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微生物学实验报告大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选山东大学生命科学学院2010.6.10大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选摘要：营养缺陷型菌株或称异养型（auxotroph）菌株是许多微生物生理生化以及遗传研究的重要菌株材料。
此类菌株不仅在生物研究方面有着很重要的作用，而且在生物工程和生物技术上都有很重要的作用。
营养缺陷型菌株的筛选也成为了微生物科学工作者必备的基本实验技能之一。
本实验以大肠杆菌原养型菌株为材料，实验了营养缺陷型的诱变获得及筛选，从而了解细菌营养缺陷性的获得步骤，掌握氨基酸营养缺陷型的筛选方法和鉴别过程。
关键词：营养缺陷紫外诱变筛选生长谱测定大肠杆菌（E.coli）一、背景与原理营养缺陷型菌株指的是因自发突变或诱变丧失合成某些生活必需物质的能力的菌株。
营养缺陷型菌株不能在基本培养基上生长（增殖），必须补充一种或一种以上的营养物质才能生长。
此类突变体在理论研究和生产实践中都有重要意义，是作为研究代谢途径和遗传规律不可少的标记菌种，亦可直接用于生产氨基酸、核苷酸等代谢产物。
例如，顺反子概念的提出、基因工程转化结果的鉴定等，都是利用了营养缺陷型菌株。
.菌株自发突变为营养缺陷型的概率是很低的。
因此现代微生物遗传学实验中，为了有目的的获得营养缺陷型菌株，实验人员往往以人工诱变的方法来获得营养缺陷型。
实验中，以各种致突变因子（物理、化学等）处理待突变细胞，然后进行筛选和鉴定，获得营养缺陷型菌株。
能够用来进行诱变的物质很多，例如各种射线、紫外线、DNA染色剂、碱基类似物、强氧化剂等，但是一般实验室中最常见也最有效地史紫外线诱变法。
在紫外线照射下，DNA发生不同程度的损伤，而且会形成大量的嘧啶二聚体。
处理完细胞后，在防止光复活的前提下，细胞中DNA的损伤得不到有效修复或者只能得到SOS 修复，会形成大量的基因突变，在细胞总量较大的前提下，就有机会获得一定得目的菌株。
用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，那时的细菌对诱变剂的反应最灵敏。
营养缺陷型菌株的挑选和鉴定mutugenesis and isolation of auxotroph细菌革兰氏染色法gram stain酵母菌的形态构造观察yeast morphology培养基的配制和灭菌types of mddia and sterlization菌种保藏preservation of cultures细胞计数法conting of cell凝集反响agglutination reactions相差显微镜phase contrast microscope细胞交融cell fusion质粒DNA的提取isolation of plasmid DNA植物DNA的提取isolation of plant DNA多肽的末端分析analysis of terminal of polypeptidePCR扩增DNAPCR amplify DNA fragmentSDS-聚丙烯凝胶电泳SDS-polyacrylamide gel electrophoresis蛋白质的性质properties of protein植物组织培养plant tissue cultureBL-410生物机能实验系统简介the introduction of BL-410 biofunctional experiment system 青蛙坐骨神经-腓肠肌标本的制备preparation methods for nerve-muscle specimen of frog人ABO血型的鉴定Identification of humankind ABO blood group蟾蜍心室肌的期前收缩与代偿性间歇compensatory pause and ventricular extrasystole of ventricular muscle for toad 果蝇的两对因子的自由组合pair factors for free combination of Drosophila植物姊妹染色单体及染色体的区分sister chromatid of plant and differentiate of chromosomeβ-半乳糖苷酶基因〔lac-Z〕的定点突变site-directed mutagenesis of β-galactosidase gene〔lac-Z〕β-半乳糖苷酶的固定化及应用application and immobilization of β-galactosidase大肠杆菌感受态细胞的制备及转化the preparation and transformation of competent cells from Escherichia coli质粒DNA的提取及酶切extraction of plasmid DNA and its detection植物基因组DAN的提取extraction of plant genome DNA小鼠巨噬细胞吞噬实验的观察experimental observation of macrophage cell分小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能phagocytosis of mice peritoneal macrophage cell动物骨髓细胞染色体标本的制备preparation method of chromosomes for animal marrow cells细菌的形态观察bacteria morphology植物叶绿体色素含量的测定determination of chloroplast pigment in plant根的形态构造morphology of root茎的形态构造morphology of stem植物的各种组织tissus of plants氨基酸的别离鉴定-纸层析法the isolation and identification of amino acid- paper chromatography蛋白质的颜色反响coloration reaction of proteins白菜的组织培养tissue culture of cabbageHigh School Biology Experiment IdeasBy Jennifer Eblin, eHow Contributorupdated: April 28, 20211.One idea involves testing the effects of different substances on plants.High school level biology covers all aspects of biology, including animals, plant life and humans. That should mean it's easy to come up with ascience fair project or a classroom research project, but the amount oftopics sometimes makes it even harder. When you first start researching, you'll find thousands of ideas and it's difficult to decide which one is best for your situation. Provided that you know what you want to do and what your teacher or judges are looking for, it's easy to come up with a greatbiology experiment.Effects on Plants2. Test the effects of different substances on plants. Place plants from thesame source in pots of the same size, then use different types of materials.You can test different types of potting soil against regular dirt or use the same type of potting soil and test other substances. Water the plants with different types of bottled water and tap water from your home and other homes or add a small amount of vinegar and other liquids to see how the plants react to those substances. Observe the effects of the differentsubstances on the plants and measure how quickly each plant grows in comparison to the others.Water Bottles3. Test the amount of germs and toxins found when you refill a water bottle.Start by taking a sample swab from the outside lip of the bottle and looking at the water under a microscope for any bacteria or impurities. Then drink from the bottle as you otherwise would and test the bottle each time you refill it with extra water. Student athletes can even use the same plasticwater bottles they carry with them to practice every day. Each time, you'll want to swab the inside lip of the bottle and look at the swab under amicroscope. Identify any bacteria or toxins by looking at the examplesfound in your textbook.Public Germs4. You might be surprised when you check different public areas for germs.Take swabs at public bathrooms, in your classroom, on the door handles at stores and even books at the public library. Look at the swabs under a microscope and see what types of germs you find. Then offer acomparison of the germs and explain your findings. Discuss which germs are harmful and what levels of germs you found.Hair5. Do a biology experiment focusing on how the hair reacts to differenttypes of products. Test shampoos, conditioners, hair gels, hair sprays and other products. Look for residue left behind by the product, but take a few sample hairs before you begin. Check the consistency and health of the sample hairs under a microscope and compare those results against hairs after using the products. Observe any changes you notice in the look or feel of your hair, as well. Then look for signs that the hair has becomemore damaged or healthier since you used the product. You'll need tonarrow it down to just a few products, but if you have more time, use one product for several days before switching to anotherRead more: High School Biology Experiment Ideas | eHow。
大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定关于菌株的几个概念：野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始状态。
营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。
原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上和野生型相同关于培养基：基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，用[－]来表示。
完全培养基（complete medium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。
用[＋]来表示。
补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组全培养基，它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成。
摘要：本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发大肠杆菌突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，获得100#大肠杆菌菌株，最后经生长谱法鉴定出该菌株为xxx缺陷型。
关键词：大肠杆菌紫外线营养缺陷型青霉素逐个测定法生长谱法一、目的1、了解营养缺陷型突变株选育的原理。
2、学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法。
二、原理筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。
本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。
三、器材离心机，紫外线照射箱，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；三角烧瓶，试管，离心管，移液管，培养皿，接种针四、材料(一)菌种E.coli(二)培养基、1LB培养液(Luria-Bertani 培养基,这个名字来源于英语的lysogeny broth，即溶菌肉汤。
是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，分为液态培养基和加入琼脂制成的固态培养基。
加入抗生素的LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。
大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选陈瑞州201110424108一.实验原理以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理细菌，使基因发生突变，丧失合成某一物质（如维生素）的能力，因而它们不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长。
这样从野生型经诱变筛选得到的菌株称为营养缺陷型。
常用的诱变法是紫外线照射诱变法。
但是，经处理后的细菌，缺陷型还是相当少的，必须设法淘汰野生型细菌。
因为抗生素能杀死生长的细菌而对不生长的细菌没影响，而缺陷型菌株在基本培养基中不能生长，由此通过含有抗生素的基本培养基即可淘汰野生型细菌，保留缺陷型细菌。
把经过浓缩的缺陷型菌液接种在完全培养基上，待长出菌落后，将每一菌落分别接种在基本培养基和完全培养基上，凡是在基本培养基上不长，而在完全培养基上生长的菌落就是营养缺陷型。
二.实验材料大肠杆菌K12的野生型菌株大肠杆菌三.实验器具和药品1.用具：灭菌培养皿（9cm），灭菌三角瓶（150ml），灭菌离心管。
2.培养基1)肉汤液体培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl0.5g，蒸馏水100ml，Ph7.2，高压灭菌15磅/英寸2 15分钟。
2)肉汤液体培养基（2E）：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl0.5g，蒸馏水50ml，Ph7.2，高压灭菌锅15磅/英寸215分钟。
3)基本液体培养基：葡萄糖2g，蒸馏水98ml，pH7.0，高压灭菌8磅/英寸2 30分钟4)基本固体培养基：琼脂2g，基本液体培养基100ml，pH7.0，高压灭菌8磅/英寸2 30分钟。
5)无N基本液体培养基：K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，柠檬酸钠·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.01g，葡萄糖2g，蒸馏水100ml，Ph7.0，高压灭菌8磅/英寸230分钟。
6)2N基本液体培养基：K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，柠檬酸钠·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O0.01g，(NH4)2SO4 0.2g，葡萄糖2g，蒸馏水100ml，Ph7.0，高压灭菌8磅/英寸2 30分钟。
细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选摘要[目的]通过诱变处理，获得并筛选细菌营养缺陷型菌株。
[方法]以大肠杆菌E.coli K12SF+为实验菌株，通过紫外线诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型菌株，经过缺陷型菌株的检出、划线复证、生长谱鉴定，最终确定得到菌株的营养缺陷型类型。
[结果]经过诱变处理后，检出了营养缺陷型，经过划线复证发现该菌株并非营养缺陷型；用其他组复证后的营养缺陷型菌株进行生长谱法鉴定，显示没有菌落形成，即没有预期的营养缺陷型菌株出现。
关键词诱变；紫外线；营养缺陷型；生长谱法鉴定；筛选前言随着微生物遗传学及其在生产实践中的不断发展，迫切的需要建立更多的新菌种为科学研究和生产所用。
其中获得微生物菌种的突变菌株就是获得新菌种的一种方法。
通过一定措施，诱发菌种发生突变，改变菌种的性能并选育，得到具有新性能的菌种。
在诱变剂选择时，首先应从诱变剂的普遍性出发，然后再考虑由于不同的生物的DNA碱基排列、GC的含量、细胞生理特性等，对诱变剂表现敏感强弱的差别。
一定剂量的紫外线照射，可以导致细胞发生突变，而且紫外线的安全性较高，易于操作，方便使用。
本实验采用紫外线诱发突变，紫外诱变机理如下：DNA和RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。
另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录。
总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。
在使用紫外诱变时，应注意防止光复活，紫外线照射结束后，要用黑布包裹暗箱培养。
此外，使用任何诱变剂均需考虑其剂量问题。
在计算某一诱变剂对微生物作用的最适剂量时，必须考虑到一切诱变剂都有杀菌和诱变的双重效应。
当杀菌率不高时，诱变率常随剂量的提高而提高，剂量提高到一定的浓度后，诱变率反而下降了。
如果以产量性状为标准，则诱变率的高低还有两种情况：一是产量提高的诱变率，称为正向突变；一是产量降低的诱变率，称为负向突变。
微生物大实验细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选摘要用某些物理因素或是化学因素，使基因发生突变，丧失合成某一物质的能力，因而它们在基本培养基上不能生长，必须补充某些物质才能生长，这样从野生菌经诱变筛选到的菌株，称为营养缺陷型。
紫外线可以诱导细菌发生突变，产生营养缺陷型菌株。
筛选营养缺陷型菌株必须经过如下几个步骤：诱变处理、营养缺陷型的检出、划线复证、生长谱鉴定、缺陷型菌株纯化。
又因处理的细菌所得到的突变菌仍然是很少的部分，因此必须采用有效的筛选方法，才能分离到突变型。
关键词紫外诱变营养缺陷型营养缺陷型的检出划线复证生长谱鉴定引言营养缺陷型：需要在基本培养基中补加某种营养成分（如氨基酸、维生素、核苷酸等）才能生长的微生物突变体，通过基因突变产生。
微生物细胞本身能吸收周围环境中的简单营养物，经过自身代谢合成生长所需的各类营养物质。
如果发生基因突变，则细胞失去合成与这些基因有关营养物质的能力，只有在培养基中补加这类营养物质后，突变细胞才能生长，故又名营养缺陷型突变体。
此类突变体在理论研究和生产实践中都有重要意义，是研究代谢途径和遗传规律必不可少的标记菌种，亦可直接用于生产氨基酸、核苷酸等代谢产物。
为了获得营养缺陷型菌株，需从诱变处理后的菌液中认真筛选，以便检出突变体，常用的方法有：影印接种法、夹层培养法和青霉素浓缩法等。
影印接种法：将待测的浓缩菌悬液涂在完全培养基平板上，待其长好后作为母平板。
用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上，作为接种工具。
用它在母平板上轻轻印一下，再在基本培养基平板上印一下，经培养后，影印平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置对应，比较二个平板上菌落的生长状况，即可从相应位置的母平板上选出待测的营养缺陷型菌株。
夹层培养法：先在培养皿中倒一层不含菌的基本培养基，待冷凝后，加一层含菌的基本培养基，冷凝后，再加一层不含菌的基本培养基，经培养出现菌落后，在培养皿底的相应位置做上标记，然后再加一层完全培养基。
实验五、营养缺陷型菌株筛选及鉴定1、实验名称营养缺陷型菌株筛选及鉴定2、实验操作人3、实验过程简述3.1 营养缺陷型菌株诱变3.1.1培养基的配制配置两种类型的培养基，营养丰富培养基（YPD）和基本培养基（SC），其中营养丰富的培养基在诱变的过程中用来培养菌株，在基本培养基中选择性的加入氨基酸来进行筛选，分别标记为：SC5 (SC+His+Trp+Leu+Lys+Ura)；SC5-Lys (SC+His+Trp+Leu+Ura) SC5-Leu (SC+His+Trp+Lys+Ura)；SC5-Trp (SC+His+Leu+Lys+Ura)；SC5-His (SC+Trp+Leu+Lys+Ura)；SC5-Ura(SC+His+Trp+Leu+Lys)。
3.1.2稀释涂布在超净台，取0.1 ml菌悬液转接到0.9 ml无菌水中，混匀后，取0.1 ml 稀释液转接到0. 9 ml无菌水中，混匀后，继续进行10倍的梯度稀释，稀释到10-6；取0.1 ml稀释度分别为10-4、10-5、10-6的菌悬液，加入到YPD固体平板上，用涂布棒涂布均匀，每个稀释度涂5块平板；3.1.3紫外诱变每个稀释度各取一块平板，培养皿底部标记好组号-稀释度-紫外处理时间，将平板适当垫高，防止诱变不充分，用紫外照射分别诱变处理0、30、45、60、120秒，黑布包好，置于30℃培养箱培养48h；记录各平板上的菌落数，计算不同处理的细胞致死率。
致死率（%）=1-（特定时间点平板上菌落数X稀释倍数）/（0时平板上菌落数X 稀释倍数）X100%3.2 营养缺陷型菌株初筛3.2.1选取单菌落小组内部四人分别标号为A/B/C/D（本人标号为A）,本次实验选用了两种敏感性不同的菌株，选取两种菌株内生长较好的平板，每个平板每人取3个单菌落（每人2菌×3个单菌落），用记号笔圈出标记为A1/A2/…A6防止重复挑取；取1.5ml离心管装入1ml无菌水，用接种环从YPD平板上挑取单菌落，转接到无菌水中，摇匀，室温静置2h；3.2.2点板在准备好的YPD、SC培养基平板底部做标记（培养基名称-组号）,将小组成员点菌位置画好格子；分别取一接种环菌悬液对应点于SC和YPD培养基平板上（每人1行，做好标记）；将培养皿倒置于30℃培养箱中，培养48h，注意无论涂板、还是点板，一定等菌液被培养基吸收后，再挪动或倒置；记录各单菌落在不同培养基上生长情况（生长记“+”，不生长记“-”），并拍照；根据生长情况，判断本实验各菌株是否为营养缺陷型菌株。
大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选一、实验原理在以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理细菌，使基因发生突变，丧失合成某一物质(如氨基酸、维生素、核苷酸等)的能力，因而它们不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长。
这样从野生型经诱变筛选得到的菌株，称为营养缺陷型。
筛选营养缺陷型菌株必须经过以下几个步骤:诱变处理、淘汰野生型、检出缺陷型、鉴定缺陷型。
由于本实验是以大肠杆菌为材料，所以根据细菌的特性分别说明筛选的步骤。
诱变剂的作用主要是提高突变频率，它分为物理和化学的二类。
物理诱变剂常用的有X射线、紫外线、快中子、γ射线等诱变处理首先是选择诱变剂，微生物诱变中最常用的物理诱变剂是紫外线。
诱变剂所处理的微生物，一般要求呈单核的单细胞或单孢子的悬浮液，分布均匀，这样可以避免出现不纯的菌落。
用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，那时的细菌对诱变剂的反应最灵敏。
2诱变处理必须选择合适的剂量，剂量的表示有二种，绝对剂量和相对剂量。
绝对剂量的单位以尔格/cm表示，一般用相对剂量。
相对剂量与三个因素有关，这三个因素是:诱变源和处理微生物的距离，诱变源(紫外灯)的功率，以及处理的时间。
前二个因素是固定的，所以通过处理时间控制诱变剂量。
各种微生物的处理最适剂量是不同的，须经预备实验确定。
经处理以后的细菌，缺陷型还是相当少的，必须设法淘汰野生型细胞，提高营养缺陷型细胞所占比例，以达到浓缩缺陷型的目的。
细菌中常用的浓缩法是青霉素法。
青霉素是杀菌剂，它只杀死生长的细胞，对不生长的细胞没有致死作用。
所以在含有青霉素的基本培养基中野生型能长而被杀死，缺陷型不能长被保存得以浓缩。
检出缺陷型的方法有逐个测定法、夹层培养法、限量补给法、影印培养法。
这里主要以逐个测定法为例进行说明。
把经过浓缩的缺陷型菌液接种在完全培养基上，待长出菌落后将每一菌落分别接种在基本培养基和完全培养基上。
凡是在基本培养基上不能生长而在完全培养基上能长的菌落就是营养缺陷型。
大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定关于菌株的几个概念：野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始状态。
营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。
原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上和野生型相同关于培养基：基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，用[－]来表示。
完全培养基（complete medium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。
用[＋]来表示。
补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组全培养基，它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成。
摘要：本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发大肠杆菌突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，获得100#大肠杆菌菌株，最后经生长谱法鉴定出该菌株为xxx缺陷型。
关键词：大肠杆菌紫外线营养缺陷型青霉素逐个测定法生长谱法一、目的1、了解营养缺陷型突变株选育的原理。
2、学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法。
二、原理筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。
本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。
三、器材离心机，紫外线照射箱，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；三角烧瓶，试管，离心管，移液管，培养皿，接种针四、材料(一)菌种E.coli(二)培养基、1LB培养液(Luria-Bertani 培养基,这个名字来源于英语的lysogeny broth，即溶菌肉汤。
是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，分为液态培养基和加入琼脂制成的固态培养基。
加入抗生素的LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。
)：酵母膏，0.5g；蛋白胨，1g；NaCl，0.5g；水，100ml，pH7.2 121℃灭菌15min22×LB培养液：其它不变，水，50ml。
3基本培养基：葡萄糖0.5 g，(NH4)2SO4 0.1 g，柠檬酸钠0.1 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，K2HPO4 0.4 g，KH2PO4 0.6 g，重蒸水100 mL，pH 7.2，110℃灭菌20 min。
配固体培养基时需加2%洗涤处理过的琼脂。
全部药品需用分析纯，使用的器皿需用蒸馏水或重蒸水冲洗2~3 次。
4无N基本液体培养基：K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g; 柠檬酸钠3H2O,0.5g；MgSO4 7H2O,0.01g; 葡萄糖2g；水100ml，pH7.0 110℃灭菌20min52N基本培养基：K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g; 柠檬酸钠3H2O,0.5g；MgSO4 7H2O,0.01g; (NH4)2SO4,0.2g;葡萄糖2g；水100ml，pH7.0 110℃灭菌20min6完全培养基同LB培养基，配置固体培养基，需加2%的琼脂。
7混合氨基酸和混合维生素五、步骤1 菌悬液制备1) 取E.coli K12 一环加入到10ml LB培养液中在37℃下过夜培养；2) 取0.3μl 菌液转接到10ml LB培养液中，在37℃摇床上振荡培养4—6小时，使细胞处在对数生长期；3) 取适量菌液加入到5ml离心管中，7000rpm离心3到4 min，离心2次，弃上清液，打匀沉淀，各加入4ml无菌生理盐水，充分振荡混匀。
2 诱变处理1) 取3ml菌悬液，加入到7cm小皿内，轻轻震荡使其均匀在皿底形成一薄层。
平放在灭菌的超净工作台上，盖盖灭菌1min，然后打开皿盖照射2min(15W)。
2) 诱变后处理取3ml诱变后菌液加入到离心管中，7000rpm离心3到4分钟，弃上清，加入4ml 生理盐水离心洗涤2次，重悬于3ml生理盐水中，取0.2 μl加入到5ml 2LB基本培养基内,37℃培养过夜（后培养）。
3检出缺陷性菌株1）初筛：从培养12、16、24h的菌液中，各自取100μl，分别在LB完全培养基和基本培养基上涂布2个平板，做好标记，在37℃下培养36h。
2）复筛：签挑取完全培养基上长出的菌落200个，分别点种在基本培养基和完全培养基上，37℃过夜培养。
4 复证挑取LB完全培养基上有而基本培养基上没有的菌落，在基本培养基上划线复证，并在完全培养基上保留备份，37℃过夜培养。
24小时后仍不长的为缺陷型。
5 生长谱鉴定1) 营养缺陷型浓缩（淘汰野生型）3th day，延迟处理：吸菌液5ml于离心管中，3500rpm离心10min，弃上清。
离心洗涤两次（加生理盐水至原体积，打匀沉淀，离心，弃上清，重复一次），最后加生理盐水制成5ml菌悬液。
取0.1ml菌液于5ml无N培养基中，37℃培养12h。
（消耗体内的N素，使停止生长，避免缺陷型被以后加入的青霉素杀死）4th day，按1:1比例加入2N基本培养液5ml，加5万U/ml青霉素钠盐溶液100ul，使青霉素在溶液中的最终浓度约为500U/ml，再放入37℃培养。
（野生型利用氮大量生长，细胞壁不能完整合成而死亡，缺陷型因不长避免被杀死）。
5th day，从培养12、14、16、24小时（根据实际情况，选择2-3个时间段）的菌液中分别取0.1ml菌液到基本及完全培养基两个培养皿中，涂布，37℃培养。
2) 营养缺陷型检出7th day，检出营养缺陷型。
上述平板培养36－48h后，进行菌落计数。
选取完全培养基上长的菌落数大大超过基本培养基的那一组，用灭菌牙签挑取完全培养基上长出的菌落100个分别点种于基本培养基和完全培养基上（先基本，后完全），37℃培养。
9th day，选在基本培养基上不长，完全培养基上生长的菌落在基本培养基上划线，37℃培养24h，仍不长的是营养缺陷型。
3)营养缺陷型鉴定在同一平皿上测定一种缺陷型菌株对许多种生长因子的需求情况为生长谱法。
单一生长因子：鉴定氨基酸或维生素的营养缺陷型，较为简便的方法是分组测定法。
将21种氨基酸，组合6组，每6种不同氨基酸归为一组。
如果以15种维生素进行测定，则把5种维生素归为一组，共5个组合。
组别氨基酸组合组1 赖氨酸精氨酸蛋氨酸胱氨酸亮氨酸异亮氨酸2 缬氨酸精氨酸苯丙氨酸酪氨酸色氨酸组氨酸3 苏氨酸蛋氨酸苯丙氨酸谷氨酸脯氨酸天冬氨酸4 丙氨酸胱氨酸酪氨酸谷氨酸甘氨酸丝氨酸5 鸟氨酸亮氨酸色氨酸脯氨酸甘氨酸谷氨酰胺6 胍氨酸异亮氨酸组氨酸天冬氨酸丝氨酸谷氨酰胺组别维生素组合组1 维生素A 维生素B1 维生素B2 维生素B6 维生素B122 维生素C 维生素B1 维生素D2 维生素E 烟酰胺3 叶酸维生素B2 维生素D2 胆碱泛酸钙4 对氨基苯甲酸维生素B6 维生素E 胆碱肌醇5 生物素维生素B12 烟酰胺泛酸钙肌醇10th day，生长谱的测定：将检出的营养缺陷型菌落接种于5ml LB液试管中，37℃培养14－16h。
11th day，培养16h的菌液离心。
3500rpm，10min，弃上清，加生理盐水，打匀沉淀，再次离心。
加5ml生理盐水制成菌悬液。
取其1ml于培养皿中，加入融化后冷却到40－50℃的基本培养基，混匀，平放，共二皿。
（平板表面分别沾上沾有混合氨基酸(或酪素水解液)的滤纸片，30℃培养 24h ，经培养后营养物质周围有生长圈，即表明为氨基酸的营养缺陷型菌株）。
将皿底分成分格用接种环依次放入少许混合氨基酸等，37℃培养24h ，观察生长情况，确定是哪种氨基酸营养缺陷型。
生长谱鉴定点样图示六、实验结果与分析1、营养缺陷型检出点植对照时每平皿点30株菌，最后在基本培养基上没有长出的菌株，而在是完全培养基上长出菌落的，即为筛选出的营养缺陷型菌株。
2、营养缺陷型鉴定通过如图1生长谱鉴定，得到如图2结果：生长谱鉴定结果图叶酸嘧啶 B 组维生素 腺嘌呤 12 3 5 4 右图中1、2、3、4、5均为氨基酸组合图1图2分析：如图中，1,2,3,4,5任意区域有生长圈生成即对应为相应氨基酸营养缺陷型菌株。
七、结论与讨论结论：本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发大肠杆菌突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，获得100#大肠杆菌菌株，最后经生长谱法鉴定出该菌株为XXX缺陷型。
讨论：1、注意事项：紫外线对皮肤和眼睛有很大伤害，实验中应避免人体暴露在紫外线中。
各种器具、培养基及需加入培养基中的试剂均需灭菌。
2、本实验中的突变型是氨基酸缺陷型，我们是可以检测的，如果是与N元素代谢有关的其他缺陷型，我们无法通过这个实验检测。
3、本实验中经紫外线照射后，诱变率较低，可能是因为照射时间短，诱变剂量小，或者是黑暗培养不完善导致光复活作用，可将诱变后的菌体进行后培养。
八. 注意事项实验过程中要严格控制无菌，在菌落的选取、划线培养、菌悬液的吸取、接种等环节都要进行严格的无菌操作，任何一部的杂菌污染都会对最终的实验结果造成严重影响。
在用牙签筛选点种的时候要注意牙签不能将培养基戳破，这样不利于菌落的生长，也不利于观察，另外还要注意点样的顺序是先基本培养基后完全培养基。
在基本培养基上的点接量一定要少，以防止细胞过多及细胞老化而导致自溶现象的发生，从而引起缺陷型突变体也可以在基本培养基上生长的现象。
在倾注平板时培养皿必须在使用之前严格的无菌，培养基的温度要严格控制，否则容易烫死加入的细菌或者由于凝固而使混匀失败。
在最后一步鉴定营养缺陷型时要注意氨基酸的点样不能过多，要用牙签蘸取氨基酸后轻轻抖动即可。
如果点样过多会造成氨基酸在培养基中的扩散，从而对实验结果产生影响。
拓展讨论倾注培养法进行生长谱的鉴定有其优点。
由于氨基酸没有经过灭菌处理，而且在氨基酸点样过程中很容易发生受杂菌污染，这样就很有可能导致培养基的表面有杂菌菌落产生。
比如这时候采用涂布法，那极有可能引发实验的干扰，产生假阳性。
而用倾注法的菌落不容易扩散，能够将菌落限定在特定的区域，细菌可以利用外来的氨基酸，那么菌落生长圈就会出现在培养基内部，这样我们只观察透明培养基的内部的生长圈情况就可以了。
而对于倾注法存在的问题，第一，它还是没能更高程度地避免染菌，因此也要求我们的无菌操作精度要高。
第二，倾注平板时容易将菌杀死，而对于这个情况的掌控，只能依靠人为的感觉。
第三：倾注平板容易造成平板不平，或者不均，影响菌的生长和观察。
