑类药物(咪康唑㊁伊曲康唑)㊁碘化钠和制霉菌素㊂报道的短期有效率在70%~100%㊂两性霉素B是可选药物(50m g溶于20m l5%葡萄糖溶液中)(C I I),注入量取决于空洞的容积㊂需要避免药物直接漏入支气管树㊂并发症包括咳嗽㊁胸痛㊁气胸或支气管内反流㊂如治疗成功,患者咯血停止㊁疼痛缓解㊁痰培养曲霉菌转阴㊁曲霉菌抗体滴度下降㊁偶尔曲霉菌球缩㊃923㊃‘临床荟萃“2016年3月5日第31卷第3期 C l i n i c a l F o c u s,M a r c h5,2016,V o l31,N o.3Copyright©博看网. All Rights Reserved.小甚至消失㊂8.4糖皮质激素治疗和C P A 吸入或全身应用糖皮质激素是C P A的主要危险因素之一,没有足够的抗真菌治疗,糖皮质激素可促进病变进展或播散㊂患者如果有基础疾病如结节病㊁类风湿关节炎㊁C O P D㊁A B P A或哮喘,可能依赖于包括糖皮质激素的免疫抑制治疗㊂在给予充分的抗真菌治疗的前提下,根据病情需要,可考虑应用强的松5~30m g/d 或其他免疫抑制剂来控制症状(B I I)㊂8.5γ-干扰素(I F N-γ)免疫治疗 C P A通常存在许多微妙的免疫缺陷,但I F N-γ缺陷是唯一能够替代治疗的㊂有研究表明C P A患者存在I F N-γ和白细胞介素(I L)-12产生缺陷,但在体外实验中以不同的刺激剂刺激全血来考察I L-12和I F N-γ依赖通路显示反应正常㊂有研究观察到2例C P A患者尽管给予了足够的抗真菌治疗仍然存在I F N-γ介导的免疫受损,辅助性I F N-γ治疗(50~60μg皮下注射,每周3次)可改善患者的病情㊂另一项观察性研究报道了3例患者接受辅助性I F N-γ治疗后病情稳定或改善㊂因为文献报道的病例数有限,缺乏对照研究,本指南未对I F N-γ免疫治疗C P A提出建议㊂8.6 C P A咯血的治疗 C C P A和单发曲霉菌球可能合并轻度(最为常见)㊁中度或威胁生命的咯血㊂轻度和中度咯血通常氨甲环酸治疗有效(500m g,每日3次)(A I I I)㊂氨甲环酸可抑制纤溶,阻止血块溶解,促进血栓形成㊂应用氨甲环酸时有些患者可发生中风,但发生率较低,有时患者不能耐受,最常见的问题是胃肠道不适㊂对中重度咯血的患者,无论是作为外科手术前的临时性措施,还是作为治疗手段,均有必要行栓塞术㊂C P A患者的出血通常来自于接近病变部位的异常的体循环小血管和新生的血管连接㊂血管通常来自于支气管循环,但也可来源于其他动脉,如肋间㊁锁骨下㊁或乳内动脉㊂存在多个异常连接是很常见的㊂成功的栓塞可半永久性地闭塞这些血管㊂肋间和脊髓前动脉之间存在交通支,只能在保证导管安全地绕过脊髓前动脉时方可进行栓塞㊂支气管动脉栓塞难度较大,需要技术娴熟的介入放射科医师操作㊂栓塞术的成功率为50%~ 90%,部分取决于放射科医师的操作㊂3年内约30%~50%的患者咯血复发,但成功的长期抗真菌治疗可降低复发率㊂并发症包括胸壁疼痛㊁皮质盲或视力障碍㊁胸壁或脊髓梗死㊁肾功能损害和对造影剂的过敏反应㊂如果正在接受静脉注射两性霉素B 治疗,支气管动脉栓塞术后24~48小时应减量,以避免增加肾毒性㊂8.7外科手术治疗外科手术切除曲霉菌球是对肺功能足够好的患者的最终治疗选择(A I I)㊂操作成功与否取决于曲霉菌球切除是否彻底,真菌菌体成分是否漏入到胸膜腔㊂因此,单发曲霉菌球疾病和咯血很少反复,而C C P A的成功率较低㊂严重咯血患者都应考虑外科手术治疗㊂手术前支气管动脉导管栓塞可能抢救严重咯血患者的生命(B I I)㊂但栓塞术很少能完全有效地控制严重咯血,因此通常只做为最终手术治疗的前期工作㊂在择期手术前,认真评估患者是否能耐受手术非常重要,如患者身体虚弱,不能耐受手术,可导致更高的病死率和术前㊁术后并发症,在这方面特别强调注意心肺功能㊂手术前营养不良的患者应补充营养,改善营养状况,如果口服补充不够,可应用鼻饲或经皮内镜下胃造瘘术灌食㊂对由于手术风险高而不能手术者,可考虑经支气管镜下切除曲霉菌球(B I I I)㊂由于曲霉菌球切除术的并发症包括持续性肺漏气㊁持续性气胸㊁脓胸㊁肺炎㊁伤口感染㊁支气管胸膜瘘㊁呼吸衰竭㊁大出血和死亡㊂C C P A术前或术后发生并发症和死亡风险明显高于单发曲霉菌球患者㊂疾病的类型也影响着长期预后㊂单发曲霉菌球的10年生存率介于69%~90%,而C C P A发病率和病死率更高,10年生存率为63%~80%㊂有了更好的外科技术,近年来,治疗效果有所改善㊂操作术式包括肺大疱切除术,肺段切除术㊁亚肺叶切除术㊁楔形切除术㊁肺叶切除术㊁胸膜切除术㊁肺切除术㊂电视胸腔镜手术(V A T S)可减少并发症㊁减少住院时间,已被建议作为外科开胸切除单发曲霉菌球和多发空洞病变的一种替代方法(B I I)㊂未预测到的围手术期事件可能需要中转开胸,包括出血㊁致密纤维粘连㊁叶间裂融合㊁肺门淋巴结肿大㊂有些患者病变较为广泛,可能需要胸廓成形术同时空洞造口术和肌皮瓣转位术(C I I I)㊂当病灶不能被完全手术切除时,抗真菌治疗可用于防止曲霉脓胸或避免疾病复发㊂目前尚没有证据支持外科手术切除单发曲霉菌球后辅助性唑类抗真菌治疗㊂手术切除单发曲霉菌球无真菌菌体物质渗漏的无需辅助性抗真菌治疗(D I I)㊂如果因为外科手术操作复杂而可能存在真菌菌体物质渗漏,在手术前数周可给予抗真菌药物(A I I I)㊂在手术中可进㊃033㊃‘临床荟萃“2016年3月5日第31卷第3期 C l i n i c a l F o c u s,M a r c h5,2016,V o l31,N o.3Copyright©博看网. 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传染病防治：肺曲霉病肺曲霉病(aspergillosis)是由各种曲霉所引起的肺部病变。

好发于免疫功能低下者，以侵袭性病变为主，可出现侵袭性肺曲霉病(急性或亚急性)、慢性肺曲霉病。

重度免疫功能低下如骨髓或器官移植、高强度化疗等患者，常引起严重的侵袭性肺曲霉病，病死率高达63%〜92%,但该病的早期诊断和积极治疗可明显提高患者的生存率。

(一)病原学曲霉属是一种腐生丝状真菌，广泛存在于自然环境中，易在土壤、水、食物、植物和空气中生存。

仅有无性期的曲霉属半知菌亚门、丝抱菌纲、丝匏菌目、丛梗抱科。

存在有性期的曲霉属子囊菌亚门，不整子囊菌纲、散囊菌目、散囊菌科。

目前已知曲霉属有300余种，其中致病性曲霉至少有20余种，临床菌株主要为烟曲霉(Afumigatus)、土曲霉(A.terreus)、黄曲霉(A.fIavus)、构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)等。

曲霉特征性结构为分生抱子头和足细胞，前者包括分生抱梗茎、顶囊、瓶梗、梗基和分生抱子,后者为转化的厚壁、膨化菌丝细胞。

分生抱子可大量释放到空气中，抱子直径为2〜10μm,容易悬浮在空气中并存活很长时间。

曲霉最适生长温度为25。

C〜3（TC,而致病性曲霉能在35。

C〜37。

C生长，烟曲霉耐热性更高，在40。

C〜50。

C也能生长，多数致病性曲霉繁殖力强，培养仅需36〜48小时，少数菌种则需数日或数周。

在培养基中均形成丝状菌落，菌落和分生抱子的形态、颜色，以及有性抱子的形态各不相同，常以此进行菌种的鉴定。

曲霉在组织内常见为无色分隔的菌丝，典型者呈45。

分枝，菌丝分隔有助于与接合菌相鉴别。

曲霉感染以烟曲霉最为常见，可引起各种类型的曲霉病。

通常，侵袭性肺曲霉病主要为烟曲霉、黄曲霉等。

曲霉球常由烟曲霉、黑曲霉等所致。

土曲霉偶可引起脑曲霉病。

变应性曲霉病的病原菌包括烟曲霉、黄曲霉、赭曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、土曲霉和棒状曲霉等。

黑曲霉以定植方式更为多见。

㊃病例报告㊃烟曲霉感染性心内膜炎1例周宸1卢家桀2(1.四川大学华西医院华西临床医学院,成都610041;2.四川大学华西医院感染性疾病中心,成都610041)ʌ摘要ɔ烟曲霉感染性心内膜炎诊断难㊁致死率高㊁预后差㊂报道1例烟曲霉感染性心内膜炎患者经宏基因组下一代测序(m e t a g e n o m i c s n e x t-g e n e r a t i o n s e q u e n c i n g,m N G S)检出烟曲霉,接受伏立康唑治疗并通过监测其血药浓度(t h e r a p e u t i c d r u g m o n i t o r i n g,T D M)以确保临床疗效和安全性㊂经过药物联合手术治疗,患者好转出院㊂因此m N G S在曲霉感染导致的心内膜炎的诊断中有重要的意义㊂在治疗方面,通过T D M调整伏立康唑的用量,既能保证疗效,又减少了药物不良反应的发生,为烟曲霉感染性心内膜炎的内科治疗提供了一种安全有效的诊疗选择㊂ʌ关键词ɔ烟曲霉;感染性心内膜炎;伏立康唑;血药浓度监测ʌ中图分类号ɔ R519.8 R542.4+1ʌ文献标志码ɔ A ʌ文章编号ɔ1673-3827(2022)17-0486-04A c a s e o f A s p e r g i l l u s f u m i g a t u s e n d o c a r d i t i sZ HO U C h e n,L U J i a j i e(1.W e s t C h i n a S c h o o l o f M e d i c i n e,W e s t C h i n a H o s p i t a l,S i c h u a n U n i v e r s i t y,C h e n g d u610041,C h i n a;2.C e n t e r o f I n-f e c t i o u s D i s e a s e s,W e s t C h i n a H o s p i t a l,S i c h u a n U n i v e r s i t y,C h e ng d u610041,Chi n a)ʌA b s t r a c tɔA s p e r g i l l u s f u m i g a t u s i n f e c t i v e e n d o c a r d i t i s w a s c h a r a c t e r i z e d a s d i f f i c u l t i n d i a g n o s i s a n d w i t h h i g h m o r t a l i t y a n d p o o r p r o g n o s i s.W e r e p o r t e d a c a s e o f i n f e c t i v e e n d o c a r d i t i s,i d e n t i f i e d b y n e x t-g e n e r a t i o n m e t a g e n o m i c s e q u e n c i n g (m N G S)a s A s p e r g i l l u s f u m i g a t u s.T h e p a t i e n t w a s t r e a t e d w i t h v o r i c o n a z o l e a n d t h e r a p e u t i c d r u g m o n i t o r i n g(T D M)w a s p e r f o r m e d t o e n s u r e e f f i c a c y a n d s a f e t y.B e i n g c o n b i n e d w i t h s u r g i c a l t r e a t m e n t,t h e p a t i e n t g o t b e t t e r a n d w a s d i s c h a r g e d. T h e r e f o r e,m N G S p l a y e d a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e d i a g n o s i s o f e n d o c a r d i t i s c a u s e d b y A s p e r g i l l u s i n f e c t i o n.A d j u s t i n g t h e d o s e o f v o r i c o n a z o l e b y T D M c a n n o t o n l y e n s u r e t h e c u r a t i v e e f f e c t,b u t a l s o r e d u c e t h e o c c u r r e n c e o f a d v e r s e r e a c t i o n s,p r o-v i d i n g a s a f e a n d e f f e c t i v e t r e a t m e n t c h o i c e o f A s p e r g i l l u s f u m i g a t u s i n f e c t i v e e n d o c a r d i t i s.ʌK e y w o r d sɔA s p e r g i l l u s f u m i g a t u m;i n f e c t i v e e n d o c a r d i t i s;v o r i c o n a z o l e;t h e r a p e u t i c d r u g m o n i t o r i n g(T D M)[C h i n J M y c o l,2022,17(6):486-489]烟曲霉感染性心内膜炎是真菌感染性心内膜炎的一种,具有发病率低㊁诊断难㊁致死率高㊁预后差㊁易复发的特点[1-2]㊂伏立康唑是烟曲霉感染性心内膜炎治疗中至关重要的药物,而伏立康唑的血药浓度在个体之间差异较大,因此伏立康唑个体化治疗至关重要㊂本文报道1例基于伏立康唑血药浓度检测的烟曲霉感染性心内膜炎患者个体化诊治过程,对临床诊断及治疗提供思路㊂作者简介:周宸,女(汉族),博士研究生在读.E-m a i l: z h o u c h e n961121@163.c o m通信作者:卢家桀,E-m a i l:10955415@q q.c o m 1临床资料患者,男,41岁,因 视物模糊㊁头晕1个月余,反复发热20d,加重伴意识不清4天 于2020年10月10日入院㊂入院前1个多月,患者打篮球时突然出现视物模糊,伴头晕,3d后症状加重,表现为词不达意,伴头痛,不伴恶心呕吐,于我院诊断为 脑梗塞,二尖瓣狭窄伴赘生物㊁二尖瓣穿孔 ,急诊行脑血管造影+血管内取栓术,并择期于全麻体外循环下行二尖瓣成形术,术后转入当地医院继续治疗㊂入院前20d,患者出现发热,最高体温39.2ħ,先后予哌拉西林他唑巴坦㊁美罗培南及万古霉素抗感染,但患者仍反复发热㊂入院前4d,患㊃684㊃中国真菌学杂志2022年12月第17卷第6期 C h i n J M y c o l,D e c e m b e r2022,V o l17,N o.6Copyright©博看网. All Rights Reserved.者出现烦躁㊁言语不清及大便失禁,血压波动于80/50mmH g 左右,无胸痛㊁气促,无恶心呕吐㊁腹痛㊁腹泻及黑便,为进一步诊治入我院㊂入院查体:体温38.1ħ,心率64次/分,呼吸21次/分,血压108/78mmH g,昏睡状态,表情淡漠,双侧瞳孔等大等圆,直径约5mm ,对光反射迟钝㊂双肺叩诊呈清音,听诊呼吸音清,仅闻及少量湿啰音㊂心界正常,心律齐,心尖区闻及收缩期杂音㊂辅助检查:超声心动图:二尖瓣成形术后,二尖瓣增厚,后瓣赘生物形成,反流(重度),三尖瓣反流(轻度),对比术后超声心动图可见二尖瓣赘生物为术后新生(见图1)㊂血常规:白细胞9.79ˑ109/L ,中性分叶核粒细胞百分率81.4%;C -反应蛋白91.20m g /L ,白细胞介素663.60p g/m L ,降钙素原0.14n g/m L ;GM 试验:4.38GM I (GM I n d e x 参考值:<0.5),G 试验:599.11p g /m L (参考值:<70p g /m L 阴性;70~95p g/m L 需连续监测;>95p g /m L 阳性);尿钠素2334n g/L ;肝功能:丙氨酸氨基转移酶(A L T )222I U /L ,门冬氨酸氨基转移酶(A S T )108I U /L ,γ-谷氨酰转移酶(G a m -m a -g l u t a m yl t r a n s f e r a s e ,G G T )132I U /L ,碱性磷酸酶(a l k a l i n e p h o s ph a t a s e ,A L P )156I U /L ;凝血酶原时间18.9s ㊂患者入院诊断如下:①脓毒症;②感染性心内膜炎;③二尖瓣脱垂伴重度反流及后瓣穿孔;④二尖瓣成形术后;⑤脑梗塞;⑥蛛网膜下腔出血;⑦双眼T e r s o n 综合征;⑧右侧大脑中动脉M 1段急性栓塞血管内取栓术后再通;⑨肺部感染;⑩肝功能异常; 低蛋白血症㊂入院后予伏立康唑联合美罗培南经验性抗感染治疗,首日予伏立康唑负荷剂量300m g/12h 静滴,1d 后调整为200m g/12h 静滴㊂入院第2天行首次宏基因组下一代测序(m e t a ge n o m i c s n e x t -g e n e r a t i o n s e q u e n c i n g,m N G S ),提示检出烟曲霉(序列数:79)(见表1),临床诊断: 脓毒症(烟曲图1 入院后超声心动图提示二尖瓣增厚伴瓣赘生物形成F i g.1 E c h o c a r d i o g r a p h y a t a d m i s s i o n s h o w i n g t h i c k e n e d m i t r a l v a l v e w i t h v e ge t a t i o nf o r m a t i o n 表1 住院期间患者m N G S 检测结果T a b .1 R e s u l t s o f m N G S d u r i n g h o s pi t a l i z a t i o n 住院时间/d属名种名特异性序列数鉴定置信度2曲霉属烟曲霉7999%18曲霉属烟曲霉399%39未检测到真菌霉);感染性心内膜炎:烟曲霉?㊂遂根据中外指南[1-2],继续予伏立康唑200m g/12h 静滴㊂经治疗后患者体温高峰逐渐降低,于入院后第6天体温恢复正常,且神志清楚,视力较入院时有所恢复㊂入院第12天复查伏立康唑血药浓度,谷浓度降至1μg/m L 以下㊂排除剂量错误㊁吸收问题㊁相互作用后调整剂量为300m g/12h 静滴,按此剂量使用28d,期间监测伏立康唑血药浓度,大多在参考范围(1.5~5.5μg/m L )内㊂在此期间,患者症状明显缓解,且于入院第18天复查m N G S ,检出烟曲霉(序列数:3),提示伏立康唑治疗有效㊂入院第40天复查伏立康唑血药浓度升至6.680μg /m L ,将方案调整为200m g/12h 静滴㊂入院后第39天,第三次复查m N G S 示未在外周血中检测出烟曲霉序列,有手术指征,故患者转至心脏外科行 二尖瓣置换术 ㊂手术顺利,术后未见明显感染征象,术后14天病情稳定,故转回感染科继续原方案抗真菌治疗㊂入院第59天复查伏立康唑血药浓度降至0.501μg/m L ,经评估后再次将伏立康唑调整为300m g/12h 静滴,连续使用9d 后出院,出院后继续伏立康唑300m g/次,2次/日口服㊂住院期间伏立康唑血药浓度变化见表2㊂伏立康唑治疗期间,患者没有出现明显的胃肠道及神经系统不良反应,入院时的肝功能异常经保肝降酶治疗后肝功能逐渐好转㊂出院后随访1年,患者除视力未进一步恢复外,余未诉不适,伏立康唑血药浓度在正常范围内,复查炎性指标无异常,超声心动图提示人工机械瓣功能未见明显异常(见图2)㊂表2 住院期间伏立康唑用药及血药浓度监测情况T a b .2 A d j u s t m e n t a n d t h e r a p e u t i c d r u g m o n i t o r i n g of v o r i c o n -a z o l e d u r i ngh o s pi t a l i z a t i o n 住院时间/d伏立康唑用药剂量伏立康唑血药浓度/m g㊃L -10300m g/12h 静脉滴注a/712200m g/12h 静脉滴注b1.7700.590㊃784㊃ 中国真菌学杂志2022年12月第17卷第6期 C h i n J M yc o l ,D e c e m b e r 2022,V o l 17,N o .6 Copyright ©博看网. All Rights Reserved.(续表)住院时间/d伏立康唑用药剂量伏立康唑血药浓度/m g㊃L -1172023303440300m g/12h 静脉滴注c0.6041.7702.1302.2500.9646.6804659200m g/12h 静脉滴注d0.4970.5016568300m g/12h 静脉滴注e1.3702.811注:a .首日负荷剂量;b .用药时间为住院2~16d ;c .用药时间为住院17~45d ;d .用药时间为住院46~59d ;e .用药时间为住院60~69d㊂图2 二尖瓣置换术后超声心动图提示二尖瓣机械瓣未见异常,赘生物消失F i g.2 E c h o c a r d i o g r a p h y a f t e r m i t r a l v a l v e r e p l a c e m e n t s h o w i n g m e c h a n i c a l v a l v e w i t h g o o d f u n c t i o n a n d t h e v e g e t a t i o n d i s a p pe a r e d 2 讨 论真菌感染性心内膜炎发病率很低(1%~6%),大多在人工瓣膜植入术后发生,以念珠菌属为主要病原菌,烟曲霉感染性心内膜炎相对少见[1-2]㊂真菌心内膜炎有治疗疗程长㊁预后差的特点,其死亡率可高达30%~50%,且容易复发[1-2]㊂然而,曲霉感染性心内膜炎患者的血培养阳性率极低,研究表明大多曲霉感染性心内膜炎主要依靠术后大体标本病理确诊[3]㊂由于目前病原体有多样化的趋势,传统微生物检验,包括微生物形态学㊁病原体培养㊁抗原抗体及靶向核酸检测等方法在辅助确诊未知病原微生物上存在局限[4-6],而m N G S 技术可以在一定程度上弥补这些局限㊂m N G S 技术通过对样本中所有核酸进行无偏性测序,同时基于庞大的病原微生物数据库,利用算法对样本中含有的疑似病原微生物序列进行检测,使得其逐渐成为辅助临床病原微生物确诊的重要手段㊂本病例感染性心内膜炎诊断明确,但缺乏直接病原学依据㊂基于真菌G ㊁GM 试验结果及抗细菌治疗无效㊁伏立康唑治疗有效,结合首次血液m N G S 结果,故考虑病原菌为 烟曲霉 ㊂此外,在后续的治疗过程中,m N G S 显示患者烟曲霉菌序列逐渐减少,从病原学方面证实了伏立康唑的疗效㊂因此,m N G S 在病原学诊断和疗效评估方面均具有较重要的临床价值㊂根据指南,真菌感染性心内膜炎的诊断较困难,确诊前应进行经验性用药㊂伏立康唑可以抑制真菌麦角甾醇的生物合成,通过破坏细胞膜从而达到抗真菌效果,是治疗烟曲霉感染性心内膜炎的首选药物,建议治疗疗程为至少4周[1,7]㊂也有建议棘白菌素或者两性霉素B 脂质体作为烟曲霉感染性心内膜炎的辅助治疗药物[2]㊂在本次报道的病例中,该患者有明确的 二尖瓣成形术 手术史,且术后反复高热,在外院经验性先后使用予哌拉西林他唑巴坦㊁美罗培南及万古霉素抗感染后效果不明显,初步怀疑不是单纯的细菌感染,不排除其他病原菌感染的可能性㊂入院后真菌G 及GM 试验阳性,考虑真菌感染可能性大,故经验性使用伏立康唑联合美罗培南抗感染治疗,并积极寻找病因㊂经外周血N G S 结果显示烟曲霉感染,故单用伏立康唑抗感染治疗,并于患者病情稳定后行外科治疗㊂经伏立康唑治疗后,患者发热等症状好转,从而临床诊断烟曲霉感染性心内膜炎㊂伏立康唑的非线性药代动力学特点导致其血药浓度在个体之间有较大差异㊂相应的,影响伏立康唑血药浓度的因素主要与人体代谢能力相关,其中患者年龄㊁B M I ㊁肝功能㊁饮食㊁药物相互作用及C Y P 2C 19基因多态性等均是影响血药浓度的重要因素㊂基于伏立康唑的药代动力学特点,临床通常需要监测血药浓度(t h e r a p e u t i c d r u g m o n i t o r i n g,T D M )以提高其临床疗效和安全性[11-12]㊂本病例肝功能异常㊁病程较长㊁抗真菌治疗时机较晚,有严重的脓毒血症,为使伏立康唑既能达到有效的血药浓度以保证疗效,又能尽可能减弱因血药浓度过高所致的药品不良反应,在用药期间对该病例进行了伏立康唑血药浓度监测并根据结果调整治疗方案㊂根据指南[9]推荐,我们予患者伏立康唑300m g/12h 为负荷剂量,再以200m g/12h 维持治疗㊂治疗期间T D M 目标为将伏立康唑的稳态谷浓度控制在1.5~5.5μg/m L ㊂根据中国药理学会制定的㊃884㊃ 中国真菌学杂志2022年12月第17卷第6期 C h i n J M yc o l ,D e c e m b e r 2022,V o l 17,N o .6 Copyright ©博看网. All Rights Reserved.‘伏立康唑个体化用药指南“[13]对伏立康唑T D M 的推荐,血药浓度低于阈值,复测后仍低于目标值,再将剂量提高50%㊂在该病例治疗过程中,根据T D M结果调整伏立康唑剂量过程中,患者没有出现药物不良反应,且抗真菌效果显著,查血检测相关生化指标趋于正常,提示在伏立康唑用药期间, T D M在用药过程中的监测和辅助用药作用是不可或缺的㊂曲霉感染导致的心内膜炎发病率虽低,但病死率高,病情重㊁诊断困难以及药物用量的控制是本病治疗的难点㊂在本病例的诊疗过程中,我们通过m N G S技术明确了病原菌,并通过T D M调整伏立康唑的用量,既保证了患者的治疗效果,又减少了药物不良反应的发生,为烟曲霉感染性心内膜炎的内科治疗提供了一种安全有效的诊疗选择㊂参考文献[1]中华医学会心血管病学分会,中华心血管病杂志编辑委员会.成人感染性心内膜炎预防㊁诊断和治疗专家共识[J].中华心血管病杂志,2014,42(10):806-816.[2]N A K A T A N I S,O HA R A T,A S H I H A R A K,e t a l.J C S2017g u i d e l i n e o n p r e v e n t i o n a n d t r e a t m e n t o f i n f e c t i v e e n d o-c a rd i t i s[J].C i r c J,2019,83(8):1767-1809.[3]R I V IÈR E S,L O R T HO L A R Y O,M I C HO N J,e t a l.A s-p e r g i l l u s e n d o c a r d i t i s i n t h e e r a o f n e w a n t i f u n g a l s:m a j o rr o l e f o r a n t i g e n d e t e c t i o n[J].J I n f e c t,2013,67(1):85-88.[4]S C H L A B E R G R,C H I U C Y,M I L L E R S,e t a l.V a l i d a t i o no f m e t a g e n o m i c n e x t-g e n e r a t i o n s e q u e n c i n g t e s t s f o r u n i v e r-s a l p a t h o g e n d e t e c t i o n[J].A r c h P a t h o l L a b M e d,2017,141(6):776-786.[5]G R E N I N G E R A L.T h e c h a l l e n g e o f d i a g n o s t i c m e t a g e n o m-i c s[J].E x p e r t R e v M o l D i a g n,2018,18(7):605-615.[6]中华医学会检验医学分会.高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识[J].中华检验医学杂志,2020,43(12):1181-1195.[7]P A P P A S P G,K A U F F MA N C A,A N D E S D R,e t a l.C l i n i c a l p r a c t i c e g u i d e l i n e f o r t h e m a n a g e m e n t o f c a n d i d i a s i s:2016u p d a t e b y t h e i n f e c t i o u s d i s e a s e s s o c i e t y o f A m e r i c a[J].C l i n I n f e c t D i s,2016,62(4):e1-50.[8]Z O N I O S D,Y AMA Z A K I H,MU R A Y AMA N,e t a l.V o r i c o n a z o l e m e t a b o l i s m,t o x i c i t y,a n d t h e e f f e c t o f c y t o-c h r o m e p4502c19g e n o t y p e[J].J I n f e c t D i s,2014,209(12):1941-1948.[9]MO R I Y AMA B,O B E N G A O,B A R B A R I N O J,e t a l.C l i n i c a l p h a r m a c o g e n e t i c s i m p l e m e n t a t i o n c o n s o r t i u m(C P I C)g u i d e l i n e s f o r C Y P2C19a n d v o r i c o n a z o l e t h e r a p y[J].C l i n P h a r m a c o l T h e r,2017,102(1):45-51. 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Diagnostic value of serum Aspergillus fumigatus IgG,serum G test and serum galactomannan in chronic pulmonary aspergillosisLI Tianyi,TANG Chunmei,P AN Yuwen,XIAO Haihao,SU WenjieThe Third District of Internal Medicine,Guangzhou Chest Hospital,Guangzhou 510095,China摘要：目的探讨血清烟曲霉IgG 、真菌（1-3）-β-D 葡聚糖（血清G 试验）及血清半乳甘露聚糖（GM ）检测对慢性肺曲霉病（CPA ）的诊断价值。

方法选取疑似CPA 的肺病患者114例，根据最终确诊情况，将确诊CPA 的67例患者作为研究组，确诊为非CPA 的47例患者作为对照组。

采集两组患者血清，比较两组烟曲霉IgG 、血清G 试验、血清GM 含量，并统计单个指标及联合指标诊断CPA 的敏感度、特异性、准确率、阳性预测值、阴性预测值；采用MedCalc 软件对各指标及其联合检测指标进行ROC 曲线分析。

结果研究组患者的烟曲霉IgG 、血清G 试验及血清GM 含量高于对照组差异有统计学意义（P <0.05）；单个指标诊断CPA 中，烟曲霉IgG 的敏感度高于血清G 试验和血清GM （P <0.001），血清G 试验与血清GM 的敏感度差异无统计学意义（P =0.351）；但烟曲霉IgG 特异性最低，血清GM 特异性最高，两两比较差异有统计学意义（P <0.001）。

并联试验联合指标诊断的敏感度均有提升，特异性均下降，且对相对单个指标差异无统计学意义（P>0.05）；烟曲霉IgG 的准确率、阴性预测值高于血清G 、血清GM 、血清G+血清GM （P <0.001），与其他联合检测比较差异无统计学意义（P>0.05）；血清GM 的阳性预测值高于其他指标（P <0.001）。

烟曲霉菌感染的实验室检查方法周艳(综述)烟曲霉菌为空气中常见的腐生菌，为一种机会致病真菌，其孢子直径很小，可被动吸入呼吸道，在一般的环境下，人们每天都能吸入上百个烟曲霉菌孢子，但是通常情况下都不致病。

近20年来随着广谱抗生素的滥用、肿瘤放疗和化疗，造血干细胞移植术、实体器官移植术后应用免疫抑制剂及糖皮质激素等药物以及肠外营养人数的增加以及艾滋病的流行等免疫抑制人群逐年增长[1]，临床上越来越多的免疫力低下的人群感染烟曲霉菌导致侵袭性肺曲霉病（invasive pulmonary aspergillosis, IPA）。

侵袭性曲霉菌感染的发病率日益增长，其发病率已经超过了最常见的真菌感染—侵袭性念珠菌病。

免疫力低下的老年病人发生侵袭性曲霉菌感染后的死亡率也一直居高不下。

IPA以肺部感染为主，主要为急性坏死性出血性肺炎，并可波及骨骼、脑、肝、肾、心脏等全身多个重要器官，其预后极差，死亡率高达80％－90％[2]。

由于IPA的发病机制尚未阐明，从而导致IPA的诊断极为困难，治疗成功率很低。

为此，发展有效的烟曲霉菌感染实验室检查方法对于该病的诊断与治愈显得尤为重要，目前常见的实验室检测方法有：显微镜检查、病原生物学培养方法、血清免疫学检测法、分子生物学检测法等。

本文就这些方法的研究作一综述。

关键词：烟曲霉菌；聚合酶链反应；血清学诊断1、显微镜检查显微镜检查主要包括直接显微镜检查和组织病理学检查，都是以形态学特点为基础来对病原微生物进行诊断。

曲霉菌直接镜检呈现玻璃样透明的菌丝，但是其菌丝结构特点的特异性并不突出，其他种类相似的真菌如青霉菌亦可呈现类似的镜下特点。

另一方面，组织病理学检查虽也是侵袭性曲霉菌感染确诊的“金标准”，病理表现为真菌菌丝侵入和定植于组织或者血管造成炎症改变。

但是其报告总中经常会出现曲霉样形态学特点等描述性的诊断结果，这对在镜下类似曲霉菌类的其他病原微生物的鉴别诊断带来一定的困难，误诊的出现几乎不可避免。