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实验篇实验一实验器材的清洗实验物品（一）每一大组公用物品（每班分6大组）吸球4个、酒精棉球瓶两个、消毒水一瓶、吸瓶两个、计数板1块、洗液缸一个、95%酒精1瓶。
（二）每一小组公用物品（两人一小组）刻度吸管5毫升4支, 小漏斗1个、 80-200铜滤网1块、培养皿2个、 l00毫升盐水瓶及塞子4个、l0毫升盐水瓶及塞子1个、100ml培养瓶及塞子4个、10ml 培养瓶及塞子1个、镊子1个、剪刀1把、冻存管（1.5毫升，2毫升）2个、软毛刷2个、塑料盆一个。
（二）公用物品小滤器、大滤器2个、1000毫升量筒2个、100毫升量筒2个、家用剪刀、耐酸乳胶手套长的两双、短的四双、酒精一壶、玻璃棒几个、 0.22μm的小滤膜一盒、电炉3个。
清洗注意事项和要求（一）使用后的实验器材应立即投入清水中。
带毒的玻璃器皿需先浸泡在5％来苏儿或1％盐酸溶液中（依病毒的种类而定）1天以上或高压灭菌。
（二）浸泡、煮沸、酸泡的器皿内要充满液体，不得有气泡。
（三）煮沸前的水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗涤剂（直径35厘米的铝锅，用洗衣粉10克左右）；若洗涤剂和实验器材同时从冷水煮至沸腾或使用过量洗剂均易腐蚀玻璃表面，使玻璃碱化PH值上升。
（四）软毛刷的刷端已掉毛的应该弃去，否则会损害玻璃。
玻璃划痕处易残留洗涤剂,会改变培养液PH和毒害细胞。
（五）浸泡器材的蒸馏水容器要专用，并做好标记，如“蒸馏水1盆”、”蒸馏水2盆。
（六）器材清洗干燥后，在以后各步操作时，手指不可接触器材的使用端。
清洗者可戴一次性薄膜手套进行操作，这样省时又保证清洗质量。
（七）清洁物品应及时包装消毒，应注意妥善保存，防止落人灰尘、蟑螂、蚂蚁等引起二次污染。
（八）刷洗、酸泡后的器材要用流水振荡冲洗；不得残留洗涤剂、清洁液。
操作方法（一）清洗液（俗称酸液）的配制方法常用清洁液配方重铬酸钾100g，浓硫酸200ml，蒸馏水800ml。
以配置10000ml常用清洁液为例介绍如下：先在搪瓷盆或塑料盆中加入蒸馏水8000ml，称取1000g重铬酸钾，用玻璃棒搅拌直至溶解（可加热以辅助溶解），待重铬酸钾液冷却后，缓慢加入浓硫酸，边加边用玻璃棒搅动，以混合液温度不过快上升和不出现重铬酸钾结晶为度。
动物细胞培养实验报告第一篇：一、实验目的1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。
2、学习并掌握细胞传代培养的方法。
3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。
二、实验原理细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。
动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。
传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。
被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
三、细胞培养相关设施及材料1、细胞培养室无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。
孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。
制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。
储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。
清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。
2、细胞培养常用基本设施：荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。
实验一清洗与灭菌一、实验目的：能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。
二、实验原理清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。
体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。
细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。
清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。
如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。
灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。
假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。
以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。
三、实验材料、用品1．材料：无臭氧型紫外灯，微孔滤膜(直径25)：孔径为0．22μm，微孔滤膜(直径90)：孔径为0．22 μm，过滤器(直径25)。
2．药品：70％或75％酒精，0．1％新洁尔灭，煤酚皂溶液(来苏儿水)，0．5％过氧乙酸，乳酸，37％甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸(工业)。
3．仪器：超净台，干燥箱，高压蒸气灭菌锅，过滤器，过滤泵。
四、实验步骤(一)清洗1．新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡5％稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质。
2．使用过的玻璃器皿的清洗(1)使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。
(2)用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥。
(3)浸酸性洗液过夜。
(4)从酸性洗液捞出后自来水冲洗10．15次去除残余酸液，蒸馏水涮洗3次，倒置烘干。
(5)包装(牛皮纸或一般纸)。
(6)高压(15磅20 min)或干热(170℃2 h)灭菌。
(7)贮存备用。
3．胶塞的处理(1)新胶塞应先用清水清洗之后再用0．2％NaOH煮沸lO-20 min。
(2)自来水清洗10次。
(3)再用1％稀盐酸浸泡30 min。
第1篇实验名称：动物细胞代培养实验实验目的：1. 学习动物细胞培养的基本原理和方法。
2. 掌握动物细胞传代培养的操作步骤。
3. 观察细胞生长、增殖和衰老过程。
实验时间：2021年X月X日实验地点：实验室实验材料：1. 动物细胞系：小鼠成纤维细胞（NIH3T3）2. 培养基：DMEM培养基3. 细胞消化液：0.25%胰蛋白酶4. 抗生素混合液：青霉素（100U/ml）、链霉素（100μg/ml）5. 细胞培养瓶：25cm²6. 移液器：200μl、1000μl7. 吸管：5ml、10ml8. 酶标仪：波长450nm9. 电子显微镜10. 计时器实验方法：1. 细胞复苏：将冷冻保存的细胞从-80℃冰箱中取出，放入37℃水浴中解冻，然后将细胞转移到含有抗生素的DMEM培养基的细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
2. 细胞传代：待细胞生长至70%-80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，收集细胞，用DMEM培养基清洗细胞，计数，按照1:10的比例传代。
3. 细胞培养：将传代后的细胞接种于细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
4. 观察细胞生长：每隔24小时观察细胞生长情况，记录细胞数量、形态和活力。
5. 细胞衰老：培养细胞至第30代，观察细胞衰老特征，如细胞形态、活力等。
实验结果：1. 细胞复苏：复苏后的细胞呈圆形，细胞活力较高。
2. 细胞传代：细胞传代过程中，细胞活力保持稳定，细胞数量逐渐增加。
3. 细胞培养：培养过程中的细胞形态良好，细胞活力较高。
4. 细胞生长：细胞数量在培养过程中呈指数增长，符合细胞增殖规律。
5. 细胞衰老：细胞培养至第30代时，细胞形态发生改变，细胞活力下降，出现衰老特征。
实验讨论：1. 动物细胞培养过程中，细胞的生长、增殖和衰老是细胞生命活动的基本过程。
本实验通过观察细胞生长、增殖和衰老过程，了解了动物细胞代培养的基本原理和方法。
2. 细胞传代过程中，细胞活力保持稳定，细胞数量逐渐增加，说明本实验操作规范，细胞培养条件适宜。
动物细胞培养技术[适用对象] 环境科学专业[实验学时] 4学时一、实验目的掌握小白鼠细胞的培养技术，掌握显微镜直接计数法统计已知体积的培养基中的细胞数目。
二、预习与参考参考实验指导书，结合实验特色查阅相关文献资料进行实验设计。
三、实验内容1.取5个月龄的小白鼠一只，以最快的速度把小白鼠处死，处死之后应尽快对组织进行提取。
2.将小白鼠细胞放入培养基中培养，然后放入恒温培养箱培养。
3.拿出培养皿使用直接计数法统计已知体积的培养基中的细胞数目。
四、主要设备功能和材料清单恒温培养箱。
培养皿。
小白鼠。
五、实验要求正确使用显微镜，掌握培养计数法统计细胞数目。
六、实验报告要求1、根据实验要求，在实验时间内到实验室进行实验时，一边测量，一边记录实验数据。
报告要求准确、美观。
2、在实验中，如果发生实验测量数据与事先的计算数值不符，甚至相差过大，此时应该找出原因，不能不了了之。
同时要把通过实验所测量的数据与计算值加以比较，如果误差一般5％以下。
3、在报告的最后要完成指导书上要求解答的思考题。
七、思考题1.比较平板计数法与显微镜计数法的不同？2.培养基在培养箱中培养需要注意哪些事项？八、实验成绩评定办法本门实验课程考核成绩占课程总成绩的30％，考核分实验预习、实验过程操作、实验报告和实验技能等四个方面，其成绩计算为预习实验（包括资料搜集）占10%、实验过程操作（包括实验流程、调试过程）占25％、实验报告（包括原理描述、数据记录、实验结果和效果）占25％、实验技能考核（包括解决问题的能力）或考试占40％。
凡考核不及格者，应参加补考或重修。
动物细胞培养实验方案一、实验目的：1.掌握动物细胞的培养技术；2.了解动物细胞的生长特点和培养条件要求；3.学习观察和分析动物细胞的形态变化和生长状态。
二、实验器材与试剂准备1.器材：细胞培养器皿（如培养皿、蜡烛罩、CO2培养箱等）、离心机、显微镜、细胞计数板、计时器等；2.试剂：细胞培养基、培养液添加剂（如酶、抗生素等）、PBS缓冲液、生长因子、染色剂等。
三、实验步骤1.细胞培养基的配制：按照制定的配方将培养基粉末加入适量的无菌去离子水中，搅拌均匀后，进行高温高压灭菌，冷却后分装至培养器皿中；3.细胞处理和接种：将收集到的组织先用PBS缓冲液洗涤，然后使用细胞裂解酶或胰酶等消化酶消化组织，使细胞分散，处理成单个细胞后，用细胞计数板计数，并将细胞悬液接种到预先准备好的培养器皿中；4.细胞培养条件的控制：将培养器皿置于CO2培养箱中，设定适当的温度（通常为37℃）、湿度和CO2浓度（通常为5%），并保持稳定；5.细胞培养的观察和记录：观察培养皿中细胞的形态变化和生长状态，记录细胞的外观、增殖情况、易于观察的指标等；6.细胞的子培养和冻存：当细胞达到一定密度时，可以进行子培养，即将细胞从一个培养皿中转移到新的培养皿中，以促进细胞的增殖和保存细胞生物资料。
此外，也可以将分散的细胞加入由培养液和冻存剂组成的试管中，通过冷冻的方式保存细胞，并用于后续的实验。
四、实验控制与常见问题的解决1.环境控制：细胞培养箱中的温度、湿度和CO2浓度的调整应尽量保持稳定；2.培养基的配制：根据细胞培养物的不同，可以选择不同配方的培养基，确保培养基的质量符合要求；4.洗涤步骤：组织或细胞的洗涤步骤应轻柔，避免对细胞的损伤；5.细胞的接种量：对于粘附性细胞，接种量应适当，以避免细胞过度堆积或过度稀释。
五、实验结果和分析观察培养皿中细胞的生长状态、细胞数量以及形态的变化，记录生长状态、增殖情况和其他可以观察到的指标，并进行数值化分析和统计。
实验篇实验一实验器材的清洗实验物品（一）每一大组公用物品（每班分6大组）吸球4个、酒精棉球瓶两个、消毒水一瓶、吸瓶两个、计数板1块、洗液缸一个、95%酒精1瓶。
（二）每一小组公用物品（两人一小组）刻度吸管5毫升4支, 小漏斗1个、 80-200铜滤网1块、培养皿2个、 l00毫升盐水瓶及塞子4个、l0毫升盐水瓶及塞子1个、100ml培养瓶及塞子4个、10ml 培养瓶及塞子1个、镊子1个、剪刀1把、冻存管（1.5毫升，2毫升）2个、软毛刷2个、塑料盆一个。
（二）公用物品小滤器、大滤器2个、1000毫升量筒2个、100毫升量筒2个、家用剪刀、耐酸乳胶手套长的两双、短的四双、酒精一壶、玻璃棒几个、 0.22μm的小滤膜一盒、电炉3个。
清洗注意事项和要求（一）使用后的实验器材应立即投入清水中。
带毒的玻璃器皿需先浸泡在5％来苏儿或1％盐酸溶液中（依病毒的种类而定）1天以上或高压灭菌。
（二）浸泡、煮沸、酸泡的器皿内要充满液体，不得有气泡。
（三）煮沸前的水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗涤剂（直径35厘米的铝锅，用洗衣粉10克左右）；若洗涤剂和实验器材同时从冷水煮至沸腾或使用过量洗剂均易腐蚀玻璃表面，使玻璃碱化PH值上升。
（四）软毛刷的刷端已掉毛的应该弃去，否则会损害玻璃。
玻璃划痕处易残留洗涤剂,会改变培养液PH和毒害细胞。
（五）浸泡器材的蒸馏水容器要专用，并做好标记，如“蒸馏水1盆”、”蒸馏水2盆。
（六）器材清洗干燥后，在以后各步操作时，手指不可接触器材的使用端。
清洗者可戴一次性薄膜手套进行操作，这样省时又保证清洗质量。
（七）清洁物品应及时包装消毒，应注意妥善保存，防止落人灰尘、蟑螂、蚂蚁等引起二次污染。
（八）刷洗、酸泡后的器材要用流水振荡冲洗；不得残留洗涤剂、清洁液。
操作方法（一）清洗液（俗称酸液）的配制方法常用清洁液配方重铬酸钾100g，浓硫酸200ml，蒸馏水800ml。
以配置10000ml常用清洁液为例介绍如下：先在搪瓷盆或塑料盆中加入蒸馏水8000ml，称取1000g重铬酸钾，用玻璃棒搅拌直至溶解（可加热以辅助溶解），待重铬酸钾液冷却后，缓慢加入浓硫酸，边加边用玻璃棒搅动，以混合液温度不过快上升和不出现重铬酸钾结晶为度。
实验时间实验内容4月11日实验一培养用液的配制、除菌与分装4月18日实验二细胞的传代培养4月25日实验三鱼类细胞原代培养（组织块法）（1-5组）401实验四染色体制备（6-10组）3015月2日实验三鱼类细胞原代培养（组织块法）（6-10组）401实验四染色体制备（1-5组）3015月9日实验五细胞的复苏与冻存实验一培养用液的配制、除菌与分装【实验目的】1.掌握常见培养用液的配制方法。
2.掌握常用的灭菌方法。
3.了解每种培养用液的作用。
【实验原理】常用细胞培养用液包括磷酸盐平衡盐溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、液体培养基、胰蛋白酶（Trypsin）和EDTA溶液。
PBS用于清洗细胞、配制胰蛋白酶和EDTA。
培养基含有细胞生长需要的各种营养元素，使用时通常还需填加血清和抗生素。
鱼类细胞培养的培养基常用种类是MEM 和L-15；用于动物的一般是DMEM和RPMI-1640。
胰蛋白酶可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。
EDTA 用于清洗细胞表面，螯合Ca2+等二价离子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。
细胞培养用的试剂必需是无菌的，PBS和EDTA可以采用高压灭菌，而培养基和胰蛋白酶溶液含生物活性物质，配制好后通过过滤除菌。
【试剂、材料与仪器】试剂：NaCl，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，EDTA，胰蛋白酶，HEPES，碳酸氢钠，盐酸，MEM或PRMI-1640培养基干粉，GPS材料：三蒸水，蒸馏水瓶，药匙，称量纸，烧杯（250 mL、1000 mL），玻棒，精密pH 试纸（6.8-8.0），容量瓶（250 mL、1000 mL），移液管（5 mL、10 mL），一次性注射器，一次性过滤器，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，酒精喷壶，消毒纱布，已高压灭菌试剂瓶（500 mL、250 mL、100 mL），记号笔，标签纸，橡胶手套，封口膜仪器：精密天平，高压灭菌锅，超净工作台，加液枪，4℃冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。
实验动物细胞培养基础实验技术——器械的清洗与消毒实验目的：学习并掌握细胞培养使用的器皿、器械的洗涤和消毒。
实验用品：1．仪器和用品：超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤器、紫外灯、0.22μm/0.45μm微孔滤膜。
2．试剂：75%酒精、5%HCl、1‰新洁尔灭、重铬酸钾。
实验内容：1．准备培养用血清瓶（PBS、培养基，约10套，包括20、50ml）、培养瓶（50个）、玻璃滴管（若干）、离心管（10ml）、EP管若干、不锈钢滤器、胶塞、滴头等。
2．分别包装上述物品，其中血清瓶和瓶盖分别包装，玻璃吸管置于不锈钢筒中、玻璃离心管、 EP管分别置于饭盒中。
3．将上述物品置于高压灭菌锅中进行消毒灭菌。
4．实验室准备。
实验步骤（一）清洗1．玻璃器皿的清洗浸泡刷洗浸酸冲洗（1）. 新购玻璃血清瓶先用洗衣粉洗，再以0.1-0.05 mol/l HCl 浸泡数小时，然后用铬酸浸泡过夜，最后用自来水、一次与二次去离子水洗净后才能开始使用。
（2）. 用过之玻璃血清瓶，用洗衣粉洗净后铬酸浸泡过夜，最后用自来水、用一次与二次去离子水冲洗干净。
此外，玻璃器皿的瓶子的盖子必须也泡铬酸，培养瓶瓶盖可以不用泡铬酸，高温灭菌的时候要拧上瓶盖，留有一定的缝隙，灭菌后盖紧。
瓶盖的上面应当用锡箔纸或者牛皮纸包住，用绳子扎紧2．塑料器皿的清洗自来水充分浸泡冲洗 2%NaOH浸泡过夜蒸馏水漂洗3次 2%-5%盐酸浸泡30min 自来水冲洗晾干紫外线照射30min3．胶塞等橡胶类的清洗自来水冲洗 2%NaOH 煮沸15min 自来水冲洗蒸馏水煮沸10min 自来水冲洗5次以上2%-5%HCl煮沸15min 晾干晾干后高压灭菌4．金属器械的清洗新购置的器械用过的器械（二）包装分为局部包装和全包装。
为了防止消毒灭菌后再次遭受污染。
按照不同类别进行包装。
（三）消毒灭菌主要包括物理法和化学法。
物理法：热灭菌、蒸汽灭菌、滤过除菌、紫外线、熏蒸消毒、煮沸消毒。
实验十五动物细胞培养技术及其应用一．实验目的通过本实验使学生掌握细胞培养、细胞检测和细胞表达等成套技术的原理和方法。
二. 实验内容1.培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏等基本技术；2.细胞生长曲线测定、细胞活性检测等常用技术；3.细胞污染检测方法与技术；4.病毒在细胞中的感染与增殖、重组病毒异源蛋白的细胞表达等实用技术。
三．实验用品1. 材料：Sf 细胞、Hi5 细胞等2. 器材：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、培养基抽滤装置、电泳仪、离心机、pH计、液氮罐（含液氮）、水浴锅、温度计、培养瓶、血清瓶、5 ml和10 ml 移液管、不锈钢移液管筒、大小不锈钢饭盒、酒精灯、吸耳球、血球计数板、96孔板、24孔板、无菌冻存管、离心管、记号笔、一次性过滤器、微量加样器、精密pH试纸、酒精棉球等3. 试剂与药品：Grace培养基、胎牛血清、甘油、DMSO、双抗（青霉素、链霉素）100 u/ml、Hank’s液、胰蛋白酶、台盼蓝、液氮、分析纯无水酒精、95%医用酒精、Tris碱、硼酸、EDTA、琼脂糖粉（电泳用）、dNTPs、Taq酶、支原体检测试剂盒、DNA提取试剂盒DNeasy Blood & Tissue kit （Qiagen）等。
四．实验方法与步骤（一）培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏1. 缓冲液及培养基配制Hank’s液：KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml，高压灭菌。
4℃下保存。
胰蛋白酶液：称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。
4%台盼蓝染液：称取台盼蓝4克，加双蒸水至100 ml。
MTT溶液：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的Hank’s液中。
实验篇实验一实验器材的清洗实验物品（一）每一大组公用物品（每班分6大组）吸球4个、酒精棉球瓶两个、消毒水一瓶、吸瓶两个、计数板1块、洗液缸一个、95%酒精1瓶。
（二）每一小组公用物品（两人一小组）刻度吸管5毫升4支, 小漏斗1个、 80-200铜滤网1块、培养皿2个、 l00毫升盐水瓶及塞子4个、l0毫升盐水瓶及塞子1个、100ml培养瓶及塞子4个、10ml 培养瓶及塞子1个、镊子1个、剪刀1把、冻存管（1.5毫升，2毫升）2个、软毛刷2个、塑料盆一个。
（二）公用物品小滤器、大滤器2个、1000毫升量筒2个、100毫升量筒2个、家用剪刀、耐酸乳胶手套长的两双、短的四双、酒精一壶、玻璃棒几个、 0.22μm的小滤膜一盒、电炉3个。
清洗注意事项和要求（一）使用后的实验器材应立即投入清水中。
带毒的玻璃器皿需先浸泡在5％来苏儿或1％盐酸溶液中（依病毒的种类而定）1天以上或高压灭菌。
（二）浸泡、煮沸、酸泡的器皿内要充满液体，不得有气泡。
（三）煮沸前的水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗涤剂（直径35厘米的铝锅，用洗衣粉10克左右）；若洗涤剂和实验器材同时从冷水煮至沸腾或使用过量洗剂均易腐蚀玻璃表面，使玻璃碱化PH值上升。
（四）软毛刷的刷端已掉毛的应该弃去，否则会损害玻璃。
玻璃划痕处易残留洗涤剂,会改变培养液PH和毒害细胞。
（五）浸泡器材的蒸馏水容器要专用，并做好标记，如“蒸馏水1盆”、”蒸馏水2盆。
（六）器材清洗干燥后，在以后各步操作时，手指不可接触器材的使用端。
清洗者可戴一次性薄膜手套进行操作，这样省时又保证清洗质量。
（七）清洁物品应及时包装消毒，应注意妥善保存，防止落人灰尘、蟑螂、蚂蚁等引起二次污染。
（八）刷洗、酸泡后的器材要用流水振荡冲洗；不得残留洗涤剂、清洁液。
操作方法（一）清洗液（俗称酸液）的配制方法常用清洁液配方重铬酸钾100g，浓硫酸200ml，蒸馏水800ml。
以配置10000ml常用清洁液为例介绍如下：先在搪瓷盆或塑料盆中加入蒸馏水8000ml，称取1000g重铬酸钾，用玻璃棒搅拌直至溶解（可加热以辅助溶解），待重铬酸钾液冷却后，缓慢加入浓硫酸，边加边用玻璃棒搅动，以混合液温度不过快上升和不出现重铬酸钾结晶为度。
配好后倒入洗液缸中备用。
新配制的清洁液呈棕红色。
当使用时间过久，清洁液的颜色变暗、发绿或混浊时，应弃去（深埋地下），配制新的。
配制、盛装清洁液的容器应防酸、耐热、有较大的开口，一般用瓷缸、玻璃制品或耐酸塑料制品。
（二）物品的清洗1、新购置物品玻璃器皿清洗步骤清水浸泡半小时以上→简单刷洗→5%的稀盐酸浸泡过夜→自来水冲洗→在洗涤剂中反复刷洗→自来水中充分冲洗→凉干（或50℃烤干）→浸入清洁液中（俗称浸酸）过夜→流水振荡冲洗20遍→漓水→去离子水冲洗3～4次或浸泡2次（每次24小时）→三蒸水冲洗两次（或浸泡一次）→50℃烤干，待包装。
2、用过的玻璃器皿清洗步骤带毒玻璃器材用后应立即浸入消毒水中，非带毒的玻璃器材需浸入清水中浸泡→刷洗→自来水冲洗→凉干（50℃烤干）→浸入清洁液中（俗称浸酸）过夜→流水振荡冲洗20遍→漓水→去离子水冲洗3～4次或浸泡2次（每次24小时）→三蒸水冲洗两次（或浸泡一次）→50℃烤干，待包装。
3、橡皮帽和橡皮塞的清洗新购置的橡胶制品（大小胶塞、橡皮胶头）的洗涤方法如下；2%NaOH煮沸15分钟→流水冲洗→2～5%稀HCl煮沸15分钟→流水冲洗→去离子水煮沸20分钟（或去离子水浸泡过夜）→去离子水冲洗一次→三蒸水煮沸20分钟→三蒸水冲洗一次→50℃烤干备用．4、塑料制品（塑料培养板、针头式加压塑料小滤器）的清洗用后立即用流水冲洗→浸于自来水中过夜→用纱布或棉签刷洗→流水冲洗→晾干→浸于清洁液中15分钟→流水冲洗20遍→去离子水浸洗三次→双蒸水中浸泡24小时→晾干备用。
注射器薄膜滤器刷洗前先将上、下两部分分开，按上述方法清洗晾干后将纤维薄膜滤片夹在中间（光面向下）拧紧上下两部分，备用。
5、不锈钢除菌滤器的清洗先用洗涤剂刷洗滤器→流水冲洗15分钟→去离子水冲洗2～3次（去离子水浸泡24小时）→三蒸水冲洗2～3次或浸泡24小时→干燥备用。
6、镊子、剪刀纱布擦去脏污→自来水洗净→酒精棉球擦试。
7、金属滤网自来水冲洗→蒸馏水冲洗→三蒸水冲洗。
实验二实验器材的包装和消毒实验用品实验一中清洗的所有物品、脱脂棉一卷/班、纱布一卷/班、高压锅一个/班、无菌操作台一台/组、牛皮纸1张/组，纸绳一卷/组、塞脱脂棉用的针头或牙签、记号笔一个/组。
实验方法（一）包装1、包装时手指与器材接触面积要小，手指不能触及器材的使用端。
2、瓶类：需用局部包扎，用牛皮纸包扎。
随后单个或几个一起用纸包好。
3、玻璃管道口（尖吸管、移液管手持端、抽滤瓶下口端等）加脱脂棉，吸管、滴管，随后置玻璃吸管筒或铜制、铝制吸管筒内（内放纱布），塞上棉塞或盖上有孔盖子（内外孔对好），外包上两层牛皮纸，若没有吸管筒应每根吸管单独包扎。
4、带盖的瓶子或塑料离心管等物品应拧松盖子，包装消毒后再拧紧。
6、为防止已消毒品和未消毒品发生混淆，应在包装盒或包装纸的表面注以符号或写上字“－”“＋”。
（二）器皿的消毒干热消毒主要用于玻璃器皿的消毒。
160℃、l20分钟，消毒后不要立即打开箱门，以防止冷空气骤然进入引起玻璃炸裂，影响消毒效果。
湿热消毒即高压蒸汽消毒：布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿以及某些培养用液等都可用此方法消毒灭菌。
消毒时间是从压力达到15磅，温度达到121℃时算起。
一般蒸气消毒30分钟。
橡皮手套和储在小瓶内的溶液都不应超过15分钟。
消毒后，调节活塞使压力在7分钟左右均匀地下降到零。
这样能使任何可能存在的液体得以与周围蒸气以相同的速度散热，而不至于激烈的沸腾。
各种物品有效消毒压力和时间不同，一般要求如下：培养用液、橡胶制品 l0磅l0分钟布类、玻璃制品、金属器械等 15磅20分钟实验三培养用液的配置实验用品实验器材：1000ml的量筒2个，1000ml的烧杯2个，磁力搅拌器一台，玻璃棒两个，感量0.1mg的分析天平,100ml的盐水瓶若干,化学试剂:NaCl,KCl, KH2PO4 ,Na2HPO4.12H2O 2.85g 或Na2HPO4.2H2O, NaHCO3, 小牛或胎牛血清,胰蛋白酶,醋酸。
实验要求及方法（一）PBS液实验室常用含0.85%,pH7.2的PBS(简称pH7.2的PBS)1.PBS贮存液配法NaCl(AR) 8.5g； KCl(AR) 0.2g； KH2PO4 0.27g；Na2HPO4.12H2O 2.85g (或Na2HPO4.2H2O 1.13g) 溶于100ml双蒸水中。
2.PBS应用液配法取贮存液50ml加双蒸水450ml即成,经103kPa(121.3℃)15分钟灭菌,置室温或4℃保存备用。
3．配制BSS液的要求（l）BSS液中各试剂规格为一级GR试剂（guaranteed reagent）或二级AR （analytic reagent）试剂.（2）配制后液体呈桃红色，pH 7.4左右没有混浊和沉淀。
（3）含钙镁离子的物质要单独溶解.（4）可配制10倍浓度的贮存液，滤过消毒，分装，每瓶10毫升；冰箱保存。
使用时每瓶加三蒸水至 l00毫升。
（5）配制离散细胞用的消化液和细胞洗涤液时，宜采用无钙、离子的D—Hanks 液，或PBS液。
（二）血清灭活处理的方法:1.选用与血清瓶同规格的对照瓶一个。
2.对照瓶内放入与血清等体积的水。
3.温度预试：使水浴锅温度保待在56℃。
放入内4～5支温度计，选择2～3支温度计，4.血清灭活：血清瓶与带温度计的对照瓶一齐放入水浴箱中，待温度计所示温度上升至56℃时定时30分钟。
5.大瓶血清灭活后进行分装。
6.分装后，抽样做无菌试验，－20～－70℃保存。
（三）配制合成培养基（液）注意事项。
1．用三天内制备的玻璃三蒸水配制培养液2．按二周用量配制为宜，配量过多，存放时间过长会造成培养基老化、变质、产生沉淀。
3．培养液中各成分是否完全溶解的判断方法：将培养液置室温或4℃冰箱30分钟后，观察瓶底有无颗粒产生。
4．根据实验需要，在培养液中加入适量37℃单独溶解的NaHCO3溶液。
正常体细胞培养液中NaHCO3量为20～22克／升，肿瘤细胞为1.5～1.7克／升。
5．干粉培养基不易溶于水，实验室采用空气CO2助溶法即将甲液在磁场上搅拌一段时间，当甲液pH值下降到5.8左右时（橙黄色）氨基酸和维生素基本溶解,在甲液内再加入溶解有NaHCO3的乙液，两液混和后，营养液pH值为7.0～7.1，抽滤后pH值上升0.1。
此法操作简便，营养液pH值稳定。
（四）胰蛋白酶液胰蛋自酶是一种黄白色粉末，水解蛋白质时作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架．从而使细胞分离。
胰蛋白酶的活力是用解离酪蛋白的能力表示的，常用的有1：125和1:250两种,即1份胰蛋白酶能解离125份或250份酪蛋白。
不同的细胞对胰蛋白酶液的浓度、作用温度和作用时间等要求也不一样。
一般来说，浓度越大、温度越高、作用时间越长，对细胞的分离能力也越大，但超过一定限度就会损伤细胞。
常用的胰蛋白酶液的浓度是0.25％利0.125％，作用温度37℃或室温，pH7.4左右。
Ca2+ Mg2+和血清的存在都会降低其活力O.25％胰蛋白酶液的配制方法如下。
l.过滤消毒法。
①按实验需要称取酶粉，用少量D-Hanks液或PBS液将胰蛋白酶粉调成糊状。
②加适量D-Hanks液或PBS液(橙红色)，磁力搅拌溶解③溶解后的酶液（深红色）滤过除菌，分装，-20℃冻存。
2.高热消毒法。
利用胰蛋白酶在酸性条件下有较好的热稳定性对其进行高热消毒。
①、按实验需要称取酶粉溶于1毫摩尔／升pH3.0的HCl中。
②、酶液和2倍D－Hanks液同时在0.1兆帕，120℃条件下灭菌20分钟。
③、两液冷却至室温时，等量混匀。
酶液浓度高时，消毒后有少量的沉淀，去除沉淀后，两液等体积混匀。
然后用10摩尔／升的NaOH调消化液PH值至7.2（橙红色或深红色）④、经计算，消毒后酶浓度下降50％。
如消毒前酶浓度为0.1%～0.5％，消毒后为0.05％～O.25％。
高热消毒法比过滤消毒法更加简便、安全、可靠。
（五）PH调整液1、 NaHCO3溶液常用的浓度有7.4％、5.6％、3.7％三种，配制时37℃三蒸水溶解后通过滤膜过滤除菌，分装于安瓶中4℃冰箱保存，每支一次用完。
使用时，NaHCO3液要逐滴加入，并不时搅动培养液。
以防pH值过高。
2、 10％醋酸液高压灭菌,分装， 4℃冰箱保存。
使用方法和要求同NaHCO3液。
（六）200毫摩尔／升L-谷氨酰胺L－谷氨酰胺2.9222克（M=146.15），加适量50℃三蒸水溶解．定容至l00毫升，滤过除菌，1毫升／安瓶，一20℃保存使用时每 l00毫升培养基中加 1毫升谷氨酰胺。
