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双水相萃取酶的工艺流程双水相萃取酶是一种生物工艺方法，用于从微生物菌株中提取酶。
双水相萃取酶的工艺流程包括以下几个主要步骤：挑选菌株、培养微生物、收获微生物发酵产物、裂解细胞壁、萃取酶、纯化酶等。
首先，在双水相萃取酶的工艺流程中，挑选菌株是非常重要的。
菌株的选择应该具有高产酶量、对底物的选择性高、生长速度快等特点。
一般来说，可以通过从土壤、水体、植物等不同环境样品进行采集、分离和筛选菌株，以获得具有理想特性的微生物菌株。
其次，对挑选出的菌株进行培养。
培养条件包括适宜的温度、pH值、氧气含量等，以最大限度地促进微生物的生长和产酶。
接着，通过发酵的方式可以收获微生物产生的酶。
发酵是将已培养好的微生物菌株加入到适宜的发酵基质中，通过发酵罐等设备进行培养，促进微生物的生长和产酶。
在发酵过程中，需要注意对温度、pH值、氧气含量等因素的控制，以保证酶的产生和质量。
随后，裂解细胞壁是将经过发酵得到的微生物细胞破碎，以释放酶。
通常采用机械方法或化学方法进行细胞壁的破裂，以获得细胞内的酶。
之后，进行酶的萃取。
双水相的特点在于其相互不混溶，通常利用两种互相不混溶的溶剂作为两相。
通常使用的有机溶剂有正己烷、二甲苯、氯仿等，水相中添加表面活性剂，可以增加两相的亲和力。
这样通过搅拌、超声波处理等方法，酶可以从水相转移到有机相中。
最后，对萃取到有机相中的酶进行纯化。
一般通过膜分离、离心、透析、柱层析等方法进行酶的纯化，以获得高纯度的酶制剂。
综上所述，双水相萃取酶的工艺流程主要包括挑选菌株、培养微生物、收获微生物发酵产物、裂解细胞壁、酶的萃取和纯化等步骤。
这种工艺流程具有操作简便、提取效率高、产品纯度高等优点，因此在生物制药和食品工业等领域具有较广泛的应用前景。
双水相萃取人类文明史上极为重要的发明技术之一就是双水相萃取，它是一种将两种物质以不同的溶剂混合以引发物质间的新化学反应的方法。
它的发明可以追溯到中国元朝的化学家张应义的灵感，他是第一个提出双水相萃取的人。
从那时起，多彩的双水相萃取技术已经在医学、石油、冶金等等领域发挥了重要的作用。
双水相萃取是一种将两种物质以溶剂混合以引发物质间的新化学反应的方法。
双水相萃取技术会先将两种溶剂混合在一起，使能够萃取物质Mix1和Mix2从原始溶液中分离出来，从而形成新的混合物。
相萃取的机理是因为，在一定的温度和压力下，溶剂中的离子会彼此交互作用，使得Mix1的离子与Mix2的离子受到相互的相互作用，从而使Mix1与Mix2分离开来。
双水相萃取技术在医学领域的应用是非常广泛的，它可以用来分离病毒、抗体、药物和其他有益物质，比如消化酶、心肌蛋白和维生素等。
此外，它还可以被用于细胞检测、生物分析和生物分子分析等，还可以用于将蛋白质从血清中纯化出来，用于抗原检测及抗体诊断。
在石油工业中，双水相萃取也被广泛用作精细炼油的手段。
这种技术可以用来分离混合油中的碳氢化合物，从而获得更高质量的汽油及其他石油制品。
此外，在冶金方面，双水相萃取也被大量应用于回收金属有效成分及其他物质的精细分离。
它可以用来纯化金属有效成分以提高其质量，也可以用来精细分离金属有效成分和其他杂质，回收有价值的有效成分，减少对环境的污染。
从以上分析来看，双水相萃取技术在几个领域，特别是在医学、石油和冶金领域都发挥了重要的作用，为人类文明发展做出了重大贡献。
有了双水相萃取技术，无论是在医学方面还是在石油和冶金方面，都极大的改善了人们的生活质量，极大的缩短了我们实现更大发展的路径，成就了人类文明史上令人瞩目的辉煌。
双水相萃取法及其应用张鑫生命科学学院制药1302班摘要：随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、代谢工程等高新技术研究工作的广泛开展, 各种高附加值的生化新产品不断涌现 , 对生化分离技术也提出了越来越高的要求。
包括精馏、吸收、萃取、蒸发、结晶在内传统的分离技术有三大特点:分离过程伴随有相的变化；筛分过程不能实现分子级别的分离；精制过程成本极高, 这些特征对于节约能源、生物分离、环境保护、资源开发、替代能源、高纯材料等当代化学工程与科学技术发展不相适应。
围绕以上几个问题的讨论就构成了分离技术研究与发展的主流 ,即新型分离技术产生的背景[1]。
关键词：双水相萃取；分离提纯；应用双水相萃取(Aque-ous two-phase extraction, ATPE)技术始于 20 世纪60年代, 从 1956 年瑞典伦德大学的 Albertsson 发现双水相体系[2]到 1979 年德国 GBF 的Kula 等人将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离[3], 虽然只有20 多年的历史,但由于其条件温和 ,容易放大, 可连续操作 ,目前,已成功的应用于蛋白质、核酸和病毒等生物产品的分离和纯化[3], 双水相体系也已被成功的应用到生物转化及生物分析中[4]。
国内自 20世纪 80年代起也开展了双水相萃取技术研究[5]。
1双水相萃取技术的原理及特点双水相萃取(Aque-ous two -phase extraction, ATPE)技术始于 20 世纪60年代, 从 1956 年瑞典伦德大学的 Albertsson 发现双水相体系[2]到 1979 年德国 GBF 的Kula 等人将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离[3], 虽然只有20 多年的历史,但由于其条件温和 ,容易放大, 可连续操作 ,目前,已成功的应用于蛋白质、核酸和病毒等生物产品的分离和纯化[3], 双水相体系也已被成功的应用到生物转化及生物分析中[4]。
双水相萃取技术及其应用.《生物资源开发与利用专题》双水相萃取技术及其应用152310018杨双水相萃取(ATPE)是一种利用不相容的两个水相之间分配系数的差异来萃取物质的方法。
例如:将葡聚糖和聚乙二醇按一定比例与水混合，溶液呈浑浊状，静置平衡后，溶液分为两相，两相互不混溶，上相富含聚乙二醇，下相富含葡聚糖。
当两种聚合物或一种聚合物和一种盐溶解在同一溶剂中时，由于聚合物之间或聚合物和盐之间的不相容性，当聚合物或无机盐的浓度达到一定值时，它将被分成两个不混溶的相。
因为所用的溶剂是水，所以称为双水相，其中水占很大比例(85%至95%)，活性蛋白质或细胞在这种环境中不会失活，但它可以以不同的比例分布在两相中，克服了有机溶剂萃取中容易失活蛋白质和不溶性强亲水性蛋白质的缺点。
双水相萃取的优点:1.操作条件温和，在常温常压下进行。
它不会导致生物活性物质失活或变性。
2.两相界面张力小，萃取过程中两相高度分散，传质速度快。
3.消除了有毒和易燃有机溶剂的使用，这可以提供温和的水环境，并避免提取组分的脱水和变性。
4.溶质对目标组分具有很强的选择性，大量的杂质可以与所有固体物质一起被除去，从而能够进行分离操作。
5、工艺简化，连续操作容易，处理量大，适合工业化应用。
缺点:该体系易乳化，成相聚合物成本较高，大多数水溶性聚合物粘度较高，不易定量控制，聚合物回收困难。
I:双水相萃取技术的发展趋势目前，用于分离生物物质的双水相体系主要有两种:非离子聚合物/水体系(最常用的是聚乙二醇/葡聚糖)和非离子聚合物/无机盐/水体系(常用的是聚乙二醇/盐体系)是由于在两种类型的双水相体系中使用了无毒聚合物，并且它们的多元醇和多糖结构可以确保生物大分子的稳定性。
然而，在实际应用中，这两种类型的双水相系统有其自身的缺点。
非离子聚合物/水体系能保证生物活性物质的活性，界面吸附少，但所用的高分子材料如葡聚糖价格昂贵，体系粘度大，限制了大规模应用。
与前者相比，非离子聚合物/无机盐/水体系成本低、粘度低，但该体系会导致一些敏感的生物活性物质失活，此外，还会产生大量高浓度含盐废水。
第50卷第4期2021年4月应用化工Applied Chemical IndustryVol. 50 No. 4Apr. 2021双水相萃取法提取地骨皮多酚及抗氧化活性研究臧慧静，刘学，孙亚娟，杨成(江南大学化学与材料工程学院，江苏无锡214122)摘要:采用超声辅助双水相萃取法提取地骨皮中多酚类物质,通过单因素实验和正交实验对地骨皮多酚提取工 艺进行优化，最佳提取工艺条件为:乙醇溶液质量分数为41 % ,硫酸钱与乙醇溶液质量比为13： 100 (g/g),地骨皮与乙醇溶液质量比1:20( g/g)，超声时间为50 min,提取温度为55 °C ，在此条件下地骨皮多酚得率为17.88 mg/g o分别以DPPH 法、ABTS 法、ORAC 法、细胞内总谷胱甘肽含量和SOD 活性评价地骨皮多酚的抗氧化能力。
结果表 明,地骨皮多酚对DPPH -和ABTS •的IQ 。
分别为20. 00 mg/L 和59. 37 mg/L,对活性氧清除能力高于同浓度Trolox,对比02损伤的HSF 细胞内谷胱甘肽含量和SOD 活性均有显著的提升作用。
关键词:地骨皮多酚;双水相萃取;抗氧化;谷胱甘肽;SOD中图分类号:TQ 658；TQ461；O69 文献标识码:A 文章编号：1671 -3206(2021)04 - 0855 - 05Extraction of polyphenols from Lycii Cortex based on aqueous two-phase system and evaluation of its antioxidant capacityZANG Hui-jing , LIU Xue , SUN Ya-juan , YANG Cheng(School of Chemical & Material Engineering ,Jieingnan University ,Wuxi 214122,China)Abstract : The polyphenols were extracted from Lycii Cortex by ultrasonic assisted aqueous two-phase sys tem. The optimized conditions were as follows : the mass fraction of 41% ethanol solution ； ammonium sul fate to ethanol solution, 13： 100(g/g) ; ratio of Lyc 五 Cortex to liquid was 1 • 20(g/g ) ；ultrasonication at 55 兀 for 50 min. The yield of Lycii CorLex polyphenols ( LCPPs ) was 17. 88 mg/g under the optimumcondition. The antioxidant capacity of LCPPs were evaluated by assays of DPPH , ABTS , FRAP , ORAC , in tracellular GSH content and SOD activity ・ The results showed that the IC 50 of DPPH • and ABTS • byLCPPs were 20.00 mg/L and 59. 37 mg/L respectively ； the scavenging capability of reactive oxygen spe cies by LCPPs was higher than Trolox at the same concentration ； LCPPs can significantly increase the T- GSH content and SOD activity.Key words : Lycii Cortex polyphenols ; aqueous two-phase system ； antioxidant ; total glutathione ; SOD 地骨皮为茄科植物枸杞(Zyc 加ni chinense Mill.)或宁夏枸杞(AyEizm barbarum E.)干燥的根皮，可凉 血除蒸，清肺降火,用于阴虚潮热，骨蒸盗汗,肺热咳 嗽，内热消渴等⑷。
双水相萃取技术是一种利用物质在两相间选择性分配的分离纯化技术，其原理与水一有机相萃取原理相似。
双水相体系是指高聚物之间或高聚物与无机盐之间以适当的浓度溶解后形成互不相溶的两相或多相体系。
该体系含水量高，蛋白在其中不易变形；表面张力低，有助于强化相间的质量传递；分相时间短，易于放大和连续操作，萃取环境温和，生物相容性好等，考虑到双水相萃取技术的以上诸多优势，因此本文就采用了双水相萃取技术分离纯化尿酸酶和磷酸甘油氧化酶，建立了适当的双水相体系，并对影响萃取效果的各种因素进行了研究。
同时对萃取后，酶的进一步分离纯化和鉴定作了相关研究。
主要研究结果如下： 1.选用PEG和硫酸铵作为双水相体系的组成部分，分别用三种分子量的PEG(即PEG400，PEG600，PEG2Q00)与硫酸铵建立起三种双水相体系。
并确定了组成浓度的范围。
2.利用三种双水相体系萃取分离发酵后的菌体破碎液中的尿酸酶，确定了萃取尿酸酶的最佳PEG分子量为2000。
研究了萃取体系中各种因素对尿酸酶萃取的影响，确立了萃取尿酸的最佳条件。
当PEG2000为25％，硫酸铵为9％，PH=7.5，NaC12％为，粗酶量为5％时，萃取后的尿酸酶的纯化倍数达到了10，回收率约为90％。
根据SDS-PAGE检测，得出萃取后的杂蛋白明显少于萃取前。
并采用DEAE阴离子交换层析对双水相萃取后的尿酸酶进一步纯化，通过SDS-PAGE进行鉴定，还原和非还原均得到一条带。
3.利用双水相体系萃取发酵中的磷酸甘油氧化酶，确定萃取GPO的最佳PEG分子量，为PEG2000。
改变双水相体系的各种条件，得到萃取GPO的最佳双水相体系，即PEG2000浓度为16.5％，硫酸铵浓度为13.2％，PH=7.5，粗酶量为30％时，萃取后GPO的纯化倍数达到7.0，回收率为90％。
通过电泳对比萃取前后的蛋白，得出萃取后的目的蛋白的纯度明显提高。
并采用DEAE阴离子交换层析对双水相萃取后的GPO进一步纯化，通过SDS-PAGE进行鉴定，还原和非还原均得到一条带。
生物技术大实验论文论文题目：双水相萃取技术提取过氧化物酶工艺研究作者姓名：郑海指导老师：吴元喜提交日期：2007年5月目录摘要 (Ⅰ)Abstract (Ⅱ)1.综述……………………………………………………………………………１1.1开题背景……………………………………………………………………１1.1.1过氧化物酶………………………………………………………………１1.1.2双水相萃取技术…………………………………………………………１1.2国内外进展…………………………………………………………………２2.方案论证………………………………………………………………………５3.过程设计………………………………………………………………………５3.1实验流程……………………………………………………………………５4.结果与讨论..............................................................................９4.1预实验.................................................................................９4.2正交实验..............................................................................９4.3梯度实验 (10)4.4验证实验 (11)4.5超滤 (11)4.6凝胶过滤 (12)4.7电泳 (12)5.结论与展望 (12)5.1工艺流程数据分析 (12)5.2结论及前景展望 (13)致谢 (13)参考文献 (13)摘要过氧化物酶[Peroxidase, POD, EC1. 11. 1. 7 (x)〕是一类以血红素为辅基的酶，在生物中广泛存在，具有多种不同的生物功能，主要催化H202和有机过氧化物对多种有机物和无机物的氧化作用。
它在蛋白质、多肽、激素、病毒、寄生虫、生物降解及神经系统等方面都有应用，具有特异性强，灵敏度高等优点。
本文利用PEG4000/（NH4）2SO4双水相体系配合适当的工艺流程，从萝卜中提取纯化过氧化物酶，使过氧化物酶纯化了18.7倍，得到的过氧化物酶比活为110u/mg，该方法具有反应条件要求温和，不需要低温操作，总酶活回收率高，及整个流程可以实现循环等优点，具有较好的工业化前景关键词：过氧化物酶；双水相；超滤；凝胶过滤Abstract:Peroxidase[POD，EC1.11.1.7 C x ) ] is a kind of redox enzyme with hemoglobinas prostheric group, which widely exists in organism and has many differentbiological functions. It mainly catalyzes the oxidation of hydrogen peroxide andorganic peroxide with many inorganic and organic substances. For the high specificityend sensitivity, it is widely applied in protein, polypeptide, hormone, virus, parasite,lignification, biology degradation and neuro-system etc. PEG4000/（NH4）2SO4 double aqueous phase system and appropriate process were used to extract POD from radish. It made POD Purification 18.7 times,the POD’s activity was 110u/mg. this method have many advantages such as the reaction conditions is moderate and didn’t need Low temperature operation , high recovery and a cycle Process, So it has good Industrialization prospects!Key words: POD；double aqueous phase system；ultrafiltration；gel filtration1.综述1.1开题背景1.1.1过氧化物酶1.1.1.1过氧化物酶（peroxidase）是一种分解生物体某些代谢产物是分解生物体某些代谢物需氧脱氢后所产生的对机体有害物质的一种酶。
当有底物存在时,该酶能催化过氧化氢分解,使之不能在体内过多地积累而产生伤害,因而它具有保护生物体的作用。
同时,该酶又是一类以铁卟啉为辅基的酶,广布于动、植物组织,在细胞代谢过程中起重要作用。
除此之外,它还是植物生长及抗病重要生理生化指标。
更为重要的是该酶又是酶作用机制中“中间产物学说的直接证据[1]。
1.1.1.2过氧化物酶（peroxidase）是最早发现的酶之一，广泛存在于生物界中，也是被广泛研究的一类酶[2]。
大部分过氧化物酶都含有血红素，在催化过程中起到基础性作用[3,4],能催化H2O2或相关化合物如O2和有机、无机化合物的氧化反应等[5,6]，所以过氧化物酶在食品、医药、环保和化工等行业中已得到广泛的应用，是需求量较大的工业用酶，如过氧化物酶在工业上可与过氧化氢共同用于橡胶成型、塑料及多泡沫性粘合剂的合成及纤维的漂白，并可以用于食品加工业的杀菌等等[7]1.1.1.3传统的过氧化物酶的提取方法主要是盐析法，其纯化效果好，酶比活稍高，但存在操作复杂，生产时间长，且大多时间都要求低温操作，丢失的酶量多，提取率低，不适宜工业化生产。
[8]。
1.1.2双水相萃取技术1.1.2.1双水相萃取与水- 有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配,但萃取体系的性质不同。
当物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响,使其在上、下相中的浓度不同。
分配系数K 等于物质在两相的浓度比,各种物质的K 值不同(例如各种类型的细胞粒子、噬菌体等分配系数都大于100 或小于0. 01 ,酶、蛋白质等生物大分子的分配系数大致在0. 1～10 之间,而小分子盐的分配系数在1. 0 左右) ,因而双水相体系对生物物质的分配具有很大的选择性。
[9]1.1.2.2早在1896年,Beijerinck观察到,明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液混合时,得到一种不透明的混合溶液,静置后可分为两相,上相中含有大部分的明胶, 下相中含有大部分琼脂(或淀粉) ,这种现象被称为聚合物的不相容性,从而产生了双水相。
例如将2. 2 % (质量分数)的葡聚糖水溶液与0. 72 %的甲基纤维素的水溶液等体积混合静置后,可以得到两个液层,下层含有71. 8 %的葡聚糖,上层含有90.3 %的甲基纤维素,两相的主要成分都是水[10]。
由于双水相萃取条件较为温和,不会导致被分离物质的失活,该技术已应用于生物大分子的分离和纯化,并且在生物小分子的分离、抗生素提取、中药中有效成分提取分离、稀有金属/贵金属分离等方面的应用也取得了进展。
在双水相体系中,常见的水溶性高聚物有:聚乙二醇( PEG) 、聚丙二醇、甲基纤维素、聚丙烯乙二醇、吐温、聚氧乙烯类表面活性剂等;聚乙二醇/葡聚糖和聚乙二醇/无机盐是常用的双水相体系,由于葡聚糖格昂贵,聚乙二醇/无机盐体系应用更为广泛。
[11]1.1.2.3基于双水相的以下一些特点，其在生物高分子的分离中的应用越来越广泛。
（1)含水量高(70 %～90 % ) ,在接近生理环境的体系中进行萃取,不会引起生物活性物质失活或变性;(2)可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋白质,还能不经过破碎直接提取细胞内酶,省略了破碎或过滤等步骤;(3)分相时间短,自然分相时间一般为5 min～15 min;( 4)界面张力小( 10 - 7 ～10- 4mN /m) ,有助于两相之间的质量传递,界面与试管壁形成的接触角几乎是直角;(5)不存在有机溶剂残留问题,高聚物一般是不挥发物质,对人体无害;(6)大量杂质可与固体物质一同除去;(7)易于工艺放大和连续操作,与后续提纯工序可直接相连接,无需进行特殊处理;(8)操作条件温和,整个操作过程在常温常压下进行;(9)亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的选择性。
1.2国内外进展：1.2.1.1目前国内外对过氧化物酶的提取主要的方法都以盐析作为最重要的步骤，其原理是利用过氧化物酶可溶于水,溶解度约为5 %(W/ V) ,且在0. 58 饱和度以下的硫酸铵溶液中可溶,而在0.62 饱和度以上不溶,可据此用分步盐析的方法,再用有机溶剂丙酮进行分步沉淀可制备出较高活力的过氧化物酶制剂。
其具体流程分为以下几步：1．初酶液的制备；2．加入226g/L（NH4）2SO4盐析，收集上清；3．加入258g/L（NH4）2SO4盐析，收集沉淀；4．蒸馏水溶解，透析除盐；5．丙酮分级沉淀，收集沉淀，6．加入少量蒸馏水溶解，透析除丙酮。
经上述几个步骤就可以得到纯度较高的过氧化物酶。
[8]近年来，有不少的工艺流程中采用了离子交换树脂层析、凝胶过滤等一些步骤来进一步提高过氧化物酶的纯度，但是盐析仍旧是整个工艺流程中必不可少的一步。
盐析步骤的存在使得整个流程对温度要求比较苛刻，温度过高则容易导致酶的失活，同时盐析步骤的回收率较低，且无法实现循环操作，这样导致目前过氧化物酶的市场价格一直较高。
1.2.2.1双水相萃取由于其独特的优势，目前在分离和提纯生物物质中得到了充分的使用。
主要分为以下几个方面。
①分离和提取各种蛋白质(酶)双水相萃取技术成功地用于分离和提纯蛋白质。
牛血清蛋白(BSA) 在聚乙二醇/ 硫酸盐的双水相系中的分配表明,一般情况下,BSA 适宜于分配在下相;pH 值的变化对分配系数影响不大;外加NaCl 对BSA 在两相中的分配产生很大的影响,由通常的BSA 宜分配于下相转变成宜分配于上相及上相表层;通过改变起始BSA 在溶液中的总浓度,得到平衡时上、下相BSA 浓度随起始BSA 总浓度变化的曲线方程,上相宜用“饱和型”方程表示,下相适合用线性方程表示,将上、下相BSA 浓度之比得到的平衡常数K 的表达式与实验数据拟合较好.真菌脂肪酶在PEG/ 硫酸铵双水相体系中的分配中, PEG 分子量、PEG 浓度、(NH4 ) 2SO4浓度、NaCl 等因素对脂肪酶和总蛋白分配系数、酶活回收率、相体积比均有影响,实际表明用14 %～ 16 % (W/ W) PEG1000 和12 %～ 14 %（W/ W) (NH4) 2SO4 、NaCl 为零所组成的双水相体系,在室温下对脂肪酶的提取率可达71 % ,分配系数可达1. 7 ,提纯倍数为1. 5 。
