真菌膜蛋白提取方法

植物膜蛋白提取方法说实话植物膜蛋白提取这事，我一开始也是瞎摸索。

我试过超声破碎法来提取。

就像敲鸡蛋，想把里头的东西弄出来那种感觉。

把植物组织放在缓冲液里，然后用超声仪来破碎细胞。

可是我发现这种法子很容易把膜也给弄破喽，得到的膜蛋白纯度不咋高，好多其他乱七八糟的东西都混进去了。

这就好比炒菜的时候把不该放的调料都倒进去了，最后味道全乱套了。

后来呢，我又尝试了差速离心法。

这就像挑豆子，把大的小的分开那样。

先把植物组织破碎后，通过不同的离心速度把细胞器啊什么的和膜蛋白分离开。

开始的时候我老是掌握不好离心速度和时间，要么离心速度不够，那些东西分不开，要么就是离心太久了，把想要的膜蛋白都给弄丢了一部分。

经过好多次的尝试，我才慢慢摸准了一点规律。

比如说，先低速度短时间离心去掉那些大的残渣，然后再逐步提高离心速度和延长时间来纯化膜蛋白。

我有段时间还听别人说密度梯度离心法好使。

这方法有点像从水里分层捞东西。

就是用不同浓度的溶液形成一个密度梯度，然后离心，让膜蛋白在适合它密度的那个层面停下来，这样和其他物质分离开。

但是这个方法操作起来比较麻烦，各种溶液的配制就要很精确，我就老在这上面出错，溶液配不对后续根本得不到像样的结果。

还有就是用化学试剂来提取。

比如说表面活性剂。

这就跟用清洁剂去油污有点像，表面活性剂能把膜蛋白从细胞膜上给“扒拉”下来。

不过这化学试剂的种类和浓度可得选好了，选错了就像洗衣粉放太多把衣服都洗坏了似的，膜蛋白的活性啥的就全没了。

我就在选择表面活性剂的种类和浓度上栽过跟头，试了好多种，结果都不理想，不是蛋白没有提取出来就是提取出来的蛋白变性了失去活性了。

如果是新手上路的话，我觉得差速离心法可以先试试，毕竟相对来说比较直白一点，虽然可能会碰到不少问题，但是在调整离心速度和时间的过程中可以慢慢学习。

可千万别像我刚开始的时候，只知道按照书上的数值来，实际情况和书上可能有差别，要多做尝试才行。

在操作的全过程里，实验设备的清洁也很重要。

真菌蛋白提取方法一TCA/丙酮法1 液氮将菌体研磨为粉末；2 向匀浆中加入10倍体积的丙酮（含13.3% (w/v) TCA和0.093% β巯基乙醇），过夜沉降；3 4 度20,000g 离心15 min；4 移处上清，用冰冷的含0.07% (v/v) β－巯基乙醇的丙酮清洗沉淀两次；5 离心后，沉淀干燥至丙酮挥发完全。

二酚抽提法1 在液氮中将 1g 菌体研磨为粉末2 加入 6 ml 水饱和酚（buffer-saturated phenol）和 2 ml提取液（20mMTris-Cl, pH 7.5, 0.5% Triton X-100 (v/v), 0.5M EDTA, pH 7.5, pH 8.0,0.07% β－巯基乙醇, protease inhibitors）。

3 在4度混合30分钟。

4 12000 rmp 离心1min，使两相分开。

5 弃沉淀，吸取上层的苯酚相，加入5倍体积的冷丙酮，-20度沉降2h。

6 12000 rmp，4度，离心15分钟沉淀蛋白，弃去上清。

7 沉淀干燥至丙酮挥发完全。

三提取液抽提丙酮沉淀法1 预先将研钵置于－20℃的冰箱内冷冻。

2 取液氮冻存的菌体，放入预冷的研钵内研磨至粉末状。

3 向匀浆中加入2倍体积的抽提液（20mM Tris-Cl, pH 7.5, 0.5% Triton X-100(v/v), 0.5M EDTA, pH 7.5, pH 8.0, 0.07% β－巯基乙醇, protease inhibitors）。

4 混匀后4度震荡30分钟，以便蛋白溶解。

5 12000 rmp，4度，离心15分钟，吸取上清于另一EP管中。

7 向上清液中加入5倍体积的预冷丙酮（含有0.07％β－巯基乙醇），混匀，－20℃，2小时沉淀蛋白质。

8 12000 rmp，4度，离心15分钟沉淀蛋白。

弃去上清，沉淀用乙醇洗三次，自然干燥蛋白沉淀。

四甲醇氯仿水沉淀法Chloroform /Methanol/Water Precipitation1 预先将研钵置于－20℃的冰箱内冷冻。

1分离组织膜蛋白的方法：1、取组织，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。

2、J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。

3、100000g，4℃离心1hr。

弃去上清，沉淀用适量的Buffer B重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。

4、收集所得上清液即为膜组份。

Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。

冰上预冷。

Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。

冰上预冷。

2取约0.1g肝组织，加入2ml粉碎缓冲液，冰浴中超声粉碎，每次20秒，间隔30秒，共3次，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞浆蛋白，沉淀部分加入1ml胞膜蛋白提取液，超声粉碎，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞膜蛋白。

样品蛋白含量测定采用酚试剂法。

3我们实验室提取膜蛋白的方法如下：1．将细胞种于T75 或T175的培养瓶中培养数天，细胞铺满瓶底后，吸去培养液。

将PBS/EDTA 溶液(NaCl:0.1M,NaH2PO4:0.01M,EDTA:0.04%)加入量以覆盖细胞为止，置于培养箱或在超净台内消化3～5分钟，如仍未脱落瓶底，用吸管吹打，使细胞完全脱落。

2．收集细胞悬液于10毫升或50毫升的离心管中，1000rpm离心10分钟，去上清液。

提取膜蛋白的方法提取膜蛋白是一项关键的实验步骤，用于研究膜蛋白的结构和功能。

本文将介绍几种常用的膜蛋白提取方法。

1. 浸泡法浸泡法是一种简单的膜蛋白提取方法。

将细胞或组织样品置于适当的缓冲液中，如磷酸盐缓冲液或生理盐水中，并加入一些溶解剂（如阴离子洗涤剂）以破坏膜结构。

浸泡一段时间后，离心以分离出溶液中的膜蛋白。

2. 磷脂双层溶液法磷脂双层溶液法利用磷脂双层膜的特性来提取膜蛋白。

首先，将细胞或组织样品放入含有磷脂双层的液体中。

磷脂双层膜与细胞膜相似，可吸附并保持膜蛋白的结构和功能。

然后，用洗涤液洗涤磷脂双层，使膜蛋白释放到洗涤液中。

3. 超声法超声法是一种物理方法，通过超声波的能量来提取膜蛋白。

将细胞或组织样品置于含有缓冲液的管中，并使用超声波处理。

超声波的能量可以破坏细胞膜结构，使膜蛋白溶解到缓冲液中。

然后，对溶液进行离心，将膜蛋白分离出来。

4. 酸碱提取法酸碱提取法利用pH的变化来提取膜蛋白。

首先，将细胞或组织样品放入酸性或碱性溶液中，并搅拌。

酸性或碱性环境可以破坏细胞膜结构，使膜蛋白溶解到溶液中。

然后，通过调整pH值，使膜蛋白沉淀，进一步提纯。

5. 亲水基质法亲水基质法是一种通过亲水基质与疏水膜蛋白的选择性结合来提取膜蛋白的方法。

细胞或组织样品与亲水基质接触，亲水基质与细胞膜的亲水区域结合，使膜蛋白释放到溶液中。

然后，通过离心和洗涤步骤来分离和纯化膜蛋白。

这些方法在膜蛋白的研究中应用广泛，但根据具体的实验目的和样品特性，可以选择适合的方法进行膜蛋白提取。

实验中还应注意选择合适的缓冲液、溶液浓度和温度，并结合离心、洗涤等步骤进行蛋白的纯化和分离。

此外，需要根据实验目的选择合适的检测方法，如SDS-PAGE、Western blot等来确定提取的膜蛋白的质量和纯度。

总之，膜蛋白提取是膜生物学研究的重要一环，不同方法适用于不同的样品和实验要求。

正确选择和操作提取方法可以高效地提取膜蛋白，并为后续研究提供可靠的样品。

真菌蛋白提取方法一TCA/丙酮法1 液氮将菌体研磨为粉末；2 向匀浆中加入10倍体积的丙酮（含13.3% (w/v) TCA和0.093% β巯基乙醇），过夜沉降；3 4 度20,000g 离心15 min；4 移处上清，用冰冷的含0.07% (v/v) β－巯基乙醇的丙酮清洗沉淀两次；5 离心后，沉淀干燥至丙酮挥发完全。

二酚抽提法1 在液氮中将 1g 菌体研磨为粉末2 加入 6 ml 水饱和酚（buffer-saturated phenol）和 2 ml提取液（20mMTris-Cl, pH 7.5, 0.5% Triton X-100 (v/v), 0.5M EDTA, pH 7.5, pH 8.0,0.07% β－巯基乙醇, protease inhibitors）。

3 在4度混合30分钟。

4 12000 rmp 离心1min，使两相分开。

5 弃沉淀，吸取上层的苯酚相，加入5倍体积的冷丙酮，-20度沉降2h。

6 12000 rmp，4度，离心15分钟沉淀蛋白，弃去上清。

7 沉淀干燥至丙酮挥发完全。

三提取液抽提丙酮沉淀法1 预先将研钵置于－20℃的冰箱内冷冻。

2 取液氮冻存的菌体，放入预冷的研钵内研磨至粉末状。

3 向匀浆中加入2倍体积的抽提液（20mM Tris-Cl, pH 7.5, 0.5% Triton X-100(v/v), 0.5M EDTA, pH 7.5, pH 8.0, 0.07% β－巯基乙醇, protease inhibitors）。

4 混匀后4度震荡30分钟，以便蛋白溶解。

5 12000 rmp，4度，离心15分钟，吸取上清于另一EP管中。

7 向上清液中加入5倍体积的预冷丙酮（含有0.07％β－巯基乙醇），混匀，－20℃，2小时沉淀蛋白质。

8 12000 rmp，4度，离心15分钟沉淀蛋白。

弃去上清，沉淀用乙醇洗三次，自然干燥蛋白沉淀。

四甲醇氯仿水沉淀法Chloroform /Methanol/Water Precipitation1 预先将研钵置于－20℃的冰箱内冷冻。

（完整word版）膜蛋白提取1分离组织膜蛋白的方法：1、取组织，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。

2、J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。

3、100000g，4℃离心1hr。

弃去上清，沉淀用适量的Buffer B 重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。

4、收集所得上清液即为膜组份。

Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。

冰上预冷。

Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。

冰上预冷。

2取约0.1g肝组织，加入2ml粉碎缓冲液，冰浴中超声粉碎，每次20秒，间隔30秒，共3次，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞浆蛋白，沉淀部分加入1ml胞膜蛋白提取液，超声粉碎，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞膜蛋白。

样品蛋白含量测定采用酚试剂法。

3我们实验室提取膜蛋白的方法如下：1．将细胞种于T75 或T175的培养瓶中培养数天，细胞铺满瓶底后，吸去培养液。

将PBS/EDTA 溶液(NaCl:0.1M,NaH2PO4:0.01M,EDTA:0.04%)加入量以覆盖细胞为止，置于培养箱或在超净台内消化3～5分钟，如仍未脱落瓶底，用吸管吹打，使细胞完全脱落。

2．收集细胞悬液于10毫升或50毫升的离心管中，1000rpm离心10分钟，去上清液。

细菌外膜蛋白提取试剂盒产品组成：产品组成 BB-31512-1 BB-31512-2 组份编号规格 50T 100T试剂A：细菌外膜蛋白提取液A 25ml 50ml 31512A试剂B：细菌外膜蛋白提取液B 250ul 500ul 31512B试剂C：膜蛋白溶解液 10ml 20ml 31512C试剂D：蛋白酶抑制剂混合物 100 ul 200 ul 31512D产品简介：贝博细菌外膜蛋白提取试剂盒可以从各种革兰氏阴性菌菌体中提取外膜蛋白。

提取过程简单方便。

该试剂盒含有蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高质量的蛋白提供了保证。

该试剂盒提取的蛋白具有天然活性，可用于各种下游实验。

使用方法：1、每500ul提取液A中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物，充分混匀后置冰上备用。

2、将菌液在低温下10000g离心5分钟，收集菌体，用PBS洗菌体2次。

3、按每20-50mg湿重菌体样本加入500ul提取液A（大约菌体和提取液体积比1:2-1:3，完全淹没菌体即可），吹打混匀，2-8℃振荡1小时（或者冰上放置1-2小时，中间每隔10分钟涡旋振荡混匀）。

4、将菌液在2-8℃下12000g力离心5分钟，取上清。

5、在上清中加入5ul提取液B，充分混匀。

6、在37℃水浴10分钟。

7、在37℃ 1000g力离心2分钟。

8、此时液体分为2层，小心移除上层溶液，留管底部下层大约50ul液体。

9、用膜蛋白溶解液溶解该溶液，即得细菌外膜蛋白样品。

该样品可以用Bradford或BCA方法进行定量，调整相应的浓度用于下游实验。

相关产品：产品 产品号 产品 产品号 总蛋白提取试剂盒BB-3101 磷酸化蛋白富集试剂盒 BB-3108核蛋白提取试剂盒 BB-3102 膜蛋白提取试剂盒 BB-3103膜/胞浆/核蛋白分步提取试剂盒 BB-3104 活性蛋白提取试剂盒 BB-3106Bradford蛋白定量试剂盒 BB-3411 BCA蛋白定量试剂盒 BB-3401ECL化学发光检测试剂盒 BB-3501 植物核蛋白提取试剂盒 BB-3154细胞蛋白提取试剂盒 BB-3121 细菌膜蛋白提取试剂盒 BB-3151组织蛋白提取试剂盒 BB-3122 植物总蛋白提取试剂盒 BB-3124细菌蛋白提取试剂盒 BB-3123 植物膜蛋白提取试剂盒 BB-3152酵母蛋白提取试剂盒 BB-3125蛋白酶抑制剂混合物 BB-3301- 1 -昆虫蛋白提取试剂盒 BB-3126真菌蛋白提取试剂盒 BB-3127磷酸化蛋白提取试剂盒 BB-3105 磷酸酶抑制剂混合物 BB-3311SDS-PAGE凝胶配制试剂盒 BB-3702 SDS-PAGE上样Buffer BB-3703总蛋白提取试剂盒（2D电泳用） BB-3181 细菌蛋白提取盒（2D电泳用） BB-3182植物蛋白提取盒（2D电泳用） BB-3183 酵母蛋白提取盒（2D电泳用） BB-3185细菌膜蛋白提取盒（2D电泳用） BB-3187 线粒体蛋白提取盒（2D电泳用）BB-3191- 2 -。

［文章编号］　１６７１－５８７Ⅹ（２０１２）０３－０５９０－０５［收稿日期］　２０１１－０８－１５［基金项目］　国家自然科学基金资助课题（３０９１０１０３９０３，３０７７０１２０）［作者简介］　王　爽（１９７６－），女，吉林省长春市人，主治医师，医学博士，主要从事真菌分子学鉴定及耐药机制的研究。

［通信作者］　王　丽（Ｔｅｌ：０４３１－８５６１９４８６，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｌｉ９９＠ｊｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ）真菌胞内蛋白质提取方法的建立王　爽１，２，姜兰香１，张　宇２，３，贺　丹２，田　庄２，高　嵩２，横山耕治４，王　丽２（１．吉林大学第二医院皮肤科，吉林长春１３００４１；２．吉林大学白求恩医学院病原生物学系，吉林长春１３００２１；３．吉林大学第二医院检验科，吉林长春１３００４１；４．日本千叶大学真菌研究中心，日本千叶２６０－８６７３）［摘　要］　目的：研究不同的提取方法对白假丝酵母和茄病镰刀菌胞内蛋白质浓度、种类及数量的影响，为建立一种稳定可靠的真菌胞内蛋白质提取方法提供依据。

方法：分别以白假丝酵母菌和茄病镰刀菌为研究对象，培养时间为３６、４８和７２ｈ，超声波工作时间为２０ｓ、３ｍｉｎ、５ｍｉｎ，１０ｍｉｎ，超声波功率为３３２．５和４７５．０Ｗ，通过蛋白质浓度检测和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白质电泳分析，比较不同条件下提取的蛋白质浓度、种类及数量，观察不同因素对蛋白质提取效果的影响。

结果：２株真菌均在培养３６ｈ时提取胞内蛋白质的浓度最大，白假丝酵母在功率３３２．５Ｗ、超声３ｍｉｎ时得到胞内蛋白质的数量和种类最多，茄病镰刀菌在功率３３２．５Ｗ、超声１０ｍｉｎ时得到蛋白质的数量和种类最多。

结论：使用超声波法与玻璃珠研磨法结合提取胞内蛋白质，从菌株的培养时间、超声波工作时间和功率３方面建立了真菌胞内蛋白质的最佳提取方法。

［关键词］　白假丝酵母；茄病镰刀菌；超声波；培养时间［中图分类号］　Ｒ３７９．２ ［文献标志码］　ＡＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　ｆｕｎｇｕｓＷＡＮＧ　Ｓｈｕａｎｇ１，２，ＪＩＮＧ　Ｌａｎ－ｘｉａｎｇ１，ＺＨＡＮＧ　Ｙｕ２，３，ＨＥ　Ｄａｎ２，ＴＩＡＮ　Ｚｈｕａｎｇ２，ＧＡＯ　Ｓｏｎｇ２，ＫＯＪＩ　Ｙｏｋｏｙａｍａ４，ＷＡＮＧ　Ｌｉ　２（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　１３００４１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｇｅｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｍａｎ　Ｂｅｔｈｕｎｅ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２１，Ｃｈｉｎａ；３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００４１，Ｃｈｉｎａ；４．Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｍｙｃｏｌｏｇｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｈｉｂｅｒ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｉｂａ　２６０－８６７３，Ｊａｐａｎ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅ　ｔｉｍｅ，ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｔｉｍｅ　ａｎｄ　ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｐｏｗｅｒ　ｏｎ　ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｑｕａｎｔｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　ａｎｄ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｏｌｉｎａ　ａｎｄ　ｔｏｐｒｏｖｉｄｅ　ｔｈｅ　ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ　ａ　ｒｅｌｉａｂｌｅ　ａｎｄ　ｓｔａｂｌｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍｆｕｎｇｕｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　ａｎｄ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｏｌｉｎａ　ｗｅｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ．Ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ　ｉｎｃｌｕｄｅｄ　ｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｉｍｅ（３６，４８，ａｎｄ　７２ｈ），ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｔｉｍｅ（２０ｓ，３ｍｉｎ，５ｍｉｎ，ａｎｄ　１０ｍｉｎ）ａｎｄ　ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｐｏｗｅｒ（３３２．５Ｗａｎｄ　４７５．０Ｗ）．Ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，ｓｐｅｃｉｅｓ　ａｎｄ　ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｂｏｔｈ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｇｏｔ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｑｕａｎｔｉｔｙｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｈｅｎ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ　ｆｏｒ　３６ｈ．Ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｑｕａｎｔｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｗｈｅｎ　ｔｈｅｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｐｏｗｅｒ　ｗａｓ　３３２．５Ｗａｎｄ　ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｔｉｍｅ　ｗａｓ　３ｍｉｎ，ｂｕｔ　ａｓ　ｔｏ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｏｌｉｎａ，ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｐａｒａｍｅｔｅｒｓ　ｗｅｒｅ　３３２．５Ｗａｎｄ　１０ｍｉｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｓ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｂｙｃｏｍｐｏｓｉｔｅｌｙ　ｕｓｉｎｇ　ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｇｌａｓｓ　ｂｅａｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ０９５第３８卷　第３期２０１２年５月吉　林　大　学　学　报　（医　学　版）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．３　Ｍａｙ　２０１２ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　ｆｕｎｇｕｓ　ｉｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｉｍｅ，ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｐｏｗｅｒ　ａｎｄ　ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｗｏｒｋｉｎｇ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎｓ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ；Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｏｌａｎｉ；ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ；ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｉｍｅ 随着免疫力低下或免疫缺陷患者等易感人群的不断增加，条件致病性真菌感染的发生率呈上升趋势，严重威胁患者的健康和生命［１－２］，真菌致病和耐药机制的研究已成为当前研究的热点问题。

[【生物化学与分子生物学】]细菌总蛋白和膜蛋白提取方法膜蛋白, 细菌膜蛋白, 细菌一、从新鲜样品中提取总蛋白（简易法）1、自配裂解液（pH 8.5-9.0）：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA, 100 mM NaCl，0.5% Triton X-100，调pH值至8.5-9.0备用；用前加入100 μg/ml 溶菌酶，1μl/ml 的蛋白酶抑制剂PMSF。

该裂解液用量为10-50ml 裂解液/1g湿菌体。

2、将40ml 菌液在12000g，4℃下离心15分钟收集菌体，沉淀用PBS悬浮洗涤2遍，沉淀加入1ml裂解液悬浮菌体。

3、超声粉碎，采用300w，10s超声/10s间隔，超声20min，反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。

4、1000g离心去掉大碎片，上清可直接变性后PAGE电泳检测，或者用1% SDS溶液透析后冻存。

缺点：Western blotting结果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。

二、从Trizol裂解液中分离总蛋白1、Trizol溶解的样品研磨破碎后，加氯仿分层，2-8℃下10000g离心15min，上层水相用于RNA提取，体积约为总体积的60%。

2、用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。

每使用1ml Trizol加入0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3min，2-8℃不超过2000g离心5min。

3、将上清移至新的EP管中，用异丙醇沉淀蛋白质。

每使用1ml Trizol加入1.5ml异丙醇，室温放置10min，2-8℃下12000g离心10min，弃上清。

4、用含有0.3M 盐酸胍的95%乙醇洗涤。

每1ml Trizol加入2ml洗液，室温放置20min，2-8℃下7500g 离心5min，弃上清，重复洗涤2次。

最后加入2ml无水乙醇，涡旋后室温放置20min，2-8℃下7500g离心5min，弃上清。

5、冷冻干燥5-10min，1%SDS溶液溶解，反复吹打，50℃温浴使其完全溶解，2-8℃下10000g离心10min去除不溶物。

哺乳动物跨膜蛋白承担各种生物功能，在疾病的发生、发展过程中扮演重要角色。

膜蛋白的蛋白质组学分析是被大家看好的辨识新的药物靶标和/或疾病的生物学标记的好方法，并已得到广泛应用。

然而膜蛋白通过许多疏水氨基酸残基锚定在膜结构里面，很难溶解在水性缓冲液系统中。

为了制备膜蛋白样品，传统的方法是采用“去污剂＋机械处理”的操作方法获取膜蛋白，用于增溶的去污剂有离子型（如SDS）和非离子型的（如Triton?-X）等，前者会使多数蛋白完全变性，限制很多下游分析，而后者虽然相对温和，但抽提膜蛋白（特别是有多个跨膜区的膜蛋白）的效果往往很差。

下面推荐的是两个公司的相关产品，也算是具有代表性的两种方法：1．默克的跨膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtract 跨膜蛋白抽提试剂盒（简称TM-PEK，货号71772-3）是一种基于化学而非去污剂方法的高产膜蛋白制备试剂盒。

其简便的两步法操作可以高效地富集膜蛋白和膜关联蛋白。

试剂盒包括两种试剂，TM-PEK试剂A 和TM-PEK试剂B，分别用于制备抽提缓冲液2A和抽提缓冲液2B。

使用者通过实验摸索，可以根据特定目的蛋白的特点从中灵活选择最适缓冲液。

用ProteoExtract TM-PEK 试剂抽提得到的蛋白适合用于常见的各种蛋白分析方法。

从以下的报告中，列举了TM-PEK制备的跨膜蛋白和多次跨膜蛋白样品在免疫印迹、活性分析及2D电泳等方面的实例。

为了验证ProteoExtract跨膜蛋白抽提试剂盒抽提多次跨膜蛋白的有效性，我们用免疫印迹比较了Frizzled-4，CELSR-3（cadherin-EGF-lag seven-pass receptor-3）和EGFR（表皮生长因子，只有一个跨膜区）的样本制备效果。

Frizzled和CELSR是WNT/ PCP （平面细胞极性）通路的重要组成成分，而这个重要的通路则控制了组织的极性和细胞的迁移。

Frizzled蛋白与GPCRs有远源关系，但是除开都具有7个跨膜区的结构外，它们的结构和功能存在很大差异（参见Huang 2004）。