条件性基因敲除的基本原理Cre

条件性敲除的原理（图2，3）：利用Cre／LoxP 和来自酵母的FLP—frt 系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型[7]。

通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上loxP 的(“loxP floxed”)ES 细胞产生“loxPfloxed”小鼠,然后，通过将“lo xP floxed”小鼠与Cre 转基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre 重组酶)，产生靶基因发生特定方式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。

在“loxP floxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，故“1oxP noxed”小鼠表型仍同野生型的一样。

但当它与Cre 转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有“loxP floxed”靶基因和Cre 基因。

Cre 基因表达产生的Cre 重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP 间发生切除反应，结果将一个loxP 和靶基因切除。

这样，靶基因的修饰(切除)是以Cre 的表达为前提的。

Cre 的表达特性决定了靶基因的修饰(切除)持性：即Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修饰(切除)就发生在哪种组织细胞；而Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。

所以只要控制Cre 的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度[9,10]。

在生理学研究中，为了明确某一组织或器官的功能，常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除，进而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切除部分的功能。

生命科学发展到今天，人们对于生命现象的认识已经逐步深入到了分子水平，而上述的“部分切除—观察整体—推测功能”的研究思想仍然有效。

具体地说，就是在分子水平破坏想要研究的基因，然后观察生物体的生理指标、功能、整体形态、组织结构、发育过程的变化等，进而推测相应基因的功能。

这种研究过程称为基因敲除(gene knock out)。

条件性敲除小鼠（CKO）原理、构建与应用基因敲除小鼠作为研究基因功能重要工具，应用十分广泛，然而实际操作中大家常常遇到这样问题：①靶基因敲除造成小鼠胚胎致死无法生育；②研究靶基因在某一阶段或者某一个组织的表达情况，那么全敲小鼠并不能满足我们的研究要求。

条件性基因敲除小鼠（CKO）就应运而生了，完美地解决了上面2个棘手问题。

今天，我们就为大家介绍一下条件性基因敲除小鼠的原理、构建、鉴定与应用。

一、条件性敲除小鼠（Conditional knockout mice, CKO）原理条件性基因敲除小鼠：使靶基因缺失仅发生于小鼠生命周期的某一阶段或某一特定的组织，而在其它组织或细胞表达正常，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。

如下为全敲和条件性敲除的对比：1. 技术原理通过染色体位点特异性重组酶系统Cre-LoxP或Flp-FRT来实现的。

在待敲除目的基因一个或多个重要外显子两端各放置一个LoxP （或FRT）序列，得到flox（Flankedby LoxP)小鼠。

将flox小鼠与带有组织特异性表达的Cre(或Flp)的小鼠交配繁殖，以获得在特定组织里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。

鉴于这2种技术基本原理一致，Cre-LoxP系统更多用于动物体内编辑，下面就以Cre-LoxP具体介绍。

2. Cre/LoxP系统组成Cre-LoxP系统源于 P1噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。

该系统含有两种成分：LoxP位点：一段长34bp的DNA序列，为重组酶识别的位点：含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。

Cre重组酶：为一种酶，由343个氨基酸组成的单体蛋白；具有位点特异性，可使LoxP片段间的基因序列被删除或重组。

根据LoxP位点方向分以下三类重组方式：⑴两个LoxP位点方向相同：如果两个LoxP位点位于一条DNA 链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；如图下①所示。

．概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。

通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。

随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。

2．实现基因敲除的多种原理和方法：2．1．利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。

80年代初，胚胎干细胞<ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。

1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。

到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。

直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。

2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1>：a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等>的载体上，成为重组载体。

基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。

b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。

常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。

而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。

[2，3] ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射>导入同源的胚胎干细胞(ES cell>中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。

一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。

基因敲除技术的主要方法和步骤有哪些？基因敲除是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。

它是针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物遗传基因，令特定的基因功能丧失，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。

目前能实现基因敲除的方法有：1.运用基因同源重组进行基因敲除(1)步骤方法A 构建基因载体：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因的载体上，使之成为重组载体，常用的标记基因有：neo 基因、TK 基因等。

根据实验目的不同，打靶载体分为全基因敲除、条件敲除、基因敲进、诱导性基因敲除等打靶载体。

B获得胚胎干细胞：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔、猪、鸡等的胚胎干细胞也有使用。

基因敲除一般应用于鼠，常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。

有些科研机构和单位已经运用C57BL/6遗传背景的小鼠的胚胎干细胞进行基因打靶，广泛运用于免疫学、神经学、癌症等领域。

C同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。

一般来说，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但操作便利。

D筛选已表达的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极低，因此要从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞。

目前常用的方法有：正负筛选法(PNS法)、标记基因的特异位点表达法以及PCR 法，其中应用最多的是PNS法。

E 性状观察：通过观察重组小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。

基因敲除技术(组图)一．概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。

通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。

随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA ，它们同样可以达到基因敲除的目的。

二．实现基因敲除的多种原理和方法：1．利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。

80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。

1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。

到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。

直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。

(1)利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)：①．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。

基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。

②．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。

常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。

而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。

[2，3]③．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。

一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。

转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。

尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。

二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。

同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。

【干货】诱导型条件性基因敲除介绍在上上上上次，我们为大家简单的介绍了Cre-loxP重组酶系统，知道了条件性基因敲除策略主要是基于Cre-loxP系统，并且还可以通过它来实现在特定组织细胞中or在动物的特定发育时期对目的基因敲除。

那么，如何随心所欲地实现时空上的条件性基因敲除呢？让我为您一一道来！条件性基因敲除小鼠首先，在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个Loxp序列，得到flox小鼠。

然后，将flox小鼠与带有组织特异性表达Cre的小鼠交配繁殖，以获得在特定细胞里把目标基因敲除的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。

对于在特定组织细胞中的基因敲除，我们应该能够理解，主要取决于所选择的启动子。

利用组织特异性表达的启动子调控Cre重组酶的表达，就可以实现相应部位特定基因的敲除。

另外，某些启动子（即诱导型启动子）也可以受某些外源性化学物质的调控，外源性调控的基因敲除可以避免在胚胎发育早期由于基因功能的异常所产生的副作用，如荷尔蒙诱导系统、他莫西酚依赖的雌激素突变体启动子和四环素调节系统等。

这其中最频繁使用的是四环素系统（Tet-Off System/Tet-On System）和他莫昔芬系统（Tamoxifen System）。

四环素诱导的Cre-loxP系统四环素诱导的条件性基因敲除系统包含两个互补系统，tTA依赖（tetracycline-controlled transactivator protein (tTA) dependent）和rtTA依赖（reverse tetracycline-controlled transactivator protein (rtTA) dependent）的基因敲除系统，现在又称为Tet-Off系统和Tet-ON系统。

Fig.1 Tetracycline-inducible system[1](a) Tet-Off system. tTA is active without Dox (or tetracycline), and the gene of interest is expressed. With Dox (or tetracycline) treatment, tTA is inactivated, and the gene is no longer expressed.(b) Tet-On system. rtTA is inactive without Dox(or tetracycline), and the gene of interest is not expressed. With Dox (or tetracycline) treatment, rtTA is activated, and the gene is expressed.在这两个系统中，四环素（tetracycline）或其衍生物多西环素（强力霉素Dox）控制转录激活子tTA或rtTA与启动子Ptet结合，从而调控下游基因的表达。

CRE重组酶的工作原理引言在生物学领域，基因编辑技术是一项革命性的技术，它可以精确地修改生物体的基因组。

CRE重组酶是一种常用的基因编辑工具，它可以在特定的DNA序列上催化重组反应，实现基因组的特定切除、插入或替换。

本文将详细探讨CRE重组酶的工作原理，包括结构、功能机制以及应用领域。

一、CRE重组酶的结构CRE重组酶是一种DNA重组酶，属于乳酸杆菌家族的重组酶。

它由38个氨基酸组成，形成一个螺旋状结构。

CRE重组酶的结构中包含两个重要的结构域：DNA结合结构域和催化结构域。

1. DNA结合结构域CRE重组酶的DNA结合结构域是通过与DNA靶标的特定序列结合来实现基因组的重组。

这个结构域具有高度的特异性，可以识别并与CRE重组酶特异的DNA序列结合。

DNA结合结构域的结构非常稳定，并且可以与DNA形成特异的氢键和范德华力。

2. 催化结构域CRE重组酶的催化结构域是实现DNA重组的关键部分。

在催化结构域中，CRE重组酶通过催化水解反应，将DNA的磷酸二酯键切断，从而实现DNA的切除、插入或替换。

催化结构域中含有一些重要的氨基酸残基，它们与DNA结合后能够催化水解反应的进行。

二、CRE重组酶的工作机制CRE重组酶的工作机制涉及到多个步骤，包括DNA结合、催化反应和DNA修复。

下面将详细介绍CRE重组酶的工作机制。

1. DNA结合CRE重组酶首先通过与CRE DNA序列的特定部分结合，形成CRE-酶复合物。

这个DNA结合过程是通过DNA结合结构域与DNA序列的特定碱基配对实现的。

DNA结合后，CRE重组酶会发生构象变化，使得催化结构域与DNA的切割位点相互靠近。

2. 催化反应在DNA结合后，CRE重组酶的催化结构域会催化DNA的切割反应。

催化结构域中的氨基酸残基与DNA形成氢键和范德华力，从而使得DNA的磷酸二酯键发生水解反应。

这个反应导致DNA链的切断，从而实现基因组的切除、插入或替换。

3. DNA修复DNA切割后，CRE重组酶会离开DNA链，使得DNA链的两端暴露在细胞质中。