实验大肠杆菌的分离和培养详解演示文稿

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实验一大肠杆菌的分离和培养

病毒
细菌
2.微生物涉及五类放线菌
真菌
原生动物
(二)培养基
• 1.分类(按物理形态分) • (1)液体培养基 • (2)固体培养基
①常用旳固体培养基: 琼脂固体培养基.
②微生物在固体培养基表面生长,能够形成肉眼可见旳菌落.
2.培养基内所含旳基本物质
• (1)水 • (2)碳源 • (3)氮源 • (4)无机盐
a.灼烧灭菌
注意合用范围
微生物旳接种工具 (接种环、接种针)或其他金属用具直接在火焰旳充分燃烧层灼烧
b. 干热灭菌 160－170℃ ；1－2h
能耐高温旳需要保持干燥旳物品( 玻璃器皿)
c.高压蒸汽灭菌 100kPa 121℃ 15-30min
一般用于培养基旳灭菌
二、试验操作 • （一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
• 计算－称量－溶化－灭菌－倒平板
• （二）分离纯化大肠杆菌
• 接种措施有：
• 划种未接种旳培养基放入37℃恒温箱中培养12h 和24h后，观察并统计
三、课题延伸：菌种旳保藏
• 1、斜面保藏 • （临时保存） • 2、甘油保藏
（长久保存）
试验1：大肠杆菌旳培养和分离
角烧瓶旳液体培养基中，三角烧瓶在37℃摇床振荡培养 12h。 • (4) 划线分离：将摇床上培养12h旳菌液在固体培养基旳平板上连续划线，然后将盖好旳培养皿倒置，放在37℃ 恒温培养箱中进行培养。 • (5)单菌落接种培养：在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在空白斜面上，在37℃下培养24h, 4℃冰箱保存。
设备及用具：
灭菌锅或高压锅、250ml旳三角瓶、封口膜和橡皮圈、直径90mm旳培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有酒精棉球旳广口瓶、镊子、有棉塞旳试管（15mm×120mm）5支

实验一大肠杆菌的培养和分离

操作时右手无名指和小指夹住封口膜，另外三指持三角瓶，左手拿培养皿并打开上盖的一边，在酒精灯火焰旁操作。
.
19
（三）大肠杆菌的接种
将斜面上培养的大肠杆菌菌种用接种环接种到灭菌后的LB液体培养基中，将三角瓶的封口膜和斜面的棉塞复原。
注意事项: 1.在火焰旁从斜面上用接种环取菌; 2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧灭菌，冷却后方能取菌； 3.接种时右手拿着接种环，右手无名指和小指夹住斜面的棉塞和三角瓶封口膜； 4.取菌后封口膜和棉塞复原.
LB（Luria-Bertani）液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取液5g/L，
氯化钠10g/L。
（可用于大肠杆菌的扩大培养）
配制50mL的LB培养基：蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠 0.5g，加50mL水溶解。
LB（Luria-Bertani）固体培养基：50ml LB（Luria-Bertani）液体培养基中再加入1g琼脂制得。（可用于大肠杆菌的划线分离）固体培养基可根据需求制成平面或斜面。
培养基：一般 121℃灭菌15min 有葡萄糖：500g/cm2（90℃以上）灭菌30min 有尿素等不能加热的物质：G6玻璃砂漏斗（玻璃砂漏斗用
后需用1mol/L的HCl浸泡，抽滤去酸）
进行操作时，注意瓶口、壁上等不能沾有培养基，否则易发生污染。
.
11
大肠杆菌的培养和分离实验操作步骤
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12
• 实验器材
.
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（四）大肠杆菌的扩大培养
三角瓶在37℃，每分钟200转的摇床上振荡培养12h。
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21
（五）大肠杆菌的划线分离
1、操作步骤（1）灼烧接种环；（2）接种环冷却后，从在摇床上培养了12h的菌液中蘸取菌液；（3）在近火焰处，用带菌液接种环在固体培养基上划线。

实验1大肠杆菌的培养和分离ppt课件

2、成分
水、碳源、氮源、无机盐、生长因子
(生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)
不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方
调节pH
真菌：5～6 细菌：6.5 ～ 7.5
有时会加一定量的氯化钠以维持一定的渗透压
四、无菌操作
1.无菌操作的概念
无菌操作杂泛菌指在培养微生物的操作中，所有防止________污染的方法。
每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。
2、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
划线结束后灼烧接种环，及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
大肠杆菌在人体的_____中一肠般道对人体无害，但任何大大肠肠杆杆菌菌如是_果_进__入_____工__程__中_被__广_泌都泛尿会采系对用统人的体工产具生。危害。
基因
质粒、 EcoRⅠ限制酶、
E.coli-DNA连接酶、
受体细胞
菌落的概念
菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量生长繁殖时，所形成的肉眼可见的具有一定形态结构的子细胞群体。
天然培养基：
天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染;
人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。
主要包括：
_各__种__器__具__必须无菌、 __培__养__基___也必须要无菌、 ___________时不能带入其他杂菌

实验1大肠杆菌的培养和分离浙科版选修一PPT课件

总结词
培养基是培养和繁殖微生物的重要物质，制备培养基的过程需要精确控制各种成分的比例和条件。
详细描述
在制备培养基时，需要选择适合大肠杆菌生长的营养物质，如碳源、氮源、水、无机盐等，按照规定的比例混合，调节pH值，并进行灭菌处理，以确保培养基的质量和安全性。
大肠杆菌的接种和培养
总结词
将纯化后的大肠杆菌接种到培养基中，控制适当的温度和湿度等条件，促进其生长繁殖。
在实验过程中，应严格控制实验条件，确保无菌操作，避免
污染。
对于菌种的来源和纯度，应进行质量检查，确保实验结果的
准确性和可靠性。
在培养过程中，应定期观察并记录菌落的生长情况，以便更好地了解大肠杆菌的生长特性
。
可以尝试采用不同的培养基和培养条件，以获得更优质的大
肠杆菌培养物。
对大肠杆菌培养和分离的实际应用思考
详细描述
在接种大肠杆菌时，需要将纯化后的大肠杆菌稀释并接种到培养基中，然后将其放置在恒温摇床或恒温箱中进行培养。在培养过程中，需要控制温度、湿度、气体浓度等条件，以确保大肠杆菌的正常生长繁殖。
大肠杆菌的分离纯化
总结词
通过特定的分离纯化技术，将大肠杆菌从其他杂菌和杂质中分离出来，获得纯度较高的菌株。
数据分析
对实验过程中记录的数据进行整理和分析，得出大肠杆菌的生长
曲线、生长速率等参数。
结果对比
将实验结果与理论值进行比较，分析实验误差产生的原因，提高
实验的准确性和可靠性。
实验讨论
根据实验结果，讨论大肠杆菌的培养和分离过程中可能存在的问题和改进措施，为后续实验提供
参考。
05 结论与思考题
实验结论总结
培养基成分

实验1：大肠杆菌的培养和分离

04 实验结果与分析
大肠杆菌的培养结果
培养基上生长情况
大肠杆菌在培养基上生长良好，菌落形态呈圆形、湿润、表面光滑，颜色为乳白色。
生化反应
大肠杆菌能够发酵乳糖产酸，在生化反应中表现出特定的特征性变化。
菌落计数
通过菌落计数，我们得到了大肠杆菌的菌落数量，菌落数量在适宜的条件下随着培养时间的延长而增加。
详细描述
将接种后的培养皿放置在恒温培养箱中，保持适宜的温度和湿度。在培养过程中，要定期观察大肠杆菌的生长情况，记录生长曲线，以便后续分析。培养过程中要保持培养皿的清洁，防止杂菌污染。
大肠杆菌的分离
总结词
分离是通过一定的技术手段将目标微生物从混合菌群中单独获取的过程。
详细描述
在大肠杆菌培养完成后，采用涂布法或划线法将菌落分离，获得单菌落。分离过程中要保证无菌操作，避免交叉污染。分离得到的单菌落可用于后续的鉴定和实验研究。
了解大肠杆菌的生物学特性
了解大肠杆菌的形态、染色、生化反应等生物学特性，能够通过实验结果判断所分离的菌株是否为大肠杆菌。
了解大肠杆菌的致病性，包括其产生的毒素、侵袭力、抵抗力等方面的特性，为后续实验和研究提供基础。
掌握微生物实验的基本操作
掌握微生物实验的基本操作，包括无菌操作、显微镜使用、细菌计数、菌种保存等，能够独立完成微生物实验。
条件致病菌
在特定条件下，大肠杆菌可引起肠道外感染，如败血症、新
生儿脑膜炎等。
抗原结构
大肠杆菌具有O抗原、H抗原和K抗原，可用于血清学分型
。
大肠杆菌的培养基
01
02
03
基础培养基
如肉汤培养基、营养琼脂培养基等，提供大肠杆菌生长所需的基本营养成分。

实验大肠杆菌的分离和培养2讲课文档

第27页，共30页。
划线分离法
第28页，共30页。
（5）斜面接种保存 • 在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上。 • 37℃培养24h后，4 ℃冰箱保存。
第29页，共30页。
涂布分离法
第30页，共30页。
第25页，共30页。
划线分离法
• 划线的起点要有菌，且每一次新的起点应比前一次的起点菌含量（浓度）低
• 划线的最终点不能与前面的划线点重叠
除第1次外，其余几次划线前，都要将
接种环火焰灼烧
第26页，共30页。
防止培养皿盖上的冷凝水滴落入培养基表面，使菌落中的菌随水扩散，造成污染。
平板倒置
恒温培养箱
的三角烧瓶，靠近酒精灯火焰；
• 右手：拿接种环，并用无名指和小指夹住斜面的棉塞和三角瓶的封口膜；
• 接种环在火焰上烧红，再深入到斜面，使环接触培养基，再取菌体；
• 将菌体放入三角瓶的液体培养基中，
瓶口封口膜和管口棉塞复原；
• 将三角瓶置于37℃摇床振荡培养12h。
第23页，共30页。
第24页，共30页。
实验大肠杆菌的分离和培养
第1页，共30页。
优选实验大肠杆菌的分离和培养
第2页，共30页。
实验1 大肠杆菌的培养和分离
• 基本要求 • 1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养
基进行细菌培养的操作。 • 2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培
养基进行细菌的培养。
第3页，共30页。
一、大肠杆菌
• 革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌 • 在肠道中一般对人无害
破坏。
（160 ℃ 2h或170 ℃ 1h）
有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为防止杂菌

实验大肠杆菌的培养和分离专家讲座

实验大肠杆菌的培养和分离专家讲座
第13页
从大肠杆菌斜面→锥形瓶中液体培养基接种好后在37度摇床振荡培养12h 工具: 接种环在接种前要灭菌
实验大肠杆菌的培养和分离专家讲座
第14页
分离方法: 平板划线分离法
原理: 经过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线操作，将聚集菌种逐步稀释分散到培养基表面。在数次划线后，能够分离到由一个细胞繁殖而来肉眼可见子细胞群体，这就是菌落。
操作第一步灼烧接种环是为了防止接种环上可能存在微生物污染培养物
每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后, 接种环上残留菌种, 使下一次划线时, 接种环上菌种直接起源于上次划线末端, 从而经过划线次数增加, 使每次划线时菌种数目逐步降低, 方便得到菌落
划线结束后灼烧接种环, 能及时杀死接种环上残
调整促生长
维生素，AA，碱基等
第7页
消毒: 较为温和方法，如酒精注: 消毒不能杀死芽孢
灭菌: 强烈，全部，完全无菌
灭菌消毒技术是微生物相关工作中最普通也是最主要技术。
实验大肠杆菌的培养和分离专家讲座
第8页
(1)惯用消毒方法:
1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min 2、巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min（牛奶） 3、化学药剂消毒法:用70%酒精进行皮肤消毒;氯气消毒水源 4.紫外线消毒（空气）
第3页
芽孢: 细菌休眠体
实验大肠杆菌的培养和分离专家讲座
第4页
结构异养型，兼性厌氧型，革兰氏阴性(红色)(G-) 物质(元素)组成: C H O N P S…
实验大肠杆菌的培养和分离专家讲座
第5页
按照微生物对营养物质不一样需求, 配制出供其生长繁殖营养基质。

实验1大肠杆菌的培养和分离解析

倒平板：待培养基冷却至__６__０_ ℃时，将每只培养皿倒入_1_0_～__1_2___ml未凝固的固体培养基，置于_水__平__位置上，轻轻晃动使其均匀铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。_倒__置____备用。制斜面：将未凝固的固体培养基的试管_斜___放，冷却待凝使即成为斜面。
思考题： A、操作过程中避免带入杂菌的方法有哪些？ 1、灭菌后的培养基、器具置于超净台上，并打开超净台的紫外灯和过滤风，灭菌30分钟。 2、用镊子夹出洒精棉球擦拭桌面和实验者双手。 3、整个操作在酒精灯火焰旁进行 4、打开后或加塞前试管口、三角瓶口灼烧灭菌。
天然培养基：
天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染;
人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。
划线分离方法简单；涂布分离，易形成单菌落，但操作复杂些。
稀释涂布法
10g土样从土壤中分离微生物
（五）斜面接种及菌种保存
主要器具：接种环、恒温箱、冰箱
操作过程：在无菌操作下，用接种环挑取_单__菌落，再用划线法（自斜面底部向上轻轻划直线）接种在_斜__面__上， _３__７__℃恒温培养箱中培养_２__４_小时后，__４__℃ 冰箱保存。
请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手
答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。
二操作步骤
（一）制备LB培养基（通用的细菌培养基）

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棉塞制作
正确
1/3在试管外，
2/3在试管内
不正确
（3）接种培养
• 左手：将大肠杆菌斜面和有液体培养基的三角烧瓶，靠近酒精灯火焰；
• 右手：拿接种环，并用无名指和小指夹住斜面的棉塞和三角瓶的封口膜；
• 接种环在火焰上烧红，再深入到斜面，使环接触培养基，再取菌体；
• 将菌体放入三角瓶的液体培养基中，瓶口封口膜和管口棉塞复原；
光滑型菌落
粗糙型菌落
二、细菌的培养和分离
1、实验仪器设备：
移液枪
接种环
玻璃刮刀
超净工作台
（保证无菌环境）
高压蒸汽灭菌锅
恒温培养箱
摇床
2、培养基：液
固体培养基体
培养基
LB培养基：
固
蛋白胨：0.5g
体
酵母提取物：0.25g 培
NaCl:0.5g
养
H2O:50mL 琼脂：1g
调pH值
划线分离法
• 划线的起点要有菌，且每一次新的起点应比前一次的起点菌含量（浓度）低
• 划线的最终点不能与前面的划线点重叠
除第1次外，其余几次划线前，都要将接种环火焰灼烧
防止培养皿盖上的冷凝水滴落入培养基表面，使菌落中的菌随水扩散，造成污染。
平板倒置
恒温培养箱
划线分离法
（5）斜面接种保存
基
平板
斜面
液体培养基（培养液）
菌膜
对照
菌沉淀
均匀浑浊
3、实验步骤：
（1）培养基、培养皿灭菌 ——高压蒸汽灭菌法
• 将配制好的50ml LB液体和固体培养基分别装入250ml 三角瓶中，加上封口膜； • 将培养皿用牛皮纸包好；
置于灭菌锅内1kg压力灭菌15min （121℃）
无菌技术
最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭
• 在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上。
• 37℃培养24h后，4 ℃冰箱保存。
涂布分离法
实验大肠杆菌的分离和培养详解演示文大肠杆菌的培养和分离
• 基本要求 • 1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培
养基进行细菌培养的操作。 • 2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面
培养基进行细菌的培养。
一、大肠杆菌
• 革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌
• 在肠道中一般对人无害
• 但也有一些菌株对人体是有害的，可侵袭肠粘膜并产生毒素
• 任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。
脱色
革兰氏染色法
结晶紫 1min 碘液 1min 95%乙醇
复染
革兰阳性
革兰阴性
菌落（colony）：一个细菌细胞在固体培养基上发展成一个肉眼可见，具一定形态结构的子细胞群。
倒平板： 10-12ml培养基/培养皿每倒入一个后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，并形成平面。
酒精灯旁：
左手？右手？
制作试管斜面： P21小字部分
• 将配制好的呈熔化状态的培养基转移到试管中时必须用三角漏斗
• 将分装好的含培养基的试管灭菌
• 灭菌试管冷却到50℃左右，把试管棉塞一端搁在玻棒上，待冷凝后即成试管斜面
通过，而空气中的其他微生物不能通过。
• 高压蒸汽灭菌法：玻璃器皿、金属、移液枪头等
• （火焰）灼烧：接种环、试管口、三角烧瓶口
• 紫外灯+过滤风：超净台灭菌
• 消毒：70%酒精棉球
（消毒：利用化学或物理方法，杀死大
部份致病微生物的过程。）
（2）倒平板
• 灭菌后，待灭菌锅压力与大气压力相同时打开锅盖 • 将有培养基的三角瓶和培养皿放到超净台上 • 打开超净台的紫外灯和过滤风，待固体培养基冷却到60℃时，关闭紫外灯 •用酒精棉球消毒桌面和手。
• 将三角瓶置于37℃摇床振荡培养12h。
（4）划线分离
• 在酒精灯火焰上灼烧接种环；
• 将摇床上培养了12h的菌液打开，接种环部分深入到菌液中； • 在固体培养基的平板上连续划线，接种环只在菌液中蘸菌液一次，划线后盖好培养皿；
• 将培养皿倒置（盖在下面），放到恒温培养箱中培养12-24h后，可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。
所有的生物，同时可以基本保持培养基的营养成分
不被破坏。
（160 ℃ 2h或170 ℃ 1h）
有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为防止
杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶
都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞（不能
用脱脂棉：易吸水引起后引起污染），也可采用各
种金属、塑料、封口膜及硅胶帽，它们只可让空气