高效液相色谱柱效能的测定

标准操作规程1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。

2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。

3责任：QC人员对本SOP实施负责。

4容高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。

注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

4.1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。

色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。

超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。

4.1.1.色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。

常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。

正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。

常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。

氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。

离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。

有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。

手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。

温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。

为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。

残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在 2〜8之间。

残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。

高效液相色谱法测定含量示例的方法再确证目的：确证用反相高效液相色谱法测定头孢氨苄含量的方法有效性和准确性。

方法：以Diamonsil CLC-ODS（150mm x 6mm，10 lm）为色谱柱，水-甲醇- 3.89% 醋酸钠溶液- 4% 醋酸溶液（700：300：15：3）为流动相，检测波长为254 nm，外标法定量。

结果：头孢氨苄浓度线性范围为0.02～0.20mg / ml，相关系数r= 0.9991，方法重复性试验RSD为1.42%。

结论：该方法可简单高效地完成，结果准确性好、稳定可靠，确证高效液相色谱依然为头孢氨苄制剂的质量控制中有效可靠的方法。

标签：头孢氨苄高效液相色谱法头孢氨芐（Cefalexin，又译先锋霉素Ⅳ、头孢力新等）是一种半合成的第一代口服头孢霉素类类抗生素药物，化学名（6R，7R）-3-甲基-7-[（R）-2-氨基-2-苯乙酰氨基]-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸，化学式C16H17N3O4S，在临床上广为使用。

其含量测定在旧版的中国药典（1995年版）采用碘量法○1。

但此法不仅操作步骤繁多，费工费时，干扰因素多；然后人们发明采用高效液相色谱法内标法测定的方法，但内标物保留时间过长，依然存在问题。

最后人们又发现采用高效液相色谱法，用外标法测定其含量，方法操作简单方便、数据准确可靠，灵敏度较高，重复性好，最终获得了较为满意的结果○2。

现在本文对这个方法进行确证，以确定该方法的有效性和准确性。

1.仪器与试药分析天平（precisa instrument ltd switzer land xs 225a precisa ），高效液相色谱柱（diamonsic C18 250 * 46mm），检测器（UVD 170v），泵（P680 HPLC pump），头孢氨苄胶囊（广州白云山制药总厂批号：2110102）2. 色谱条件用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂：水-甲醇- 3.89% 醋酸钠溶液- 4% 醋酸溶液（700：300：15：3）为流动相；检测波长为254nm；理论塔板数按头孢氨苄峰计算不低于1500。

苯、萘、联苯的高效液相色谱分析及柱效能的测定一、目的要求1．学习高效液相色谱保留值定性、外标法定量分析方法。

2．了解高效液相色谱仪基本结构和工作原理，以及初步掌握其操作技能3．学习柱效能的测定方法二、实验原理高效液相色谱的定性和定量分析，与气相色谱分析相似，在定性分析中，采用保留值定性，或与其它定性能力强的仪器分析法（如质谱法、红外吸收光谱法等）联用。

在定量分析中，采用测量峰面积的归一化法、内标法或外标法等。

气相色谱中评价色谱柱柱效的方法及计算理论塔板数的公式，同样适用于高效液相色谱：速率理论及范弟姆特方程式对于研究影响高效液相色谱柱效的各种因素，同样具有指导意义：由于组分在液体中的扩散系数很小，纵向扩散项（B/u）对色谱扩展的影响可以忽略不计，而传质阻力项（Cu）则成为影响柱效的主要因素，提高柱内填料装填的均匀性和减小粒度，以加快传质速率，可提高液相色谱的柱效能。

目前常使用的固定相直径为5~10mμ。

液相色谱除了上述影响柱效的一些因素外，还应考虑到一些柱外展宽的因素。

三、实验用品1．仪器高效液相色谱（任一型号）紫外光度检测器恒流泵或恒压泵溶剂过滤系统高压六通进样阀微量进样器（100μL）超声波发生器2．药品苯、萘、联苯、甲醇（均为A.R）纯水（去离子水，再经一次蒸馏）标准贮备液分别配制浓度为1000μg · mL－1的苯、萘、联苯的甲醇溶液。

标准工作液将上述标准贮备液用甲醇稀释10倍，配成苯、萘、联苯的浓度分别为100μg · mL－1的甲醇溶液。

混合样品苯、萘、联苯四、操作步骤1．测定条件的选择（1）色谱柱长250 mm，内径 4.6 mm，装填C-18 烷基键合相，颗粒度10μm的固定相（2）流动相甲醇:水（83:17），流量1.0 mL· min－1（3）紫外光度检测器测定波长254 nm（4）进样量20μL2．仪器操作（1）将配置好的流动相于超声波发生器上，脱气15 min。

篇一：高效液相色谱实验报告高效液相色谱实验报告一、实验目的1了解液相色谱的发展历史及最新进展 2 学习液相色谱的基本构造及原理3 掌握液相色谱的操作方法和分析方法，能够通过hplc分离测定来对目标化合物的分析鉴定。

二、实验原理液相色谱法采用液体作为流动相，利用物质在两相中的吸附或分配系数的微小差异达到分离的目的。

当两相做相对移动时，被测物质在两相之间进行反复多次的质量交换，使溶质间微小的性质差异产生放大的效果，达到分离分析和测定的目的。

液相色谱与气相色谱相比，最大的优点是可以分离不可挥发而具有一定溶解性的物质或受热后不稳定的物质，这类物质在已知化合物中占有相当大的比例，这也确定了液相色谱在应用领域中的地位。

高效液相色谱可分析低分子量、低沸点的有机化合物，更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化合物。

80%的有机化合物都可以用高效液相色谱分析，目前以已经广泛应用于生物工程、制药工程、食品工业、环境检测、石油化工等行业。

三、高效液相色谱的分类吸附色谱法、分配色谱法、空间排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、化学键合相色谱法四、高效液相色谱仪的基本构造高效液相色谱至少包括输液系统、进样器、分离柱、检测器和数据处理系统等几部分。

1 输液系统：包括贮液及脱气装置、高压输液泵和梯度洗脱装置。

贮液装置用于存贮足够量、符合hplc要求的流动相。

高效液相色谱柱填料颗粒比较小，通过柱子的流动相受到的流动阻力很大，因此需要高压泵输送流动相。

2 进样系统：将待测的样品引入到色谱柱的装置。

液相色谱进样装置需要满足重复性好、死体积小、保证柱中心进样、进样时引起的流量波动小、便于实现自动化等多项要求。

进样系统包括取样、进样两项功能。

3 分离柱：色谱柱是色谱仪的心脏、柱效高、选择性好、分析速度快是对色谱柱的一般要求。

商品化的hplc微粒填料，如硅胶和以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）等的粒度通常在3μm、5μm、7μm、以及10μm。

高效液相色谱法高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵人装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。

注人的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

1. 对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。

色谱柱内径一般为3.9〜4.6 mm，填充剂粒径为3〜10μm。

超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm) 填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。

(1) 色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。

常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。

正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。

常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。

氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。

离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。

有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。

手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。

温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。

为改善分离效果可适当提髙色谱柱的温度，但一般不宜超过60°C。

残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在2〜8之间。

残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。

(2) 检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。

高效液相色谱法高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵人装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。

注人的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

1. 对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。

色谱柱内径一般为3.9〜4.6 mm，填充剂粒径为3〜10μm。

超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm) 填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。

(1) 色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。

常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。

正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。

常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。

氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。

离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。

有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。

手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。

温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。

为改善分离效果可适当提髙色谱柱的温度，但一般不宜超过60°C。

残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在2〜8之间。

残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。

(2) 检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。

HPLC柱效测定
以第一主数据为例
n=)2=2=201.881
柱长25cm
H===0.001238
思考题
1、高效液相液相色谱采用3~10微米的固定相有何优点?同时它又给实验带来什么问题?如何克服？
答：这个是从色谱理论H-u曲线推导出来的结果.在100kg压力左右,5微米的柱效最高.但随加工制造技术的提高,更高压力的泵如400kg,也能够大量的普及.而在400kg左右,1-3微米的固定相柱效更高,所以在HPLC的基础上又有UPLC仪器了.
2、紫外光度检测器是否适用于检测所有的有机化合物,为什么?
答：不是理由有2 ，第一是并不是所有的有机物都有强的特征紫外吸收，只有特定的集团会有这样的情况。

第二是有频率相近的吸收峰的物质很多，不能完全区分开来。

3、若实验中的色谱峰无法完全分离，应如何改善实验条件色谱柱？
答：色谱柱使用时间长了，柱效会降低，会影响到分离度的，改善方法是更换新的色谱柱。

如果已经是新的色谱柱了，分离度还不好，那可以采用更长一些的色谱柱，也会增加分离度；流动相的调节，通过调节流动相中各组分的比例，使流动相的极性发生变化，分离效率会不一样，这要针对要检测的成分具体情况进行分析确定；改变柱温，相同条件下升高柱温，会增大色谱柱的分离能力而提高分离度。

实验:高效液相色谱柱效能的测定一、实验目的1.了解高效液相色谱仪基本结构和工作原理2.学习高效液相色谱柱效能的测定方法二、实验原理高效液相色谱是色谱法的一个重要分支。

与气相色谱相比较，高效液相色谱同样具有高灵敏、高效能和高速度的特点，但它的应用范围更广泛。

据估计在自然界数百万有机化合物中，仅有20%可以不经过化学预处理，直接采用气相色谱分析，而对于总数的75-80%，则可采用高效液相色谱进行分离分析。

特别是许多高沸点、难挥发、热稳定性差的物质，如生物化学制剂、金属有机配合物等物质的分离分析，需要借助于高效液相色谱方法。

液相色谱柱是整个高效液相色谱分离系统的核心。

气相色谱中评价色谱柱柱效的方法及计算理论塔板数的公式，同样适用于高效液相色谱：n = 5.54 (t R/Y1/2)2R s=2(t R2-t R1)/(Y1+Y2)式中：n—理论塔板数，t R—保留时间Y1/2—半峰宽三、仪器和试剂Agilent-1100高效液相色谱仪（由高压输液泵，高压六通进样阀和UV-Vis检测器组成，）超声波发生器色谱柱：15cm⨯4.6mm I.D.，ODS，5μm流动相：甲醇-水（3+1）样品1：内标标准样。

由下列三种溶液等体积混合：尿嘧啶的甲醇溶液（0.12mg•mL-1），苯的甲醇溶液（0.7mg•mL-1），萘、联苯、菲的甲醇溶液（0.1mg•mL-1、0.1mg•mL-1和0.06mg•mL-1）。

样品2：混合试样：一定量的尿嘧啶、苯、萘、菲溶于甲醇，其中加入内标物联苯（浓度为0.1mg•mL-1）。

、四、实验内容1.准备流动相。

用液相色谱级无水甲醇和二次去离子重蒸水配制流动相1000mL，混合均匀后经0.45μm膜过滤，再用超声波脱气10min。

2.检查色谱各部件的连接是否正确，液路有无泄露。

如一切正常，则可将准备好的流动相加到仪器储液瓶中，并将检测器后面的液路出口置于废液瓶中。

3.接通高压泵和检测器的电源，排除掉液路中的所有气泡。

实验六高效液相色谱(HPLC)柱效测定一. 实验目的1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。

2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。

3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。

二. 实验原理高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。

在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。

反之，则称为正相色谱分离系统。

反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。

定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。

分离度（R）的计算公式为：R＝ 2[t(R2)-t(R1)] /1.7*(Y1/2＋Y1/2)式中 t(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t(R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； Y1/2 与Y1/为此相邻两峰的半峰宽。

除另外有规定外，分离度应大于1.5。

本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。

它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。

但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。

待测物性质见表1。

表1色谱柱测试条件出峰次序样品组成1 邻苯二甲酸二甲酯（DMP）2 邻苯二甲酸二乙酯(DEP)3 邻苯二甲酸二丁酯(DBP)如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。

三.仪器与试剂1、仪器Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。

2、试剂甲醇（色谱专用），高纯水四. 实验步骤1、色谱条件色谱柱：苯基柱，柱温：室温流动相：初始为高纯水：30％，甲醇：70％检测器：DAD检测器(二极管阵列检测器)；检测波长：220nm；进样体积：20µl定量环，实际注射每次可控制在40µl。

高效液相色谱法《中国药典》2015年版高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。

注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。

色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。

超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。

（1）色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。

常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。

正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。

常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。

氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。

离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。

有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。

手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。

温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。

为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。

残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在2～8之间。

残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。

（2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。

高效液相色谱法高效液相色谱法（《中国药典》2010年版二部附录V D）系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。

注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

1 对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪，由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定期鉴定并符合有关规定。

1.1 色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。

反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等）也有使用。

正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。

离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。

填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。

孔径在15nm（1nm=10Å）以下的填料适于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。

除另有规定外，分析柱的填充剂一般在3~10μm之间。

粒径更小（约2μm）的填充剂常用于填装微径柱（内径约2mm）。

使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。

当对其测定结果产生争议时，应以品种正文规定的色谱条件的测定结果为准。

以硅胶为载体的键合固定相的使用温度不超过40℃，为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度，但不宜超过60℃。

流动相的pH指应控制在2~8之间。

当pH指大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH指小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。

高效液相色谱柱柱效测定实验者 学号合作者一、实验目的1． 了解高效液相色谱仪的基本结构和工作原理 2． 学习高效液相色谱仪的使用 3． 学习、掌握液相色谱柱柱效测定方法 二、基本原理高效液相色谱法是以液体作为流动相的一种色谱分析法，它亦是根据不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的差异来对混合物进行分离的。

气相色谱中评价色谱柱柱效的方法及计算理论塔板数的公式同样适合于高效液相色谱，即：222/11654.5⎪⎭⎫ ⎝⎛=⎪⎪⎭⎫ ⎝⎛=Y t Yt n R R式中：t R 为组分的保留时间Y 1/2为色谱峰的半峰宽度 Y 为色谱峰的峰底宽度速率理论及范弟姆特方程式对于研究影响高效液相色谱柱效的各种因素，同样具有指导意义:H=A+B/u +Cu然而由于组分在液体中的扩散系数很小，纵向扩散项 (B/u )对色谱峰扩展的影响实际上可以忽略，而传质阻力项 (C u )则成为影响柱效的主要因素，可见要提高液相色谱的柱效能，提高柱内填料装填的均匀性和减小粒度，以加快传质速率是非常重要的。

目前所使用的固定相，通常为5～10μm的微粒,而装填技术的优劣亦将直接影响色谱柱的分离效能。

除上述影响柱效的一些因素外，对于液相色谱还应考虑到一些柱外展宽的因素，其中包括进样器的死体积和进样技术等所引致的柱前展宽，以及由柱后联接管、检测器流通池体积所引致的柱后展宽。

三、仪器和试剂1．仪器1：KLC321型高效液相色谱仪（紫外检测器）2．仪器2：Agilent 1200 高效液相色谱仪（紫外检测器）3．50μl微量进样器试剂：，甲酯，乙酯，甲酯，丁酯，四种物质的混合液，纯水，去离子水，重蒸水。

四、实验条件1．色谱柱1 长15cm，内径4.6mm，装填10 m的C-18烷基键合固定相2．流动相甲醇:水(83:17)；流量0.5mL·min-1和1mL·min-13．紫外光度检测器波长254nm，灵敏度0.084．进样量3μL五、实验步骤1．根据实验条件和实验录像指导，按KLC321仪器操作步骤将仪器调节至进样状态，待仪器流路及电路系统达到平衡，色谱工作站之“采样系统”基线平直时，即可进样。

华南师范大学实验报告学生姓名：杨秀琼学号：20082401129专业：化学年级班级：08化二课程名称：仪器分析实验实验项目：液相色谱分析混合样品中的苯和甲苯实验类型：综合实验时间：2010/416一、[实验目的:]1、掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法2、了解高效液相色谱的构造、原理及操作技术二、[实验原理:]高效液相色谱法：以液体作为流动相的色谱法。

它是在经典液相色谱实验基础上，引入气相色谱的理论，在技术上采用高压输液泵，高效固定相和高灵敏的检测器，而发展起来的快速分离分析技术。

具有分离效能高，检出限低，操作自动化和应用范围广的特点。

其基本原理：利用欲分配的诸组分在固定相和流动相间的分配有差异（即由不同的分配系数），当两相做相对运动时，这些组分在此两相中分配反复进行，从几千次到百万次，即使组分的分配系数只有微小差异，随着液体流动相却可以有明显的差异，最后使这些组分都得到分离，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。

三、[仪器和试剂:]1.主要仪器：岛津液相色谱仪(LC-10AT)[配有紫外检测PhenomenexO柱]；10μL微量注射器2、试剂：甲醇、水苯和甲苯混合待测溶液苯标准溶液：2.0μL/mL甲苯标准溶液：2.0μL/mL苯、甲苯混合标准溶液：1.0μL/mL、2.0μL/mL、5.0μL/mL、10.0μL/mL 四、[实验步骤]1、按操作规程开机。

2、.选择合适的流动相配比，优化色谱条件通过调节溶剂甲醇和水的混合比例，从而来优化色谱调剂。

调好最佳色谱条件，控制流速为1ml/min 。

柱温30℃，检测波长354nm 3、苯、甲苯定性分析在最佳条件下，待基线走稳后，用10μL 微量注射器分别进样10μL 苯和 甲 苯混合待测溶液，10μL 苯标准溶液（2.0μL/mL）和10μL 甲苯标准溶液（2.0μL/mL）(微量注射器用甲醇润洗3～5遍)，观察并记录色谱图上显示的保留时间，确定苯和甲苯的峰。