大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变与筛选 山大微生物大实验

微生物学实验报告大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选山东大学生命科学学院2010.6.10大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选摘要：营养缺陷型菌株或称异养型（auxotroph）菌株是许多微生物生理生化以及遗传研究的重要菌株材料。

此类菌株不仅在生物研究方面有着很重要的作用，而且在生物工程和生物技术上都有很重要的作用。

营养缺陷型菌株的筛选也成为了微生物科学工作者必备的基本实验技能之一。

本实验以大肠杆菌原养型菌株为材料，实验了营养缺陷型的诱变获得及筛选，从而了解细菌营养缺陷性的获得步骤，掌握氨基酸营养缺陷型的筛选方法和鉴别过程。

关键词：营养缺陷紫外诱变筛选生长谱测定大肠杆菌（E.coli）一、背景与原理营养缺陷型菌株指的是因自发突变或诱变丧失合成某些生活必需物质的能力的菌株。

营养缺陷型菌株不能在基本培养基上生长（增殖），必须补充一种或一种以上的营养物质才能生长。

此类突变体在理论研究和生产实践中都有重要意义，是作为研究代谢途径和遗传规律不可少的标记菌种，亦可直接用于生产氨基酸、核苷酸等代谢产物。

例如，顺反子概念的提出、基因工程转化结果的鉴定等，都是利用了营养缺陷型菌株。

.菌株自发突变为营养缺陷型的概率是很低的。

因此现代微生物遗传学实验中，为了有目的的获得营养缺陷型菌株，实验人员往往以人工诱变的方法来获得营养缺陷型。

实验中，以各种致突变因子（物理、化学等）处理待突变细胞，然后进行筛选和鉴定，获得营养缺陷型菌株。

能够用来进行诱变的物质很多，例如各种射线、紫外线、DNA染色剂、碱基类似物、强氧化剂等，但是一般实验室中最常见也最有效地史紫外线诱变法。

在紫外线照射下，DNA发生不同程度的损伤，而且会形成大量的嘧啶二聚体。

处理完细胞后，在防止光复活的前提下，细胞中DNA的损伤得不到有效修复或者只能得到SOS 修复，会形成大量的基因突变，在细胞总量较大的前提下，就有机会获得一定得目的菌株。

用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，那时的细菌对诱变剂的反应最灵敏。

实验三营养缺陷型的筛选一、教学目标及基本要求理解选育营养缺陷型突变株的选育原理，掌握营养缺陷型突变株的筛选方法。

二、实验原理营养缺陷型是野生型菌株由于基因突变，致使细胞合成途径出现某些缺陷，丧失合成某些物质的能力，必须在基本培养基中外源补加该营养物质，才能正常生长的一类突变株。

其本质是一种减低或消除末端产物浓度，以解除反馈控制的代谢调控方式，使代谢途径中间产物或分支合成途径中末端产物得以积累。

营养缺陷型菌株广泛应用于氨基酸，核苷酸，维生素的生产中，也广泛应用于基因定位，杂交及基因重组等研究中的遗传标记制作。

三、实验材料1. 菌种枯草杆菌（B.subtilis）。

2. 培养基(1) 细菌完全培养基（CM）葡萄糖0.5%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，蛋白胨1%，MgSO4·7H2O0.2%，琼脂2%，PH7.2。

(2) 细菌基本培养基（MM）葡萄糖0.5%，MgSO4·7H2O0.2%，柠檬酸钠0.1%，(NH4)2SO40.2%,K2HPO40.4%,琼脂2%(处理琼脂)。

配制基本培养基的药品均用分析纯；使用的器皿要洗净，用蒸馏水冲洗2~3次，必要时用重蒸馏水冲洗。

(3) 无氮基本培养基在基本培养基中不加(NH4)2SO4和琼脂。

(4) 二倍氮源基本培养基在基本培养基中加入2倍(NH4)2SO4，不加琼脂。

(5) 限制培养基（SM）向配好的液体基本培养基中加入0.1~0.5%的完全培养基，加入2%琼脂。

3. 溶液(1) 无维生素的酪素水解物或氨基酸混合液。

(2) 水溶性维生素混合液。

(3) 核酸水解液：取2g RNA，加入15ml 1mol/L NaOH；另取2g RNA，加入15ml1mol/L HCl，分别于100℃水浴加热水解20min后混合，调整pH值为6.0，过滤后调整体积为40ml。

4. 其它：无菌小滤纸片，干净镊子，无菌移液管，培养皿，酒精灯等。

四、实验内容1. 菌体前培养取新活化的的枯草芽孢杆菌斜面菌种1环，接入装有20ml完全培养基的250ml三角瓶中，30℃振荡培养16~18h。

“ARTP 诱变筛选大肠埃希氏菌营养缺陷型”虚拟仿真实验的构建摘要：“ARTP 诱变筛选大肠埃希氏菌营养缺陷型”虚拟实验教学项目的课程软件基于安全、成熟、易用、高性能、先进的虚拟仿真平台架构进行构建。

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实验包含4大模块，诱变处理、营养缺陷型浓缩、营养缺陷型检出、营养缺陷型鉴定以及6个主要操作步骤及29个具体操作步骤。

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关键词：微生物学；虚拟仿真；常压室温等离子体；诱变育种中图分类号：G642.423文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2020）01-0387-03收稿日期：2019-01-28基金项目：山东省高等教育名校建设工程项目（鲁教高字〔2011〕14号）；山东省高水平应用型立项建设专业（群）项目（鲁教高字〔2016〕11号）；齐鲁工业大学（山东省科学院）校级教研项目（201648）；齐鲁工业大学（山东省科学院）专业核心课程建设项目（2016H07）；中国轻工业联合会教育工作分会课题（QGJY2019030）作者简介：郝鲁江（1972-），男（汉族），山东烟台人，博士，副教授，研究方向：微生物学教育研究。

为贯彻落实《教育部关于全面提高高等教育质量的若干意见》（教高[2012]4号）精神，根据《教育信息化十年发展规划（2011—2020年）》，开展国家级虚拟仿真实验教学中心建设工作，教育部自2013年起建设1500个国家级虚拟仿真实验教学中心。

教育信息化程度是评价高校办学质量的重要指标，教学资源的建设，尤其是软件的开发和建设，也是名校建设的重中之重，《齐鲁工业大学十三五发展规划（草案）》将发展教学资源建设，筹备国家虚拟仿真实验教学中心列为教改的重要工作。

细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选摘要[目的]通过诱变处理，获得并筛选细菌营养缺陷型菌株。

[方法]以大肠杆菌E.coli K12SF+为实验菌株，通过紫外线诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型菌株，经过缺陷型菌株的检出、划线复证、生长谱鉴定，最终确定得到菌株的营养缺陷型类型。

[结果]经过诱变处理后，检出了营养缺陷型，经过划线复证发现该菌株并非营养缺陷型；用其他组复证后的营养缺陷型菌株进行生长谱法鉴定，显示没有菌落形成，即没有预期的营养缺陷型菌株出现。

关键词诱变；紫外线；营养缺陷型；生长谱法鉴定；筛选前言随着微生物遗传学及其在生产实践中的不断发展，迫切的需要建立更多的新菌种为科学研究和生产所用。

其中获得微生物菌种的突变菌株就是获得新菌种的一种方法。

通过一定措施，诱发菌种发生突变，改变菌种的性能并选育，得到具有新性能的菌种。

在诱变剂选择时，首先应从诱变剂的普遍性出发，然后再考虑由于不同的生物的DNA碱基排列、GC的含量、细胞生理特性等，对诱变剂表现敏感强弱的差别。

一定剂量的紫外线照射，可以导致细胞发生突变，而且紫外线的安全性较高，易于操作，方便使用。

本实验采用紫外线诱发突变，紫外诱变机理如下：DNA和RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。

另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录。

总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。

在使用紫外诱变时，应注意防止光复活，紫外线照射结束后，要用黑布包裹暗箱培养。

此外，使用任何诱变剂均需考虑其剂量问题。

在计算某一诱变剂对微生物作用的最适剂量时，必须考虑到一切诱变剂都有杀菌和诱变的双重效应。

当杀菌率不高时，诱变率常随剂量的提高而提高，剂量提高到一定的浓度后，诱变率反而下降了。

如果以产量性状为标准，则诱变率的高低还有两种情况：一是产量提高的诱变率，称为正向突变；一是产量降低的诱变率，称为负向突变。

微生物大实验细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选摘要用某些物理因素或是化学因素，使基因发生突变，丧失合成某一物质的能力，因而它们在基本培养基上不能生长，必须补充某些物质才能生长，这样从野生菌经诱变筛选到的菌株，称为营养缺陷型。

紫外线可以诱导细菌发生突变，产生营养缺陷型菌株。

筛选营养缺陷型菌株必须经过如下几个步骤：诱变处理、营养缺陷型的检出、划线复证、生长谱鉴定、缺陷型菌株纯化。

又因处理的细菌所得到的突变菌仍然是很少的部分，因此必须采用有效的筛选方法，才能分离到突变型。

关键词紫外诱变营养缺陷型营养缺陷型的检出划线复证生长谱鉴定引言营养缺陷型：需要在基本培养基中补加某种营养成分（如氨基酸、维生素、核苷酸等）才能生长的微生物突变体，通过基因突变产生。

微生物细胞本身能吸收周围环境中的简单营养物，经过自身代谢合成生长所需的各类营养物质。

如果发生基因突变，则细胞失去合成与这些基因有关营养物质的能力，只有在培养基中补加这类营养物质后，突变细胞才能生长，故又名营养缺陷型突变体。

此类突变体在理论研究和生产实践中都有重要意义，是研究代谢途径和遗传规律必不可少的标记菌种，亦可直接用于生产氨基酸、核苷酸等代谢产物。

为了获得营养缺陷型菌株，需从诱变处理后的菌液中认真筛选，以便检出突变体，常用的方法有：影印接种法、夹层培养法和青霉素浓缩法等。

影印接种法：将待测的浓缩菌悬液涂在完全培养基平板上，待其长好后作为母平板。

用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上，作为接种工具。

用它在母平板上轻轻印一下，再在基本培养基平板上印一下，经培养后，影印平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置对应，比较二个平板上菌落的生长状况，即可从相应位置的母平板上选出待测的营养缺陷型菌株。

夹层培养法：先在培养皿中倒一层不含菌的基本培养基，待冷凝后，加一层含菌的基本培养基，冷凝后，再加一层不含菌的基本培养基，经培养出现菌落后，在培养皿底的相应位置做上标记，然后再加一层完全培养基。

“ARTP诱变筛选大肠埃希氏菌营养缺陷型”虚拟仿真实验的构建1. 引言1.1 研究背景大纲中关于【研究背景】的内容如下：在当前全球范围内，大肠埃希氏菌的感染已经成为一种严重的公共卫生问题。

大肠埃希氏菌可引起多种疾病，包括腹泻、溃疡性结肠炎和溶血性尿毒症综合征等。

由于营养缺陷型大肠埃希氏菌的感染引起的病情较为严重，治疗难度也较大。

研究营养缺陷型大肠埃希氏菌的特征和治疗方法显得尤为重要。

目前，利用ARTP诱变筛选技术对大肠埃希氏菌进行筛选已经成为一种有效的方法。

ARTP诱变技术可以诱发大肠埃希氏菌的遗传变异，从而获得新的菌株，并通过筛选确定具有特定特征的菌株。

虚拟仿真实验是一种新兴的实验方法，通过计算机模拟技术，对实验进行虚拟化操作，可以加速实验的进展并降低实验成本。

将虚拟仿真技术应用于大肠埃希氏菌的营养缺陷型研究具有重要的意义和广阔的应用前景。

1.2 研究目的研究目的是为了利用ARTP诱变技术筛选出大肠埃希氏菌的营养缺陷型菌株，并通过虚拟仿真实验来探究其生长特性和适应能力。

通过这一研究，我们旨在深入了解大肠埃希氏菌的代谢途径及营养需求的变化，为进一步探讨其在生物学意义、食品工业和医学领域的应用提供理论基础。

本研究还旨在探索ARTP诱变技术在筛选特定营养缺陷型菌株中的有效性和实用性，为微生物学领域的研究提供新的思路和方法。

通过本研究，我们希望为大肠埃希氏菌的应用研究提供更为宝贵的实验数据和理论支持，为相关领域的科研工作作出贡献。

1.3 研究意义大肠埃希氏菌是一种常见的细菌，在食品安全和公共卫生领域具有重要意义。

营养缺陷型大肠埃希氏菌的存在给人们带来了一定的健康隐患。

了解营养缺陷型大肠埃希氏菌的特性，并通过诱变筛选方法寻找新的控制措施，对于预防和控制大肠埃希氏菌引发的疾病具有重要的意义。

本研究旨在利用ARTP诱变筛选技术，通过虚拟仿真实验的构建，对营养缺陷型大肠埃希氏菌进行筛选和鉴定。

通过这种方法，我们可以快速、有效地筛选出具有潜在危害的菌株，并对其进行进一步的分析和研究。

大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选一、实验原理在以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理细菌，使基因发生突变，丧失合成某一物质(如氨基酸、维生素、核苷酸等)的能力，因而它们不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长。

这样从野生型经诱变筛选得到的菌株，称为营养缺陷型。

筛选营养缺陷型菌株必须经过以下几个步骤:诱变处理、淘汰野生型、检出缺陷型、鉴定缺陷型。

由于本实验是以大肠杆菌为材料，所以根据细菌的特性分别说明筛选的步骤。

诱变剂的作用主要是提高突变频率，它分为物理和化学的二类。

物理诱变剂常用的有X射线、紫外线、快中子、γ射线等诱变处理首先是选择诱变剂，微生物诱变中最常用的物理诱变剂是紫外线。

诱变剂所处理的微生物，一般要求呈单核的单细胞或单孢子的悬浮液，分布均匀，这样可以避免出现不纯的菌落。

用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，那时的细菌对诱变剂的反应最灵敏。

2诱变处理必须选择合适的剂量，剂量的表示有二种，绝对剂量和相对剂量。

绝对剂量的单位以尔格/cm表示，一般用相对剂量。

相对剂量与三个因素有关，这三个因素是:诱变源和处理微生物的距离，诱变源(紫外灯)的功率，以及处理的时间。

前二个因素是固定的，所以通过处理时间控制诱变剂量。

各种微生物的处理最适剂量是不同的，须经预备实验确定。

经处理以后的细菌，缺陷型还是相当少的，必须设法淘汰野生型细胞，提高营养缺陷型细胞所占比例，以达到浓缩缺陷型的目的。

细菌中常用的浓缩法是青霉素法。

青霉素是杀菌剂，它只杀死生长的细胞，对不生长的细胞没有致死作用。

所以在含有青霉素的基本培养基中野生型能长而被杀死，缺陷型不能长被保存得以浓缩。

检出缺陷型的方法有逐个测定法、夹层培养法、限量补给法、影印培养法。

这里主要以逐个测定法为例进行说明。

把经过浓缩的缺陷型菌液接种在完全培养基上，待长出菌落后将每一菌落分别接种在基本培养基和完全培养基上。

凡是在基本培养基上不能生长而在完全培养基上能长的菌落就是营养缺陷型。

营养缺陷型菌株的筛选采用辐射，化学试剂等因素处理细菌，以提高其变异几率，关键步骤是进行营养缺陷型微生物的筛选工作，营养缺陷型是指通过诱变产生的，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变株。

营养缺陷型的筛选与鉴定涉及下列几种培养基：基本培养基（MM，符号为[-]）是指仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的合成培养基。

完全培养基(CM，符号为[+])是指可满足某种微生物的一切营养缺陷型菌株的营养需要的天然或半合成培养基。

补充培养基（SM，符号为[A]或[B]等）是指在基本培养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌株生长需求的合成或半合成培养基。

营养缺陷型菌株不仅在生产中可直接作发酵生产核苷酸、氨基酸等中间产物的生产菌，而且在科学实验中也是研究代谢途径的好材料和研究杂交、转化、转导、原生质融合等遗传规律必不可少的遗传标记菌种。

营养缺陷型的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型四个环节。

现分述如下：第一步，诱变剂处理：与上述一般诱变处理相同。

第二步，淘汰野生型：在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般较低。

通过以下的抗生素法或菌丝过滤法就可淘汰为数众多的野生型菌株即浓缩了营养缺陷型。

抗生素法有青霉素法和制霉菌素法等数种。

青霉素法适用于细菌，青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，杀死正在繁殖的野生型细菌，但无法杀死正处于休止状态的营养缺陷型细菌。

制霉菌素法则适合于真菌，制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起膜的损伤，也是只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌。

在基本培养基中加入抗生素，野生型生长被杀死，营养缺陷型不能在基本培养基中生长而被保留下来。

菌丝过滤法适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。

其原理是：在基本培养基中，野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。

通过过滤就可除去大部分野生型，保留下营养缺陷型。

第三步，检出缺陷型：具体方法很多。

简述营养缺陷型菌株的筛选方法营养缺陷型菌株是指在一定条件下，无法自主合成某些生物活性物质而需要外源性提供的菌株。

这类菌株在微生物研究和应用中具有重要意义。

本文将介绍几种常用的营养缺陷型菌株的筛选方法。

1. 选择基质筛选法选择基质筛选法是一种简单直接的筛选方法。

首先，根据所需筛选菌株的营养缺陷特点，选择一种含有该营养物质的基质。

然后，将待筛选的菌株接种于这种基质上进行培养。

如果菌株能够生长、繁殖，说明其具有该营养物质的合成能力；如果菌株无法生长、繁殖，说明其存在该营养物质的缺陷。

通过这种方法可以初步筛选出营养缺陷型菌株。

2. 诱变筛选法诱变筛选法是通过诱变剂对菌株进行处理，使其发生突变，进而筛选出营养缺陷型菌株。

常用的诱变剂有化学物质和物理因素。

化学物质如亚硝酸钠、硝酸钠等，物理因素如紫外线、γ射线等，这些诱变剂能够引起菌株的DNA发生突变。

在诱变后，将菌株接种到无法自主合成某种生物活性物质的培养基上，观察其生长情况。

如果菌株能够生长、繁殖，说明其突变后具有该物质的合成能力丧失，从而可以筛选出营养缺陷型菌株。

3. 基因敲除筛选法基因敲除筛选法是通过遗传工程手段将特定基因从菌株中删除，以筛选出营养缺陷型菌株。

首先，通过PCR扩增的方法获得待敲除基因的DNA片段，并引入到质粒载体中。

然后，将质粒载体导入到目标菌株中，经过转化或转染等方式使其取得该质粒。

接下来，通过选择性培养基筛选，以抗生素等为筛选标记，筛选出已经发生基因敲除的菌株。

最后，通过基因测序等方法验证所得菌株中目标基因已经被成功敲除，从而得到营养缺陷型菌株。

4. 遗传重组筛选法遗传重组筛选法是通过基因重组技术将特定基因导入到菌株中，使其能够合成原本无法自主合成的物质。

首先，将目标基因与适当的表达载体连接，并经过酶切、连接等操作获得重组质粒。

然后，将重组质粒导入到宿主菌株中，使其取得重组质粒。

最后，通过选择性培养基等筛选方法，筛选出成功获得目标基因的菌株。