研究生高级生化与分子生物学讲义

分子生物学Molecular Biology赵青天津科技大学生物工程学院Email: zhao_qing@前情回顾3. RNA的生物合成Transcription3.4 启动子和转录起始3.5 RNA转录的后加工3.6 RNA的编辑、再编码和化学修饰启动子（promoter ）是指RNA 聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA 序列（它含有RNA 聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列）。

3.4 启动子和转录起始原核生物真核生物转录起点是指与新生RNA 链第一个核苷酸相对应DNA 链上的碱基（以数字+1表示）。

3.4 启动子和转录起始原核生物真核生物聚合酶在此处与DNA结合成稳定的复合物，解开双链形成开放型起始结构。

聚合酶起始识别区，与σ因子相互作用。

TATA区---是转录精确地起始。

CAAT区和GC区---控制转录起始的频率，基本不参加起始位点的确定。

启动子预测软件有CpGPlot、CpGPrediction、Promoter 2.0、 Promotorscan等。

3.5 RNA转录的后加工原核生物RNA转录后的加工rRNA和tRNA在转录完成后，加工方式可分为3类：（1）rRNA及tRNA分子由某些新生RNA链的裂解形成。

（2）在tRNA链末端加上核苷酸（CCA）3’5’（3）碱基的修饰rRNA的碱基会被甲基化（如m C）。

tRNA分子中均含有稀有碱基，它们是由tRNA前体中的常见核苷酸经酶促修饰而成。

原核生物与真核生物mRNASD序列5’上游非编码区3’下游非编码区真核生物RNA 转录后的加工mRNA 的转录后加工： 1.加帽2.加尾3.剪接 磷酸酶 甲基化酶m 7GTP核酸外切酶RNA 末端腺苷酸转移酶RNA的剪接位点&方式I类自我剪接II类自我剪接剪接体催化的剪接5’剪接位点：内含子的5’末端3’剪接位点：内含子的3’末端分支点：位于3’剪接位点上游20－50个核苷酸之间，通常是A。

《分子生物学》讲稿课程简介课程编号：总学时数：80 周学时:6开课学期：第7学期学分：5本课程是生物科学专业一门重要的专业基础课，主要内容是通过对分子生物学的基本概念、基本理论和基本技能进行系统的阐述，注重学科体系的建立和发展过程，以DNA的结构及功能为主线，以基因表达及调控为视点，加大利用科学实验理解分子生物学概念和理论的内容，把基础知识和前沿技术有机地结合在一起。

考试方式：闭卷考试预修课程：生物化学、细胞生物学教材：现代分子生物学（第三版），朱玉贤等(注：为专科学习时采用的教材)Gene VIII （Benjamin Lewin主编）(注：为接本时的补充教材)教学参考书：1 ．Molecular Biology of the Cell (4th Edition by B Alberts)2．Molecular Cell Biology (4th Edition by H Lodish)3．Molecular Biology (2nd Edition by R Weaver)4．分子生物学(Instant Notes in Molecular Biology, 2nd Edition by P Turner）5．Advanced Molecular Biology (by R Twyman)6. 分子细胞生物学（第二版），韩贻仁，山东大学出版社7. Genomes 2, T. A.布朗著，袁建刚等译，科学出版社学时分配表理论课65学时章次内容学时一绪论 3二 DNA是遗传物质 3三 DNA的结构 3四 DNA复制和分子杂交 6五基因突变和修复8六遗传重组 8七基因组及基因作图8八基因转录和RNA加工 9九蛋白质合成 6十基因表达调控 9《分子生物学》理论课程内容课程要求: 按照知识点进行介绍;不拘泥于形式;互相学习，可以随时打断，随时质疑;要求能够在掌握一些知识的情况下熟悉分子生物学的基本原理和技术;要能够提出问题和建议;能自己进行实验设计和结果分析1 绪论［基本要求］通过本部分的学习，学生应对分子生物学的主要研究内容有一个全面系统地了解，对分子生物学的主要研究对象（基因、基因组、染色体）有一个全面的了解。

《生物化学与分子生物学》教学大纲一、课程的性质和任务生物化学与分子生物学是研究生命化学的科学，它在分子水平探讨生命的本质，即研究生物体的分子结构与功能、物质代谢及其在生命活动中的作用。

生物化学与分子生物学是高等医学院校全科医学专业的必修课之一。

本课程主要向学生传授生物大分子的化学组成、结构及功能；物质代谢；遗传信息的贮存、传递与表达；血液、肝的生物化学；分子生物学基本概念、原理和技术等生命科学内容，为医学生深入学习其他医学基础课、临床医学课程乃至毕业后的继续教育、医学各学科的研究工作中在分子水平上探讨疾病的病因、发病机理及疾病诊断、预防、治疗奠定理论与实验基础。

二、课程教学的基本要求通过本课程的学习，使学生知道及理解生物分子的结构与生理功能，以及两者之间的关系。

理解生物体重要物质代谢的基本途径，主要生理意义、以及代谢异常与疾病的关系。

理解基因信息传递的基本过程，理解各组织器官的代谢特点及它们在医学上的意义，了解分子生物学基本概念、原理和技术。

本课程教材适用于医学高等专科教育三年制全科医学专业，在第一学期开设，理论课55学时、实验课12学时，总学时为67学时。

四、教学内容与要求绪论【教学内容】第一节生物化学发展简史第二节当代生物化学研究的主要内容第三节生物化学与医学【教学要求】掌握：生物化学和分子生物学的概念.熟悉：生物化学和分子生物学研究的主要内容及其与医学的关系。

了解：生物化学的发展史。

第一章蛋白质的结构与功能【教学内容】第一节蛋白质的分子组成一、组成蛋白质的主要元素，氮的含量及应用。

组成蛋白质的氨基酸种类、结构通式；氨基酸的分类及结构特点；氨基酸的两性电离、紫外吸收性质及茚三酮反应。

二、肽和肽键，多肽链及N、C末端，主链骨架的概念。

第二节蛋白质的分子结构一、蛋白质的一级结构：肽键二、蛋白质的二级结构：维持蛋白质构象的化学键、肽单元、α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲。

三、蛋白质的三级结构：结构域四、蛋白质的四级结构：亚基五、蛋白质的分类。

《生化与分子生物学》实验讲义天津医科大学生物医学工程系2005年实验一自抗凝血中提取哺乳动物细胞基因组DNA一、实验目的1、了解核酸的基本特性。

2、掌握DNA提取和鉴定的方法。

二、实验原理核酸的分离与提取是分子生物学研究中很重要的基本技术，核酸样品的质量可能直接关系到后续实验的成败。

核酸包括DNA、RNA两种分子，在真核细胞中都是以与蛋白质相结合的状态存在（DNA与组蛋白形成核小体，再折叠缠绕成染色体），真核生物基因组DNA 为双链线性分子，存在于细胞核内。

基因组DNA的提取需经过DNA的释放（破膜）、DNA与蛋白质的分离，DNA的沉淀等过程。

分离纯化核酸的总原则：1、保证核酸一级结构的（核苷酸序列）的完整性，全部的遗传信息均储存在一级结构中。

2、排除其它分子的污染。

a)对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。

b)生物大分子：蛋白质、多糖和脂质。

c)其它核酸分子：RNA.三、实验试剂1、TKM缓冲液10 mmol/L Tris-HCl pH 7.6 （Tris 三羟甲基氨基甲烷）10 mmol/L KCl2 mmol/L EDTA4 mmol/L MgCl22、TE缓冲液10 mmol/L Tris-HCl1 mmol/L EDTA pH 8.03、10％SDS4、饱和氯化钠四、实验步骤1、取0.5ml EDTA抗凝的全血于清洁的1.5ml Eppendorf离心管中。

2、加入0.5ml TKM缓冲液，13μl Triton X-100（终浓度为1.2％），颠倒混匀。

在台式离心机上离心，5,000rpm×10分钟。

（低渗破红细胞膜）。

3、倾去上清液，在离心管中加入1.0ml TKM缓冲液，混匀后离心，5,000rpm ×10分钟，重复步骤3两次。

（清洗）4、于沉淀中加入200μl TKM缓冲液和15μl 10％SDS（终浓度为0.7％），混匀后于55℃保温20分钟。

（破白细胞膜）注：此步中可加入少量蛋白酶K。

研究生分子生物学实验讲义分子生物学实验讲义硕士研究生试用教材(第三版)南方医科大学生物化学与分子生物学教研室二OO六年五月分子生物学实验讲义硕士研究生试用教材（第三版）编写人员 (按姓氏笔画排列)冯春琼朱利娜吴清华宋艳斌张兴梅李凌肖应庆肖维威姜立胡子有郭秋野彭翼飞南方医科大学生物化学与分子生物学教研室二OO六年五月1前言分子生物学是二十世纪末发展最快的生命科学，其理论与技术的进步，不仅加速了自身体系的更新，同时也带动了医学科学的变革。

随着科技的日新月异，分子生物学的研究手段也得到相应发展，PCR技术、克隆技术、基因芯片技术等的涌现，使得分子生物学溶入到生命科学的各个领域，并发挥着巨大作用。

分子生物学是实践性非常强的一门课程，众多的理论知识必须在实验中进行验证，才能深刻地理解与应用。

开设分子生物学实验选修课程，是医学院校研究生层次人才培养的必要组成。

为适应新形式下研究生教学的需要，我们在完善实验室仪器配置标准化的同时，安排了以基因重组体的构建为主线的一系列实验内容，旨在让研究生掌握分子生物学基本技术操作的同时，并能有严谨的实验思路，具备一定的分子生物学科研思维，避免在课题设计上出现不必要的误差。

此次编写的讲义，必然会有欠缺与不足，我们会在今后的工作中不断修正与补充。

希望大家对本门课程提出宝贵意见，以帮助我们更好的开展分子生物学实验的教学工作。

生物化学与分子生物学教研室二OO六年五月2目录第一章基因克隆载体的制备 (1)实验一：质粒DNA的抽提与纯化……………………………… 1 实验二：质粒DNA的鉴定 (6)第二章目的基因的获取 (8)实验三：基因的PCR技术…………………………………………8 实验四：DNA限制性酶切技术……………………………………10 实验五：酶切产物的鉴定................................................ 12 实验六：酶切产物的回收 (15)第三章基因重组子的构建 (19)实验七：DNA重组连接...................................................19 实验八：T载体应用时的DNA重组连接........................... 25 实验九：重组DNA的转化............................................. 29 实验十：重组子的鉴定 (31)第四章SDS－PAGE检测蛋白 (34)实验十一：蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (34)第五章附录 (38)第一章基因克隆载体的制备实验一：质粒DNA的抽提与纯化目的：原理：采用碱变性法，学习小规模制备质粒DNA的技术，碱变性抽提质粒DNA的质粒DNA是基于染色体DNA与变性与复性的差异而达到分离目的。

分子生物学实验讲义掌握质粒DNA小量快速提取法；了解DNA限制性核酸内切酶酶切鉴定原理。

质粒( plasmid )是一种染色体外的稳定遗传因子。

其分子量大小在1－200kb 之间。

是具有双链闭合环状结构的DNA分子，质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。

质粒一般独立游离在细胞质内，也可整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能却赋予宿主细胞某些表型。

所有分离质粒DNA勺方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠( Sodium dodecylsulfate, SDS )可使细胞壁裂解。

细菌经溶菌酶和阴离子去污剂( SDS处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。

再经酒精沉淀、洗涤处理，可得到质粒DNA。

共价闭环DNA( covalently closed circular DNA ，简称cccDNA 质粒以超螺旋形式存在。

若两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的DNA分子叫作开环DNA( open circular DNA, 简称ocDNA。

在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA勺泳动速度都快，因此在本实验中，质粒DNA在电泳凝胶中呈现 3 条区带。

限制性内切酶是分子生物学研究中的一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度的DNA片段。

如：EcoRI和Hi nd?的识别序列和切口是：EcoR?：G?AATTCHind?：A?AGCTT限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。

《分子生物学》实验讲义实验一分子生物学实验基础知识及常用仪器介绍实验二质粒DNA分离纯化实验三琼脂糖凝胶电泳实验四聚合酶链反应(PCR)检测质粒DNA实验五限制酶切鉴定质粒DNA实验一分子生物学实验基础知识及常用仪器介绍一、实验目的了解分子生物学实验特点，了解分子生物学实验室常用设备及基本实验操作。

二、实验内容1.分子生物学实验知识⑴严格操作规程分子生物学实验一般比较复杂，如所用试剂多、操作步骤多、实验时间长等，因此为保证实验效果，在实验室中一定要有整体观念，严格按照操作规程进行。

⑵耐心细致操作实验中不能急于求成，特别是对于初入门者，应反复操作，积累经验。

⑶习惯微量操作在分子生物学实验中，试剂的用量往往很少，常常细到1ul液体、ug或ng固体，这是平常肉眼很难看到的，所以刚刚接触实验的人往往感到不习惯，总是担心要取的东西能否看到、准不准确，操作的样品会不会丢失，总是想加大反应体积，以为越多越好。

这些观念都是错误的。

只有定时定量加入液体，才能保证实验成功，所以平时应加以练习，逐渐建立微量操作的观念才能解决好问题。

⑷防止实验污染分子生物学实验的对象主要是核酸，不同生物材料的DNA和DNA之间，不同的样品之间，核酸酶等蛋白酶与核酸之间，产物与反应物之间都有可能造成污染，最终导致实验的失败。

故要从所用试剂、仪器设备、耗材及操作人员等方面进行防止污染的操作。

⑸正确处理试剂分子生物学实验中对试剂的要求十分严格，包括试剂的等级、配制、除菌储备等各方面均有严格要求。

⑹注意实验安全分子生物学实验中，操作者常会接触一些对人体有害的试剂，必须实验安全要求进行实验操作，否则会给实验室甚至整个人类带来巨大的危害。

2.分子生物学实验常用仪器介绍⑴微量取液器⑵水纯化装置（离子交换器、超纯水装置）⑶离心机（低速、高速、超速）⑷电泳装置（电泳仪、电泳槽）⑸灭菌设备（高压蒸汽灭菌锅、过滤除菌器）⑹超净工作台⑺PCR仪⑻凝胶成像系统（紫外分析仪、核酸凝胶电泳图谱的记录）⑼温度控制设备（冷冻设备、培养箱、水浴箱、烤箱）⑽其它设备（紫外可见分光光度计、微波炉、凝胶干燥器、真空干燥仪）3.分子生物学基本实验操作⑴基因组DNA的分离与纯化（核酸浓度和纯度测定）⑵真核细胞mRNA的分离与纯化⑶质粒DNA的提取⑷PCR基因扩增实验⑸限制性内切酶酶切实验⑹DNA重组技术⑺DNA转移技术⑻DNA测序：化学法、双脱氧链终止法⑼核酸探针的制备技术：末端标记、PCR法制探针、非放射性探针⑽分子杂交技术：Southern印迹、Northern印迹和Western印迹4.微量移液器的使用可调节微量移液器标准操作程序（适用的液体：水、缓冲液、稀释的盐溶液和酸碱溶液）：⑴调节数字至所需体积；⑵装上吸嘴（不同规格的移液器用不同的吸头），注意气密性）；⑶按到第一档，垂直进入液面几毫米；⑷缓慢松开控制按钮（否则液体进入吸头过速会导致液体倒吸入移液器内部吸入体积减少）；⑸停顿1s后将吸嘴提离开液面；⑹平稳按压打出液体。

一、名词解释1、基因：能够表达和产生蛋白质和RNA的DNA序列，是决定遗传性状的功能单位。

2、基因组：细胞或生物体的一套完整单倍体的遗传物质的总和。

3、端粒：以线性染色体形式存在的真核基因组DNA末端都有一种特殊的结构叫端粒。

该结构是一段DNA序列和蛋白质形成的一种复合体，仅在真核细胞染色体末端存在。

4、操纵子：是指数个功能上相关的结构基因串联在一起，构成信息区，连同其上游的调控区（包括启动子和操纵基因）以及下游的转录终止信号所构成的基因表达单位，所转录的RNA为多顺反子。

5、顺式作用元件：是指那些与结构基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的特异DNA序列。

包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等。

6、反式作用因子：是指真核细胞内含有的大量可以通过直接或间接结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子。

7、启动子：是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。

8、增强子：位于真核基因中远离转录起始点，能明显增强启动子转录效率的特殊DNA序列。

它可位于被增强的转录基因的上游或下游，也可相距靶基因较远。

9、基因表达：是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质，进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程。

10、信息分子：调节细胞生命活动的化学物质。

其中由细胞分泌的调节靶细胞生命活动的化学物质称为细胞间信息分子；而在细胞内传递信息调控信号的化学物质称为细胞内信息分子。

11、受体：是存在于靶细胞膜上或细胞内能特异识别生物活性分子并与之结合，进而发生生物学效应的的特殊蛋白质。

12、分子克隆：在体外对DNA分子按照即定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入合适宿主，使其在宿主中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。

13、蛋白激酶：是指能够将磷酸集团从磷酸供体分子转移到底物蛋白的氨基酸受体上的一大类酶。

14、蛋白磷酸酶：是具有催化已经磷酸化的蛋白质分子发生去磷酸化反应的一类酶分子，与蛋白激酶相对应存在，共同构成了磷酸化和去磷酸化这一重要的蛋白质活性的开关系统。

研究⽣⾼级⽣化与分⼦⽣物学讲义NAD/NADH 和NADP/NADPH对细胞功能和细胞死亡的调节和⽣物学影响Ⅰ.前⾔Ⅱ.NAD和NADP代谢A.NAD和NADP的主要介绍B.NAD的合成C.NADP的合成D.NAD和NADP的分解代谢E.NAD和NADP之间的关系F.NAD通过线粒体膜的运输G.NAD通过细胞质膜的运输Ⅲ. NAD和NADP的⽣物学功能A.NAD和NADP的⽣物学功能的⼀般介绍B.NAD和NADP的抗氧化作⽤和氧化应激C.NAD和NADP在钙平衡中的作⽤D.NAD和NADP在能量代谢和线粒体功能中的作⽤E.NAD和NADP对基因表达的影响F.NAD和NADP的免疫功能G.NAD和NADP在⾎管活动中的作⽤H.NAD和NADP在致癌和癌症治疗中的作⽤I.NAD和NADP在衰⽼中的作⽤Ⅳ. NAD和NADP参与细胞死亡A.PARP-1 和NAD在细胞死亡中的作⽤B.PARG在细胞死亡中的作⽤C.NAD在细胞凋亡中的作⽤D.NAD在轴突变性中的作⽤E.AIF 和GADPH在细胞死亡中的作⽤F.NADP在细胞死亡中的作⽤Ⅴ. NAD和NADP的治疗作⽤A.NAD+前体的治疗作⽤B.NAD+的治疗作⽤C.NADH的治疗作⽤D.NADPH氧化酶的治疗修饰作⽤Ⅵ. 结论摘要⼤量的证据表明NAD（NAD+和NADH）和NADP（NADP+和NADPH）是许多⽣物学过程如能量代谢、线粒体功能、钙平衡、抗氧化作⽤⁄氧化应激的形成、基因表达、免疫功能、衰⽼和细胞死亡的主要调节物质。

⾸先，NAD参与了能量代谢和线粒体功能的调节；其次，NADPH是细胞抗氧化系统的⼀个关键组份，并且在线粒体上依赖于NADH的活性氧簇的形成和依赖于NADPH氧化酶活性氧的形成是活性氧⽣成的两个关键代谢机制；第三，ADP-核糖和⼀些其它的由NAD和NADP衍化⽽来的分⼦能够参与钙平衡；第四，NAD 和NADP能够调节细胞死亡的多个关键因⼦，如线粒体通透性的改变、能级、ADP-核糖聚合酶-1、和凋亡诱导因⼦；第五NAD和NADP 对衰⽼影响因⼦如氧化应激和线粒体活动具有重要作⽤，此外，依赖于NAD的sirtuins也参与了衰⽼过程。

高级生化与分子生物学高级生化与分子生物学是现代生物学领域中两个重要的研究方向。

高级生化是生物化学的一个分支，研究生物分子的结构、功能和相互作用，以及生物分子参与的生物化学反应和代谢途径。

分子生物学则关注生物体内生物分子的合成、修饰、复制和传递等过程，以及这些过程对生物体结构和功能的影响。

高级生化与分子生物学的关系密切，相互促进，共同推动了生物科学的发展。

下面将分别介绍高级生化和分子生物学的研究内容和应用。

高级生化研究的核心是生物分子的结构和功能。

生物分子包括蛋白质、核酸、多糖和脂质等。

蛋白质是生物体内最重要的功能分子，参与几乎所有生命活动。

高级生化研究通过研究蛋白质的结构，揭示其功能。

例如，通过X射线晶体学和核磁共振等技术，可以确定蛋白质的三维结构，从而了解其功能和相互作用。

此外，高级生化还研究蛋白质的合成、修饰和降解等过程，以及蛋白质与其他生物分子之间的相互作用。

这些研究为药物设计和疾病治疗提供了理论基础。

分子生物学是研究生物体内生物分子的合成和传递过程的学科。

分子生物学的重要研究对象是DNA和RNA。

DNA是生物体内遗传信息的载体，RNA则参与了基因转录和翻译等重要过程。

分子生物学通过研究DNA和RNA的结构和功能，揭示基因组的组织和表达，以及遗传信息的传递和转录调控等机制。

例如，通过PCR技术可以扩增特定基因片段，从而进行基因诊断和遗传学研究。

此外，分子生物学还研究了细胞分裂和凋亡等重要生物学过程，揭示了细胞分裂的调控机制和凋亡途径。

高级生化与分子生物学的研究在许多领域有着广泛的应用。

在医学领域，高级生化和分子生物学的研究为疾病的诊断和治疗提供了重要的理论和技术基础。

例如，通过研究疾病相关蛋白质的结构和功能，可以设计和开发特定的药物靶点，从而实现个体化治疗。

在农业领域，高级生化和分子生物学的研究为作物的品质改良和抗病虫害育种提供了理论指导和技术手段。

例如，通过转基因技术可以改良作物的抗病性和产量。