Chapter9 高效液相色谱

除紫外检测器之外应用最多的检测器； 除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差 差值与浓度呈正比； 值。差值与浓度呈正比； 通用型检测器（ 通用型检测器 （ 每种物质具有不同的 折光指数） 折光指数）； 灵敏度低、 灵敏度低 、 对温 度敏感、 度敏感 、 不能用于梯 度洗脱； 度洗脱； 偏转式、 偏转式 、 反射式 和干涉型三种； 和干涉型三种；
高灵敏度、高选择性； 高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉 对多环芳烃， 维生素 、 卟啉类化合物、 农药、 药物、 素 、 卟啉类化合物 、 农药 、 药物 、 氨基酸、甾类化合物等有响应； 氨基酸、甾类化合物等有响应；
E 蒸发光散射检测器
蒸发光散射检测器适合于无紫外吸收、无电 活性和不发荧光的样品的检测。
经典的液相色谱法，流动相在常压下输 经典的液相色谱法，流动相在常压下输 常压 所用的固定相柱效低，分析周期长。 送，所用的固定相柱效低，分析周期长。 高效液相色谱法引用了气相色谱的理论 引用了气相色谱的理论， 高效液相色谱法引用了气相色谱的理论， 流动相改为高压输送（最高输送压力可达 流动相改为高压输送（ 高压输送 4.9× Pa） 4.9×107Pa）; 色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料 填充而成，从而使柱效大大高于 柱效大大高于经典液相 填充而成，从而使柱效大大高于经典液相 色谱； 色谱； 同时柱后连有高灵敏度的检测器， 同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对 流出物进行连续检测。 流出物进行连续检测。
主要分离类型与原理
一、 液-固吸附色谱 (Liquid-solid adsorption 固吸附色谱 chromatography)
固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等， 固定相 固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使 固体吸附剂为 用的是5～ 的硅胶吸附剂； 用的是 ～10µm的硅胶吸附剂； 的硅胶吸附剂 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 流动相 各种不同极性的一元或多元溶剂。 各种不同极性的一元或多元溶剂 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 基本原理 组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样， 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样 ， 对具有 官能团的化合物和异构体有较高选择性； 官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾； 缺点 非线形等温吸附常引起峰的拖尾； 非线形等温吸附常引起峰的拖尾
（3）梯度洗脱装置 通过两个输液泵流速的变化，改变流动相的 洗脱能力，其作用与气相色谱的程序升温类似。
A
B C
A
B
C
(3) 进样装置
流路中为高压力工作状态， 流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示： 其结构如图所示：
(4) 高效分离柱
色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、 色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大 和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、 和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和 使用条件有关。 使用条件有关。 柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长 ～40 cm。 柱体为直型不锈钢管，内径 ～ ，柱长5～ 。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
高压输液泵
检测器
高效液相色谱仪由: 高效液相色谱仪由: 高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 记录系统 等五大部分组成。 等五大部分组成。
高压输液泵 1、输液系统 (1) 高压输液泵
A、主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 、主要部件之一，压力： ～ × 。 B、为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10µm）， 液体的流动相高速 、为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ ）， 通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。 通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。 C、应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性 、应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、
固定相
键合固定相是硅胶表面原子通过化学 反应以不同方式的化学键结合的各种 分子（ 具二醇基、 醚基、 氰基、 分子 （ 具二醇基 、 醚基 、 氰基 、 氨基 等极性基团的有机分子） 等极性基团的有机分子）。
LC与 经典 LC与HPLC 比较
柱内径 长度 填充材料粒径 使用压力 分离时间 经典LC 经典LC 1~5cm 5cm 50~100cm 50 100cm 150µm~200µm 200µ 150 m 200 1~10atm常压 10atm 0.5h~天 0.5h 天 HPLC ~0.4cm 0.4cm 15~50cm 15 50cm 4µm~10 m 10µm m 10 50~200atm 50 200atm高压 ~10min 10min
因此，高效液相色谱具有分析速度快、 因此，高效液相色谱具有分析速度快、分 离效能高、自动化等特点。 离效能高、自动化等特点。 所以称为高压 高速、 高压、 所以称为高压、高速、高效或现代液相色 谱.Fra bibliotek经典液相色谱的区别
分离柱柱效高 分辨率高 实现了自动化操作
经典装置示意图
高压输液泵
输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统
高效液相色谱的优点 高效液相色谱的优点 检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快， 检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快， 重复性好，定量精度高，应用范围广。 重复性好，定量精度高，应用范围广。 适用于分析高沸点、大分子、强极性、 适用于分析高沸点、大分子、强极性、具 有生物活性、热稳定性差的化合物。 有生物活性、热稳定性差的化合物。
正相高效液相色谱 HPLC 反相高效液相色谱
1、反相高效液相色谱（reversed phase HPLC） 反相高效液相色谱（ ）
指以强疏水性的填料做固定相、 指以强疏水性的填料做固定相、以可以和水 混溶的有机溶剂作流动相的液相色谱， 混溶的有机溶剂作流动相的液相色谱，如在 硅胶上键合C 烷基的非极性固定相， 硅胶上键合C18或C8烷基的非极性固定相， 以极性强的水、甲醇、 以极性强的水、甲醇、乙腈作流动相的液相 色谱。 色谱。 是当今液相色谱的最主要分离模式。 是当今液相色谱的最主要分离模式。
4、检测器 作用—— 用来连续监测经色谱柱分离后的流出 物的组成和含量变化的装置。
目前最常用的检测器主要有： 紫外-可见检测器 荧光检测器 电化学检测器 蒸发光散射检测器 质谱检测器
a. 紫外检测器
应用最广，对大部分有机化合物有响应。 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 特点： 灵敏度高； 灵敏度高； 线形范围高； 线形范围高； 流通池可做的很小（ 流通池可做的很小（1mm × 10mm ，容积 8µL）； ） 对流动相的流速和温度变化不敏感； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。 可用于梯度洗脱。
二、正相和反相色谱
依据相间的相对极性，将液相色谱分为正相 依据相间的相对极性，将液相色谱分为正相 相对极性 反相色谱。 和反相色谱。 当固定相极性大于 流动相极性时， 大于流动相极性时 当固定相极性 大于 流动相极性时 ， 称之为 正相” 色谱； “ 正相 ” 色谱 ； 即由极性固定相和非极性 或弱极性）流动相所组成的LC体系. LC体系 （或弱极性）流动相所组成的LC体系. 当固定相极性小于流动相极性时， 小于流动相极性时 当固定相极性小于流动相极性时，则称之为 反相”色谱。 “反相”色谱。
Chapter9 高效液相色谱
(High Performance Liquid Chromatography, HPLC )
一、概述 高效液相色谱是在气相色谱和 经典液相色谱的基础上发展起来的。 经典液相色谱的基础上发展起来的。 高效液相色谱和经典液相色谱没有 本质的区别。 本质的区别。 不同点仅仅是高效液相色谱比经 典液相色谱有较高的效率 和实现了 操作。 自动化 操作。
在线脱气装置
(2)在线脱气装置 在线脱气装置用于脱去流动相中的溶解气体， 流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。
除在线脱气装置外，目前也采用超声脱气、 真空脱气等方式。
脱气不好时有气泡，导致流动相流速不稳 定，造成基线飘溢，噪音增加。
(2)梯度淋洗装置 梯度淋洗装置
外梯度: 外梯度 利用两台高压输液 泵，将两种不同极性的 溶剂按一定的比例送入 梯度混合室， 梯度混合室，混合后进 入色谱柱。 入色谱柱。 内梯度: 内梯度 一台高压泵, 一台高压泵 通过 比例调节阀,将两种或 比例调节阀 将两种或 多种不同极性的溶剂 按一定的比例抽入高 压泵中混合。 压泵中混合。
应用
• 主要用于分离纯化多肽类、生物碱 主要用于分离纯化多肽类 多肽类、 皂甙等化合物 及皂甙等化合物
2、正相高效液相色谱
指以亲水性的填料做固定相（ 指以亲水性的填料做固定相（如在硅胶上键 羟基、氨基或氰基的极性固定相），以疏 的极性固定相）， 合羟基、氨基或氰基的极性固定相），以疏 水性溶剂或混合物作流动相（如己烷） 水性溶剂或混合物作流动相（如己烷）的液 相色谱。 相色谱。
反相高效液相色谱柱
固定相 1）以硅胶为基质 硅胶为基质 常规硅胶键合C 等填料柱； 常规硅胶键合C18、C8等填料柱； 2）以高聚物为基质 高聚物为基质
流动相
以极性溶剂或它们的混合物作为反相高效 液相色谱的流动相， 例如水、甲醇和乙腈。 液相色谱的流动相 ， 例如水 、 甲醇和乙腈 。 溶剂纯度须达到光谱纯 光谱纯。 溶剂纯度须达到光谱纯。 最常用的是甲醇 乙腈， 甲醇和 最常用的是甲醇和乙腈，因为它们具有最 高的洗脱能力和强度。 高的洗脱能力和强度。
示差折光检测器
d. 荧光检测器（Fluorescence detector）