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纯化大肠杆菌的方法大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道菌，也是许多生物学实验室中最常用的微生物之一。
在进行分子生物学和遗传学研究时，纯化大肠杆菌是必不可少的步骤之一。
纯化大肠杆菌的目的是将目标菌种从其他微生物（如其他细菌、真菌）和杂质中分离出来，以便后续的实验操作。
以下是一种常用的纯化大肠杆菌的方法：1. 培养大肠杆菌首先，需要选择一株含有目标基因的大肠杆菌株，并进行培养。
将该菌株接种到含有合适营养物质的培养基中，并在适当的温度下培养。
常用的培养基包括Luria-Bertani培养基（LB培养基）等。
2. 收获大肠杆菌在培养过程中，大肠杆菌会进入对数生长期。
当细菌数量达到一定程度时，可以收获细菌。
收获大肠杆菌的方法有两种：离心收获和滤膜收获。
离心收获适用于较大规模的细菌培养，而滤膜收获适用于小规模的细菌培养。
3. 细胞破碎将收获的大肠杆菌细胞进行破碎，以释放细胞内的目标蛋白或核酸。
细胞破碎的方法有多种，包括机械破碎、超声波破碎和化学破碎等。
机械破碎是最常用的方法之一，可以使用搅拌器或高压均质器对细胞进行破碎。
4. 离心分离通过离心将细胞的残渣和细胞碎片与溶解的目标物分离。
首先，通过低速离心将细胞碎片和细胞碎片从溶解的目标物中分离出来。
然后，通过高速离心将残留的细胞碎片和杂质从溶解的目标物中完全清除。
5. 溶解目标物将离心分离的溶解物中的目标物进行溶解，得到纯净的目标蛋白或核酸。
溶解的方法根据目标物的性质不同而不同，可以使用洗脱缓冲液、盐溶液或变性剂等。
溶解后，可以通过低速离心将溶解物中的可溶性目标物与不溶性杂质分离。
6. 纯化目标物将溶解的目标物进行纯化，以获得纯净的目标蛋白或核酸。
常用的纯化方法包括亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析和透析等。
选择合适的纯化方法可以根据目标物的性质和目标物与杂质之间的亲和性进行选择。
7. 鉴定目标物对纯化后的目标物进行鉴定，确保纯化的目标物具有预期的功能和性质。
大肠杆菌培养的基本操作介绍如下：
1.紫外线灭菌：将需要使用的培养物和培养器具放置在紫外线灯
下，进行消毒处理。
2.制备培养基：制备适当的培养基。
常用的培养基包括LB培养基
和M9培养基等。
3.接种：选取一定数量的大肠杆菌，将其接种到培养基中。
4.培养：将接种后的培养基放置在恒温摇床上，以适当的温度和
湿度条件下进行培养。
5.观察：观察培养物的生长情况，记录生长速度和菌落形态等信
息。
6.分离：将培养物分离，进行纯化处理。
7.储存：将分离后的纯化菌株储存，并进行标记和记录。
以上是大肠杆菌培养的基本操作，需要注意消毒、无菌操作和记录等方面的细节。
一、实验目的1. 了解大肠杆菌的生物学特性。
2. 掌握大肠杆菌的分离、纯化和鉴定方法。
3. 掌握大肠杆菌的培养和计数方法。
二、实验原理大肠杆菌（Escherichia coli）是肠杆菌科的一种细菌，广泛存在于人体肠道中。
本实验通过分离、纯化和鉴定大肠杆菌，了解其生物学特性，并掌握其培养和计数方法。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜粪便、营养琼脂平板、营养肉汤、无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、无菌培养皿、无菌移液器、酒精灯、显微镜等。
2. 实验仪器：恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、无菌操作台等。
四、实验方法1. 大肠杆菌的分离（1）取新鲜粪便样品，用无菌生理盐水进行稀释。
（2）取适量稀释液，用无菌棉签涂布于营养琼脂平板上。
（3）将平板放入恒温培养箱中，37℃培养24小时。
2. 大肠杆菌的纯化（1）观察平板上的菌落，挑选单菌落，用无菌移液器移至新的营养琼脂平板上。
（2）将平板放入恒温培养箱中，37℃培养24小时。
3. 大肠杆菌的鉴定（1）观察纯化后的菌落，记录菌落特征，如大小、形状、颜色等。
（2）将纯化后的菌株接种于营养肉汤中，37℃培养24小时。
（3）取培养液，用显微镜观察细菌形态，并进行革兰氏染色。
（4）对培养液进行生化试验，如乳糖发酵试验、吲哚试验等。
4. 大肠杆菌的培养与计数（1）将纯化后的菌株接种于营养肉汤中，37℃培养24小时。
（2）用无菌移液器取适量培养液，进行系列稀释。
（3）取稀释液，涂布于营养琼脂平板上。
（4）将平板放入恒温培养箱中，37℃培养24小时。
（5）观察平板上的菌落，记录菌落数，并计算大肠杆菌的浓度。
五、实验结果与分析1. 大肠杆菌的分离：在平板上观察到圆形、光滑、白色、半透明的菌落，说明已分离出大肠杆菌。
2. 大肠杆菌的纯化：经过纯化后，菌落特征与分离菌落相同，证明已得到纯化的大肠杆菌。
3. 大肠杆菌的鉴定：通过显微镜观察，发现细菌为革兰氏阴性短杆菌，生化试验结果显示该菌株能发酵乳糖，产生吲哚，表明已鉴定为大肠杆菌。
分离大肠杆菌的方法大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，也是微生物学研究中的重要模式生物。
分离大肠杆菌是许多实验室中常见的操作，这里将介绍几种常用的分离方法。
1.无菌技术准备在进行分离大肠杆菌之前，必须保证实验环境的无菌。
操作前要用75%乙醇对操作台面进行消毒，使用无菌培养皿和试管，并佩戴无菌手套。
2.样品采集从目标样品中采集含有大肠杆菌的样品。
常见的样品类型包括食品、水样、粪便等。
采集样品时要注意避免污染，使用无菌容器收集样品。
3.预处理样品将采集到的样品进行预处理，以提高大肠杆菌的分离效率。
常用的预处理方法包括：(1) 粪便样品：将粪便样品稀释于无菌生理盐水中，通过离心操作去除大部分固体颗粒。
(2) 食品样品：将食品样品加入适量的无菌生理盐水中，进行均匀搅拌。
(3) 水样：直接使用无菌容器收集水样，避免污染。
4.选择培养基根据实验需要选择适合分离大肠杆菌的培养基。
常用的培养基包括营养琼脂糖平板（Nutrient Agar Plate）、MacConkey琼脂糖平板（MacConkey Agar Plate）等。
这些培养基含有适合大肠杆菌生长的营养物质，并可以通过某些特殊成分选择性地抑制其他细菌的生长。
5.涂布法涂布法是最常用的分离大肠杆菌的方法之一。
具体操作步骤如下：(1) 取一支无菌的鉴别环，将其蘸取预处理后的样品。
(2) 将鉴别环均匀地涂布在培养基平板的表面上。
(3) 使用无菌铁环或无菌玻璃杆均匀涂布，以保证样品的均匀分布。
(4) 将涂布好的培养基平板放置在恒温培养箱中，以适当的温度（通常为37摄氏度）进行培养。
6.滤膜法滤膜法是一种通过滤膜来分离大肠杆菌的方法。
具体操作步骤如下：(1) 准备无菌滤膜和滤膜培养基。
(2) 将预处理后的样品滤过滤膜，将滤膜放置在滤膜培养基平板上。
(3) 将滤膜培养基平板放置在恒温培养箱中进行培养。
7.生物化学试验分离大肠杆菌后，需要进行进一步的鉴别和确认。
大肠杆菌的培养方法
大肠杆菌是一种常见的细菌，广泛存在于自然界中，也是一种重要的实验室模式生物。
在生物学、医学、食品工业等领域中，大肠杆菌的培养方法是非常重要的。
下面我们来了解一下大肠杆菌的培养方法。
1. 培养基的选择
大肠杆菌可以在多种培养基上生长，但最常用的是LB培养基。
LB 培养基是一种富含营养物质的培养基，可以提供大肠杆菌所需的所有营养物质。
此外，还有一些特殊的培养基，如M9培养基、TB培养基等，可以根据实验需要选择。
2. 培养条件的控制
大肠杆菌的生长需要一定的温度、pH值和氧气含量等条件。
一般来说，大肠杆菌的最适生长温度为37℃，pH值为7.0左右，需要充足的氧气供应。
因此，在培养大肠杆菌时，需要控制好这些条件，以保证细菌的正常生长。
3. 培养方法的选择
大肠杆菌的培养方法有液体培养和固体培养两种。
液体培养适用于大规模培养，可以在较短时间内获得大量的细菌。
固体培养适用于单个菌落的分离和纯化，可以使不同菌株之间不互相干扰，方便后
续的实验操作。
4. 培养时间的控制
大肠杆菌的生长速度较快，一般在液体培养中可以在12-16小时内达到对数生长期，而在固体培养中需要24-48小时。
因此，在培养大肠杆菌时，需要控制好培养时间，以避免过度生长或过早停止生长。
大肠杆菌的培养方法是实验室中非常重要的一部分。
通过选择合适的培养基、控制好培养条件和时间，可以获得高质量的大肠杆菌菌株，为后续的实验操作提供保障。
分离大肠杆菌的方法大肠杆菌是一种常见的肠道细菌，具有广泛的应用价值。
在科学研究和实际应用中，需要将大肠杆菌与其他细菌分离开来，以便进行进一步的研究和利用。
下面将介绍几种常用的分离大肠杆菌的方法。
1. 革兰氏染色法革兰氏染色是一种常用的细菌分类和鉴定方法，也适用于分离大肠杆菌。
该方法基于细菌细胞壁的染色反应，将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两类。
大肠杆菌属于革兰氏阴性菌，通过革兰氏染色可以将其与革兰氏阳性菌区分开来。
2. 培养基选择法大肠杆菌对不同培养基有特定的生长要求，可以利用这一特性进行分离。
常用的培养基有MacConkey培养基和Eosin Methylene Blue (EMB) 培养基。
这两种培养基中都含有特定的抑菌剂，可以抑制大肠杆菌以外的其他细菌的生长，从而使大肠杆菌能够生长并形成特征性的菌落。
3. 双层琼脂糖平板法双层琼脂糖平板法是一种常用的分离大肠杆菌的方法。
该方法利用了大肠杆菌产生气体的特性。
首先，在琼脂糖平板上均匀涂抹待分离样品，然后在上层平板上加上一层液体琼脂糖。
如果样品中存在大肠杆菌，它们会在培养过程中产生气体，使液体琼脂糖上升形成气泡，从而可以观察到特征性的气泡形成。
4. PCR 筛选法PCR 筛选法是一种高效的分离大肠杆菌的方法。
它利用了大肠杆菌特有的基因序列，通过特异性引物扩增目标基因片段，并通过凝胶电泳分离和鉴定。
这种方法具有高灵敏度和高特异性，可以快速、准确地分离大肠杆菌。
总结起来，分离大肠杆菌的方法有革兰氏染色法、培养基选择法、双层琼脂糖平板法和PCR 筛选法等。
在实际应用中，可以根据具体需要选择适合的方法进行分离和鉴定。
这些方法的应用不仅可以帮助科研人员深入了解大肠杆菌的特性和生理功能，还可以为医学诊断、食品安全等领域提供有力的支持。
大肠杆菌如何培养
一、大肠杆菌如何培养1. 大肠杆菌如何培养2. 大肠杆菌的保存方法 3. 大肠杆菌菌种的复苏二、大肠杆菌对人体益处和危害三、什么是大肠杆菌
大肠杆菌如何培养
1、大肠杆菌如何培养1.1、称药品按实际用量计算后,按配方称取各种药品放入大烧杯中。
牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶解后倒入大烧杯;也可放在称量纸上称量,随后放入热水中,牛肉膏使与称量纸分离,立即取出纸片。
蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速。
1.2、加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉网上,小火加热,并用玻棒搅拌,待药品完全溶解后再补充水分至所需量。
若配制固体培养基,则将称好的琼脂放入己溶解的药品中,再加热融化,此过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底或溢出,最后补足所失的水分。
1.3、调pH 检测培养基的pH,若pH偏酸,可滴加lmol/L NaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸检测,直至达到所需pH范围。
若偏碱,则用lmol/L HCl进行调节。
pH的调节通常放在加琼脂之前。
应注意pH值不要调过头,以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
1.4、过滤液体培养基可用滤纸过滤,固体培养基可用4层纱布趁热过滤,以利培养的观察。
但是供一般使用的培养基,这步可省略。
1.5、分装按实验要求,可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。
分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。
2、大肠杆菌的保存方法
2.1、常用的长期保存法有:液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜(DMSD)等保护剂。
大肠杆菌培养步骤方法大肠杆菌是一种重要的细菌，它在实验室中被广泛用于分子生物学研究和基因工程。
下面是大肠杆菌的培养步骤方法，共50条，并展开详细描述：1. 准备所需的培养基及试剂，包括琼脂、培养基粉、蔗糖、牛肉膏、酵母提取物、氯化钠、磷酸二氢钾等。
2. 将琼脂及培养基粉加入适量蒸馏水中，搅拌均匀后加热至沸腾，然后灭菌。
3. 将灭菌后的琼脂培养基倒入培养皿中，使其凝固成固体琼脂。
4. 取出实验室保存的大肠杆菌菌种，用无菌吸管从存储容器中取出适量菌液。
5. 将菌液均匀地涂布在琼脂培养皿表面，待其吸收后轻轻晃动培养皿使其均匀分布。
6. 将涂布好的培养皿倒置放入孵化箱中，以37℃恒温孵育。
7. 每隔一段时间观察培养皿上的菌落形成情况，选择合适的菌落进行分离和培养。
8. 在培养过程中，注意观察是否有任何异常，如细菌变异、污染等情况。
9. 定期检查培养基的PH值和温度，保持在适宜的范围内。
10. 当需要保存大肠杆菌菌株时，可以将单一菌落悬浮在无菌离心管中，并添加10%甘油保藏在-80℃低温库中。
11. 每次操作前要做好无菌操作，以避免外源菌的污染。
12. 大肠杆菌培养时，应严格控制氧气供应，可以选择静态培养或者摇瓶培养。
13. 在摇瓶培养中，要保持培养液的充分通气，防止细菌缺氧而死亡。
14. 对于含氧厌恶的大肠杆菌菌株，可以选择在含葡萄糖并定期通氮气的缺氧箱中进行培养。
15. 大肠杆菌培养皿观察时，可使用显微镜进行观察，观察菌落形态、大小和颜色等特征。
16. 对于选择性培养基的应用，可以根据需要添加抗生素或者其他选择性物质来筛选感兴趣的菌株。
17. 在进行大肠杆菌培养时，要注意控制培养基的含盐量和碳源，以及其他微量元素的添加。
18. 可以通过PCR或者其他分子生物学方法快速鉴定大肠杆菌的种属和亚种属。
19. 在大肠杆菌的培养中，要注意排放生物危害废弃物，并采取相应的安全防护措施。
20. 大肠杆菌培养时，要做好相关记录，包括菌种信息、培养条件、观察结果等。
大肠杆菌一般培养方法大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，也是生物学研究中最常用的模式菌株之一、大肠杆菌具有广泛的分布范围，可以在许多环境中生存和繁殖。
本文将介绍大肠杆菌的一般培养方法。
一、培养基的制备大肠杆菌的培养基通常包括两个主要组分：固体培养基和液体培养基。
固体培养基用于菌落计数和细菌分离，并可用于培养单个菌落。
液体培养基则可用于扩大菌种和进行大规模的培养。
1.固体培养基的制备最常用的固体培养基为琼脂培养基。
制备过程如下：（1）称取所需琼脂，加入适量的蒸馏水中，进行均匀搅拌。
（2）加热至100摄氏度，溶解琼脂。
（3）煮沸1-2分钟，消毒琼脂。
（4）冷却至约50摄氏度。
（5）加入所需的培养基成分，如营养物质和抗生素等。
（6）倒入培养皿中，待凝固后即可使用。
2.液体培养基的制备最常用的液体培养基包括LB培养基（Lysogeny Broth）和TB培养基（Terrific Broth）。
制备过程如下：（1）称取所需培养基成分，加入适量蒸馏水中。
（2）加入琼脂和洗涤剂等成分，以调整液体的黏度和表面张力。
（3）调整pH值。
（4）加热并搅拌溶解，待溶解后冷却。
（5）过滤培养基，以去除不溶性杂质。
（6）分装到培养瓶中。
二、大肠杆菌的预培养将保存的大肠杆菌菌种(如冻存菌)挑取一高洁净的培养皿上贴菌，通常可采用菌板上交叉涂布法，用三角稀菌棒反复涂抹菌落。
之后用无菌瓷珠轻压菌落，使其均匀分散于培养皿上。
贴菌后将培养皿倒置，避免水分凝结在盖子上。
培养皿翻转的目的是避免水珠滴入培养基内，影响气体交换。
然后将培养皿放入培养箱中，37℃保温，24小时后进行预培养。
三、大肠杆菌的正式培养预培养后，取适量的大肠杆菌菌落液，加入培养基中，并进行摇床培养。
有时候，还需要在培养基中添加相应的抗生素，以筛选具有特定基因或表现的菌株。
培养条件一般为37摄氏度、摇床转速为200-250转/分钟。
培养时间根据需要和实验目的而定。
【关键字】报告大肠杆菌培养实验报告篇一：大肠杆菌检测实验报告国标法测定大肠杆菌样本的细菌总数实验目的实验原理：国标法操作的原理实验器材：培养箱，10只移液管，1只250ml锥形瓶，5只大试管，试管架，4个平皿，500ml大烧杯1个，电子天平，纱布，脱脂棉，灭菌锅，PH计或PH试纸，100ml量筒，橡皮手套，超净台实验药品：磷酸盐缓冲液，蒸馏水，LB培养基，琼脂，5%NaOH，5%HCl实验步骤：一：10只移液管，1只250ml锥形瓶，5只大试管，4个平皿，500ml大烧杯1个，100ml 量筒进行洗涤，然后一起放入高压蒸汽灭菌锅中在121摄氏度条件下灭菌20min。
灭完菌后烘干，完成后放入超净台中。
用酒精擦拭超净台，紫外消毒30min二：1：用电子天平称取成品LB 3.1241g和琼脂1.8756g放入250ml的洁净锥形瓶中。
2：用量筒量取125ml的蒸馏水加入该锥形瓶中，制成培养基。
3：用棉花堵住该锥形瓶的瓶口，用牛皮纸包住瓶口，用橡皮筋扎牢，再将培养基放入灭菌锅中在121摄氏度之下灭菌20min。
4：灭完菌后放入超净台中备用。
三：1：取1只无菌250ml锥形瓶，用量筒向其中加入49ml PBS2：将1ml样品加入到该锥形瓶中，摇匀制成1:50的细菌溶液。
3：取4只试管，编号1—44：用无菌移液管分别向4只试管中加入9ml的PBS5：用1ml无菌移液管从样品中移取1ml菌液加入到1中.震荡试管使菌液均匀。
6：用1ml无菌移液管从1号试管中移取1ml的细菌溶液加入2号试管中，摇匀7：用另一只1ml无菌移液管从2号试管中移取１ｍｌ细菌溶液，加入3中，摇匀．．．．．．以此类推直至4只试管中均加入了细菌溶液。
9：取4只平皿，编号1—410：分别用4只无菌移液管从这4只试管中移取１ｍｌ的菌液置于4只平皿中，加入４５—５０摄氏度温度下的培养基，约１５ｍｍ厚度。
缓慢旋转平皿使菌液与培养基混合均匀；待培养基冷凝后倒置。
实验微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏一、实验目的和要求1。
了解微生物的分离纯化方法。
2.学习检测水中大肠菌群的方法。
3。
学习微生物的保藏及鉴定方法。
4。
熟悉革兰氏染二、实验原理多管发酵法多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管.乳糖能起选择作用,因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气.1.初发酵试验水样接种于发酵管内，37℃下培养,24小时内小套管中有气体形成,并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群,为阳性结果。
48小时后仍不产气的为阴性结果。
2。
平板分离初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝琼脂，平板上划线分离菌落。
3.复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落,经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。
原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
三、实验器材及试剂1。
水样污水样本2、培养基及试剂：二甲苯、苯酚、琼脂粉、香柏油、乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、革兰氏一液、革兰氏二液、革兰氏三液、革兰氏四液。
3、器材及耗材：双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、纱布、吸耳球、产气管、培养皿、移液管等四、实验方法及步骤1。
第一天实验前的准备1）配制3支乳糖胆盐液体培养基，每支10mL,并加入产气管.配置营养琼脂培养基，灌装进2支试管中，配置200mL伊红美兰培养基150mL,于121℃高温高压灭菌20分钟，后放进恒温干燥箱。
2）包扎5套培养皿，包扎6根1mL、1根10mL移液管和3支滴管。
于121℃高压灭菌锅中灭菌20分钟。
3）称取一定量的液体石蜡,约为锥形瓶的三分之一。
于121℃高温高压灭菌20分钟。
大肠杆菌一般培养方法大肠杆菌是一种常见的肠道细菌，也是实验室常用的模型菌株之一、它具有许多重要的应用价值，如基因工程、发酵制药和生物学研究等。
因此，了解大肠杆菌的常规培养方法是非常重要的。
大肠杆菌的培养基本上可以分为两个类型：液体培养基和固体培养基。
下面我将为您详细介绍。
1.液体培养基液体培养基是一种将细菌培养在含有养分的液体中的方法。
使用液体培养基可以快速扩大大肠杆菌数量，并且可以用于后续实验，如基因克隆和蛋白表达等。
下面是一种常见的液体培养基配方：- 色氨酸酸盐 (tryptone): 10g/L- 酵母粉 (yeast extract): 5g/L-氯化钠(NaCl):10g/L- 葡萄糖 (glucose): 5g/L-洗涤剂提供的磷酸缓冲溶液(PBS)：500mL，pH值自动调整到7.0将这些成分溶解在适量的去离子水中，并将溶液进行无菌过滤。
然后将无菌培养基分装到培养瓶中，每个瓶子的体积约为250-500mL，用铝箔进行覆盖。
接种数量的大肠杆菌通常为菌液的10-20倍。
将培养瓶放在摇床上以200rpm的速度培养，温度为37°C。
培养时间一般为12-16小时。
2.固体培养基固体培养基是将细菌培养在含有固体化剂（如琼脂）的培养基上的方法。
使用固体培养基可以使大肠杆菌形成菌落，便于分离和挑选单个菌落。
下面是一种常见的固体培养基配方：- 琼脂 (agar): 15g/L- 色氨酸酸盐 (tryptone): 10g/L- 酵母粉 (yeast extract): 5g/L-氯化钠(NaCl):10g/L- 葡萄糖 (glucose): 5g/L-洗涤剂提供的磷酸缓冲溶液(PBS)：500mL，pH值自动调整到7.0将这些成分溶解在适量的去离子水中，并将溶液进行无菌过滤。
然后将无菌培养基分装到试管或平盘中，每个试管或平盘的体积约为10-15mL或20-25mL，用无菌塞子或膜进行封口。
大肠杆菌种子液的制备牛肉膏蛋白胨培养基的配方：液体培养基牛肉膏3.0g蛋白胨10.0g氯化钠5。
0g水1000mlpH 7。
4—7.6固体培养基在液体培养基的基础上再加入1。
5%－2.0％的琼脂1 试管斜面与平板的制备（1）称量按培养基配方比例依次准确称取蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、水放入烧杯中.（2）熔化在上述烧杯中先加入少于所需要量的水，用玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，药品完全溶解后，补充水到所需的总体积。
将称量好的1。
8%琼脂放入已溶的药品中，再加热熔化，最后补充所损失的水分。
（3）调PH 在未调PH前，先用精密PH试纸测量培养基的原始PH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌,并随时用PH试纸测基PH直到PH达到7。
4—7。
6。
反之用1mol/L HCl进行调节.（4）分装将培养基分装入三个试管中和三角烧瓶中。
其试管装量不超过管高的1/5,三角烧瓶的量不超过1/2加塞培养基分装完毕后,在试管口和三角烧瓶口上塞上棉塞.（5）包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好,再在棉塞外包一层牛皮纸,其外再用一道麻绳扎好.用记号笔注明培养基名称、配制日期。
（6）灭菌将上述培养基以0。
1Mpa,121℃，15min高压蒸气灭菌。
（7）倒平板，取三个已消毒的培养皿，在无菌操作台上用三角烧瓶中的培养基倒制三个平板培养基，冷却.（8）搁置斜面将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管口端搁在玻璃棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜.2 接种大肠杆菌斜面种子（1）取实验室储备的大肠杆菌BL21种子，在酒精灯附近，用接种环在已制备好的斜面上接种上大肠杆菌。
(2) 将接种好的斜面放入37℃的恒温培养箱子中培养24h.3 制备平板种子(1) 在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌的斜面，用无菌生理盐水将菌种冲洗下来，再用无菌生理盐水将其梯度稀释为1倍,10倍,100倍和1000倍,用移液枪分别吸取各梯度的溶液涂布平板(每个梯度涂布三个平板，每次吸取溶液100ul），然后在37℃培养箱中过夜。
探讨大肠杆菌的培养及药敏试验摘要:随着社会经济带动养殖业的发展，产生的大量的环境及其他问题也亟待解决[1]。
其中，大肠杆菌属于常发性感染细菌病，其传播范围大、病情严重，给养殖经济带来严重损失，有效预防大肠杆菌病是现代养殖业需要研究的重要课题[2]。
本文研究大肠杆菌的分离纯化培养及对各种抗生素的敏感程度。
得到结论：大肠杆菌对抗生素环丙沙星、头孢唑啉敏感，对氯霉素、庆大霉素、复方新诺明、丁胺卡那、诺氟沙星表现为中度敏感，氨苄西林、红霉素、青霉素则表示为不同程度上的耐药性。
关键词：大肠杆菌分离纯化药敏实验抗生素引言21世纪以来，我国养殖业不断扩大，随着养殖市场规范化、集约化养殖程度的增加，随之而来的动物疾病也越发严重[3]，尤其是大肠杆菌病日益突出[4]。
大肠杆菌可引起鸡、鸭、猪、兔、羊、水貂、狐狸等多种动物的疾病[7]，常见的大肠杆菌病例如：仔猪水肿病、动物肺炎及腹泻等。
为此也给养殖业带来了严重的经济损失。
大肠杆菌是革兰氏阴性兼性厌氧菌，是一种常见的胃肠道细菌和环境污染源。
它是引起人和动物并发症[5]的重要病原体。
目前，抗生素治疗是控制疾病最有效的方法，由于部分药物抗菌活性强、价格低廉、易被口服[6]吸收，但随着抗生素的过度使用，导致耐药严重。
本课题旨在为临床合理用药提供可靠依据[3]。
1材料与方法1.1材料大肠埃希氏菌（ATCC25922标准菌株[8]，斜面菌种，上海鲁微科技有限公司）营养琼脂培养基（杭州微生物试剂有限公司)[9]，LB肉汤培养基（长沙市雨花区加德实验仪器），10种抗生素药敏纸片（氯霉素、庆大霉素、复方新诺明、丁胺卡那、环丙沙星、头孢唑啉、氨苄西林、诺氟沙星、红霉素[10]、青霉素等购于常德比克曼生物科技有限公司）[11]，电热恒温培养箱DNP 型( 上海精宏实验设备有限公司) ; 高压蒸汽灭菌器YX － 280D + ( 合肥市华泰医疗设备有限公司) ; 紫外灯2537A 型( 江苏申星光电医疗器械有限公司)[9]。
大肠杆菌种子液的制备牛肉膏蛋白胨培养基的配方：液体培养基牛肉膏 3.0g蛋白胨10.0g氯化钠 5.0g水1000mlpH 7.4-7.6固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂1 试管斜面与平板的制备（1）称量按培养基配方比例依次准确称取蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、水放入烧杯中。
（2）熔化在上述烧杯中先加入少于所需要量的水，用玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，药品完全溶解后，补充水到所需的总体积。
将称量好的 1.8％琼脂放入已溶的药品中，再加热熔化，最后补充所损失的水分。
（3）调PH 在未调PH前，先用精密PH试纸测量培养基的原始PH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH,边加边搅拌，并随时用PH试纸测基PH直到PH达到7.4-7.6。
反之用1mol/L HCl进行调节。
（4）分装将培养基分装入三个试管中和三角烧瓶中。
其试管装量不超过管高的1/5，三角烧瓶的量不超过1/2加塞培养基分装完毕后，在试管口和三角烧瓶口上塞上棉塞。
（5）包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，其外再用一道麻绳扎好。
用记号笔注明培养基名称、配制日期。
（6）灭菌将上述培养基以0.1Mpa,121℃,15min高压蒸气灭菌。
（7）倒平板，取三个已消毒的培养皿，在无菌操作台上用三角烧瓶中的培养基倒制三个平板培养基，冷却。
（8）搁置斜面将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管口端搁在玻璃棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
2 接种大肠杆菌斜面种子(1) 取实验室储备的大肠杆菌BL21种子，在酒精灯附近，用接种环在已制备好的斜面上接种上大肠杆菌。
(2) 将接种好的斜面放入37℃的恒温培养箱子中培养24h。
3 制备平板种子(1) 在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌的斜面，用无菌生理盐水将菌种冲洗下来，再用无菌生理盐水将其梯度稀释为1倍，10倍，100倍和1000倍，用移液枪分别吸取各梯度的溶液涂布平板(每个梯度涂布三个平板，每次吸取溶液100ul)，然后在37℃培养箱中过夜。
大肠杆菌如何培养大肠杆菌（Escherichia coli）是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阴性菌，是常见的肠道菌群中的一种。
大肠杆菌在科研领域和工业领域中非常重要，因为它作为一种模式微生物，广泛应用于基因工程、蛋白表达、酶制备、细胞生物学等领域的研究和应用。
培养大肠杆菌需要一定的培养基和条件，下面将介绍大肠杆菌的培养方法。
一、培养基的准备培养大肠杆菌所需的基本培养基是含有营养物质的培养液，如Luria-Bertani培养基（LB培养基）。
LB培养基的主要成分包括蛋白胨、酵母提取物、氯化钠和葡萄糖。
可以根据需要对LB培养基进行改良，如添加不同的抗生素以筛选转基因菌株。
二、大肠杆菌的分离和保存1.分离方法：（1）从样品中取一小部分，如土壤样品、水样或其他样品，制备10倍稀释系列。
（2）将每个稀释液均匀地涂布到含有LB培养基的琼脂平板上。
（3）将琼脂平板倒置放入37℃恒温培养箱中培养约12-24小时，直到出现菌落。
（4）将不同形态的菌落挑选出来，用成层排样法分离出单斑菌株。
2.保存方法：（1）利用冷冻保存：将单斑菌落接种到含有LB培养基和15%甘油的离心管中，混匀后急速冷冻到-80℃，并进行长期保存。
（2）利用冷冻干燥保存：将单斑菌落接种到含有LB培养基的离心管中，培养后在-80℃的环境下进行冷冻干燥。
三、大肠杆菌的液体培养1.悬浮培养：（1）从保存的冷冻物中，挑选适量的菌落接种到含有LB培养基的培养瓶中。
（2）将培养瓶放入37℃恒温摇床中以200-250rpm的振荡速度摇培养约8-12小时。
2.深层培养：（1）取一定量的培养液接种到含有LB培养基的试管中，将试管倾斜放置，使培养液接触空气。
（2）将试管放入37℃恒温培养箱中培养12-24小时，直到培养液产生沉淀。
四、大肠杆菌的固体培养1.斜面培养：（1）将大肠杆菌接种到含有LB培养基的琼脂平板上。
（2）将琼脂平板倒置放入37℃恒温培养箱中培养约12-24小时，直到出现菌落。
实验1 大肠杆菌的培养和分离——基础知识和操作过程梳理一、大肠杆菌细菌是单细胞的原核生物。
细菌细胞的结构有细胞壁、细胞膜、细胞质等。
细菌无成型的细胞核，细胞壁由肽聚糖组成。
由于细菌细胞壁结构不同，细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。
革兰氏阳性菌细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素；革兰氏阴性菌细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素。
革兰氏阳性菌对青霉素更为敏感。
大肠杆菌是革兰氏阴性、异养兼性厌氧型肠道杆菌。
在肠道中一般对人无害，但任何大肠杆菌进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。
大肠杆菌在基因工程技术中被广泛的应用，它的质粒是最常用的运载体，它也是基因工程中常用的受体细胞。
二、培养基配置微生物生命活动过程中需要的化合物有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。
有的化合物既是碳源又是氮源、能源。
生长因子是微生物生长不可缺少的微量有机物，但不一定需要外界补充，有的微生物可以自身合成。
在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对ph、特殊营养物质以及氧气的要求。
我们一般用lb液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在lb固体培养基上划线分离。
以下为本实验中培养基配置步骤： 1．称量：准确称取各成分。
蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加水50ml。
配置lb固体培养基时还需加1g 琼脂。
2．溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到50ml。
配置lb固体培养基时还需加琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。
3．调ph：用1mol/l naoh溶液调节ph至偏碱性。
4．灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml lb液体培养基和50ml lb固体培养基，加上棉塞。
将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。
5．倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至60℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。
其过程是：①将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；③用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。
倒过来放置的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。
向培养皿中转移已灭菌的培养基时，也不要把培养基沾在皿壁上。
否则，空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。
三、灭菌和消毒 1．无菌技术：①对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；②将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；③为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰旁进行；④避免已灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
2．消毒方法：①日常生活经常用到的是煮沸消毒法；②对一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法；③对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒石炭酸或煤酚皂等溶液以增强消毒效果，然后使用紫外线进行物理消毒；④实验操作者的双手使用酒精进行消毒。
3．灭菌方法：①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；②培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅；③表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。
4．比较消毒和灭菌：——基础知识和操作过程梳理一、大肠杆菌细菌是单细胞的原核生物。
细菌细胞的结构有细胞壁、细胞膜、细胞质等。
细菌无成型的细胞核，细胞壁由肽聚糖组成。
由于细菌细胞壁结构不同，细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。
革兰氏阳性菌细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素；革兰氏阴性菌细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素。
革兰氏阳性菌对青霉素更为敏感。
大肠杆菌是革兰氏阴性、异养兼性厌氧型肠道杆菌。
在肠道中一般对人无害，但任何大肠杆菌进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。
大肠杆菌在基因工程技术中被广泛的应用，它的质粒是最常用的运载体，它也是基因工程中常用的受体细胞。
二、培养基配置微生物生命活动过程中需要的化合物有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。
有的化合物既是碳源又是氮源、能源。
生长因子是微生物生长不可缺少的微量有机物，但不一定需要外界补充，有的微生物可以自身合成。
在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对ph、特殊营养物质以及氧气的要求。
我们一般用lb液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在lb固体培养基上划线分离。
以下为本实验中培养基配置步骤： 1．称量：准确称取各成分。
蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加水50ml。
配置lb固体培养基时还需加1g 琼脂。
2．溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到50ml。
配置lb固体培养基时还需加琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。
3．调ph：用1mol/l naoh溶液调节ph至偏碱性。
4．灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml lb液体培养基和50ml lb固体培养基，加上棉塞。
将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。
5．倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至60℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。
其过程是：①将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；③用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。
倒过来放置的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。
向培养皿中转移已灭菌的培养基时，也不要把培养基沾在皿壁上。
否则，空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。
三、灭菌和消毒 1．无菌技术：①对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；②将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；③为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰旁进行；④避免已灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
2．消毒方法：①日常生活经常用到的是煮沸消毒法；②对一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法；③对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒石炭酸或煤酚皂等溶液以增强消毒效果，然后使用紫外线进行物理消毒；④实验操作者的双手使用酒精进行消毒。
3．灭菌方法：①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；②培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅；③表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。
4．比较消毒和灭菌：——基础知识和操作过程梳理一、大肠杆菌细菌是单细胞的原核生物。
细菌细胞的结构有细胞壁、细胞膜、细胞质等。
细菌无成型的细胞核，细胞壁由肽聚糖组成。
由于细菌细胞壁结构不同，细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。
革兰氏阳性菌细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素；革兰氏阴性菌细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素。
革兰氏阳性菌对青霉素更为敏感。
大肠杆菌是革兰氏阴性、异养兼性厌氧型肠道杆菌。
在肠道中一般对人无害，但任何大肠杆菌进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。
大肠杆菌在基因工程技术中被广泛的应用，它的质粒是最常用的运载体，它也是基因工程中常用的受体细胞。
二、培养基配置微生物生命活动过程中需要的化合物有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。
有的化合物既是碳源又是氮源、能源。
生长因子是微生物生长不可缺少的微量有机物，但不一定需要外界补充，有的微生物可以自身合成。
在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对ph、特殊营养物质以及氧气的要求。
我们一般用lb液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在lb固体培养基上划线分离。
以下为本实验中培养基配置步骤： 1．称量：准确称取各成分。
蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加水50ml。
配置lb固体培养基时还需加1g 琼脂。
2．溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到50ml。
配置lb固体培养基时还需加琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。
3．调ph：用1mol/l naoh溶液调节ph至偏碱性。
4．灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml lb液体培养基和50ml lb固体培养基，加上棉塞。
将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。
5．倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至60℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。
其过程是：①将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；③用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。
倒过来放置的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。
向培养皿中转移已灭菌的培养基时，也不要把培养基沾在皿壁上。
否则，空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。
三、灭菌和消毒 1．无菌技术：①对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；②将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；③为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰旁进行；④避免已灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
2．消毒方法：①日常生活经常用到的是煮沸消毒法；②对一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法；③对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒石炭酸或煤酚皂等溶液以增强消毒效果，然后使用紫外线进行物理消毒；④实验操作者的双手使用酒精进行消毒。
3．灭菌方法：①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；②培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅；③表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。
4．比较消毒和灭菌：——基础知识和操作过程梳理一、大肠杆菌细菌是单细胞的原核生物。
细菌细胞的结构有细胞壁、细胞膜、细胞质等。
细菌无成型的细胞核，细胞壁由肽聚糖组成。
由于细菌细胞壁结构不同，细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。
革兰氏阳性菌细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素；革兰氏阴性菌细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素。
革兰氏阳性菌对青霉素更为敏感。
大肠杆菌是革兰氏阴性、异养兼性厌氧型肠道杆菌。
在肠道中一般对人无害，但任何大肠杆菌进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。
大肠杆菌在基因工程技术中被广泛的应用，它的质粒是最常用的运载体，它也是基因工程中常用的受体细胞。
二、培养基配置微生物生命活动过程中需要的化合物有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。
有的化合物既是碳源又是氮源、能源。
生长因子是微生物生长不可缺少的微量有机物，但不一定需要外界补充，有的微生物可以自身合成。
在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对ph、特殊营养物质以及氧气的要求。
我们一般用lb液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在lb固体培养基上划线分离。
