条件性基因敲除的策略

CDHR2基因条件性敲除小鼠模型的构建及鉴定夏梓元;蒋华波;王洋;黄美金;陆斌【摘要】目的:构建CDHR2基因条件性敲除小鼠模型,为研究CDHR2基因的生物学功能提供条件.方法:构建CDHR2基因条件打靶载体,电转入小鼠胚胎干细胞(ES 细胞),用G418和GANC筛选阳性细胞克隆.胚胎注射阳性ES细胞入小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠.嵌合体小鼠与Cre小鼠交配获得条件性敲除小鼠.分别通过PCR方法和免疫组织化学方法对CDHR2的敲除结果进行验证.结果:成功构建打靶载体,并获得6个正确同源重组的ES细胞阳性克隆.阳性ES细胞克隆注射入C57BL/6J小鼠的囊胚中,获得5只嵌合鼠.嵌合鼠再与Flp小鼠交配,获得6只阳性F1代去Neo 小鼠.去Neo小鼠与Cre小鼠杂交,获得CDHR2基因肠道特异性敲除小鼠.免疫组织化学检测表明,阳性小鼠肠道组织中的CDHR2基因被特异性敲除,而肾脏组织CDHR2基因的表达没有受到影响.结论:成功构建CDHR2基因肠道特异性敲除小鼠,为进一步研究CDHR2基因的作用奠定了基础.%Objective:To construct a CDHR2 conditional knockout mouse model, and to provide conditions for the study on biological function of CDHR2 gene.Methods:The conditional CDHR2 targeting vector was constructed and transfected into mouse embryonic stem (ES) cells by electroporation.The positive ES cells screened by G418 and GANC were microinjected into the blastocysts of C57BL/6J mice.The chimeric mice were obtained and then mated with Cre mice to obtain conditional CDHR2 knockout mice.The phenotype was analyzed by PCR and immunohistochemistry, respectively.Results:The conditional CDHR2 targeting vector was successfully constructed, with six positive clones of ES cells being obtained.The positive clones of ES cells weremicroinjected into blastocysts of C57BL/6J mice with 5 chimeric mice being obtained.The chimeric mice were mated with Flp mice, and 6 positive F1 generation mice without Neo gene were obtained.Finally, such mice were hybridized with Cre mice to obtain intestine-specific CDHR2 knockout mice.Immunohistochemistry assay showed that the CDHR2 gene in intestinal tracts of the positive mice was specifically knocked out.In contrast, the expression of CDHR2 in kidney tissue was notaffected.Conclusions:The successful construction of intestine-specific CDHR2 knockout mice has laid the foundation for provides a basis for further functional study on CDHR2 gene.【期刊名称】《中国临床医学》【年(卷),期】2017(024)002【总页数】5页(P176-180)【关键词】CDHR2;基因敲除;Cre/loxP系统【作者】夏梓元;蒋华波;王洋;黄美金;陆斌【作者单位】第二军医大学药学院生化药学教研室,上海 200433;第二军医大学药学院生化药学教研室,上海 200433;第二军医大学长海医院病理科,上海 200433;解放军成都军区昆明总医院肿瘤科,昆明 650010;第二军医大学药学院生化药学教研室,上海 200433【正文语种】中文【中图分类】R-33原钙黏蛋白(protocadherin,PCDH)家族是属于钙黏蛋白超家族中的一员，可以根据其基因结构分为集簇型PCDH和非集簇型PCDH两类[1]。

一、常规基因敲除鼠( Conventional Knockout )常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用 Neo Cassette 替换掉。

这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。

此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。

二、条件性基因敲除小鼠( Conditional Knockout )条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个 loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。

该小鼠和表达 Cre 酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。

当和组织特异性表达 Cre 酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。

条件性基因敲除鼠适用范围为：( 1 )该基因有胚胎致死性；( 2 )用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。

三、基因敲入小鼠( Knockin )基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。

此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。

一、 ZFN 技术制作基因敲除鼠ZFN 能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。

随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现 DNA 的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。

这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而 ZFN 的基因敲除效率能达到 10% 。

利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。

这项技术中设计特异性的 ZFN 是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的 ZFN，但 ZFN的脱靶( off target )，也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。

也正因为这个原因，利用 ZFN 技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。

转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。

尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。

二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。

同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。

基因敲除技术(组图)一．概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。

通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。

随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA ，它们同样可以达到基因敲除的目的。

二．实现基因敲除的多种原理和方法：1．利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。

80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。

1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。

到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。

直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。

(1)利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)：①．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。

基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。

②．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。

常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。

而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。

[2，3]③．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。

一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。

如何正确选择基因敲除敲⼊质粒？研究基因功能最有效的⽅法之⼀是⽤实验室设计的DNA⽚段取代或破坏基因，使其失活或“敲除”。

构建特殊的质粒可以通过同源重组替代酵母、⼩⿏或果蝇中的基因。

其原理很简单:将⼀个带有⽬标序列修复模板的质粒递送到细胞，该细胞将模板与内源性基因重组。

在这⾥，我们将主要探讨⽤于灭活哺乳动物细胞中特定基因的技术和质粒。

尽管CRISPR的敲除/敲⼊系统⾮常流⾏，但这个系统仍然很有价值，特别是在CRISPR不能使⽤的情况下(例如，附近没有合适的PAM序列，或者你感兴趣的基因很难⽤gRNA特异性靶向)。

在选择敲除策略时，⼀定要记住这些技巧!敲除质粒1.同源重组是⼀种准确修复破坏性的双链断裂的机制，核苷酸序列在两个相似或相同的DNA分⼦之间进⾏交换。

基因靶向则是利⽤这⼀⾃然过程，运⽤⼀种特殊设计的含有同源序列的载体，将⽬标基因位点替换为同源序列。

为了更了解这个过程，我们将介绍⼀个旨在敲除给定基因的第2外显⼦的实验。

设计你的⽬标结构。

为了在细胞中重组，⾄少需要2 kb的同源序列，但6到14 kb的同源序列是靶向结构的典型特征。

在图1所⽰的例⼦中，与⽬标基因外显⼦1和外显⼦3相对应的序列已克隆到载体抗⽣素抗性基因的任意⼀侧。

为了避免选择那些结构随机整合到基因组中的细胞，像HSV 胸苷激酶(HSV-tk)这样的阴性选择标记被包含在⼀个同源臂之外。

当我们稍后选择细胞时，我们将⾸先对抗⽣素抗性基因进⾏阳性选择，然后对阴性选择标记进⾏反选择——这后⼀步将杀死许多随机整合了全部或⼤部分质粒的细胞。

2.呈递质粒给宿主细胞。

重组后，⽬标基因的第2外显⼦将从染⾊体上移除，并被抗性基因取代。

这样基因就被破坏或敲除了。

3.利⽤正负选择确定正确的重组细胞。

重组是⼀个偶然事件，所以你必须选择⽽不是筛选已经发⽣重组的细胞。

新霉素、嘌呤霉素和潮霉素耐药基因通常⽤于阳性选择。

正选择标记对重组进⾏选择，⽽负选择标记对不适当的、随机的到不同位点的重组进⾏选择。