高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因(含问题分析)

实验八饮料中咖啡因含量的高效液相色谱分析一、实验目的1．进一步熟悉和掌握高效液相色谱议的结构。

2．巩固对反相液相色谱原理的理解及应用。

3．掌握外标法定量及Origin软件绘制标准曲线。

二、实验原理咖啡因又称咖啡碱，属于黄嘌呤衍生物，化学名为1，3，7－三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。

它能兴奋大脑皮层，是使人精神亢奋。

咖啡因在咖啡中的含量约为1.2％～1.8％，在茶叶中约为2.0％～4.7％。

可乐饮料、止痛药片等均含咖啡因。

咖啡因的分子式为C8H10O2N4，结构式为：NN N NOO3H3C CH3在化学键合相色谱中，对于亲水性的固定相常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，这种情况称为正相化学键合相色谱法。

反之，若流动相的极性大于固定相的极性，则称为反相化学键合相色谱法，该方法目前的应用最为广泛。

本实验采用反相液相色谱法，以C18键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作标准曲线，再根据试样中的咖啡因峰面积，由其标准曲线算出其浓度。

三、实验仪器和试剂1.岛津LC-20A高效液相色谱仪2. 咖啡因（AR），超纯水由纯水机制得，甲醇为色谱纯，配溶液的甲醇为分析纯。

3. 咖啡因标准溶液的配制（1）标准贮备液配制含咖啡因1000 ug/mL的甲醇溶液（实验室准备）。

（2）标准系列溶液用上述贮备液配置含咖啡因10 ug/mL，20 ug/mL，40 ug/mL，50 ug/mL，60 ug/mL的甲醇溶液，备用。

4. 试样市售的可口可乐和百事可乐四、实验条件）颗粒度为5 um的固定相，长150 mm 内径4.6 mm1. 色谱柱（XDB-C182. 流动相甲醇 : 水 = 60 : 40，流量 0.5-1 mL/min3. 检测器紫外光度检测器，270 nm4. 进样量 10 uL五、实验步骤1.制备所需的流动相，有机溶剂用0.45µm的有机滤膜过滤，水溶液用0.45µm 的水滤膜过滤，于超声波发生器上脱气20 min.2. 将配置好的分析试样分别过滤后于超声波发生器上脱气15 min.3. 打开A泵、B泵、检测器、柱温箱及电脑的电源开关。

浙江科技学院生物与化学工程学院仪器分析实验报告姓名：徐艳清学号：3110422005 班级：化工专升本111班实验名称：饮料中咖啡因的高效液相色谱分析——外标法定量一、实验目的<1）熟悉高效液相色谱仪的结构，并熟悉其分析操作；<2）理解反相化学键合相色谱法的原理与应用；<3）学习高效液相色谱保留值定性方法和归一化法定量。

二、实验原理咖啡因属黄嘌呤衍生物，化学名称为1，3，7—三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。

咖啡因在咖啡中的含量约为 1.2%~1.8%，在茶叶中约为 2.0~4.7%。

可乐饮料、止痛药等含咖啡因。

咖啡因的分子式为，其化学结构式如下图：在化学键合相色谱法中，若采用的流动相极性大于固定相极性，则称为反相化学键合相色谱法。

该方法是目前应用最为广泛的色谱方法。

本实验采用C18键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，即为一种反相色谱法。

由于在一定的实验条件下，同一组分的保留值保持恒定，因此在同种条件下，将发酵产物中各组分的保留时间与标准品对照，即可确定该组分存在与否。

本实验采用峰面积进行含量计算。

通过紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作标准曲线，在根据试样中的咖啡因峰面积，由标准曲线计算出试样中咖啡因的浓度。

三、实验步骤(1>将配制好的流动相于超声波清洗器上脱气15min；(2>系统除气泡：大流速泵抽；装柱子：小流速装柱；(3> 平衡：流速由小至大，配比缓慢增加至压力恒定；(4>精密配制含咖啡因浓度为约1mg•mL-1的咖啡因甲醇溶液。

将此甲醇稀释为含咖啡因浓度分别为20、40、80、160、320 μg•mL-1等5份对照溶液；(5>根据前述色谱条件，将仪器调节至进样状态，待仪器流路与电路条件达到平衡状态后，色谱工作站记录的基线呈平直，即可进样分析；(6>依次分别吸取5μL的5份对照品溶液进样分析，记录色谱数据；(7>将可乐试样稀释一倍，经超声波脱气后，精密吸取5μL可乐试样，进样分析，记录色谱数据；(8>实验完成后，按要求关好仪器。

一、实验目的1. 学习高效液相色谱法（HPLC）的基本操作和原理；2. 掌握咖啡因含量测定的标准曲线法；3. 了解可乐饮料中咖啡因含量的测定方法及其意义。

二、实验原理咖啡因是一种具有药理活性的物质，广泛存在于可乐饮料、咖啡和茶叶中。

适量摄入咖啡因具有提神、兴奋神经等作用，但过量或长期摄入咖啡因可能对人体健康产生不利影响。

本实验采用高效液相色谱法测定可乐饮料中咖啡因含量，以期为消费者提供参考。

高效液相色谱法（HPLC）是一种高效、灵敏的分析方法，具有分离度高、检测限低、分析速度快等优点。

本实验采用HPLC法测定可乐饮料中咖啡因含量，通过比较标准曲线与样品峰面积，计算出样品中咖啡因的含量。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：市售可乐饮料、咖啡因标准品、甲醇、乙腈、磷酸二氢钠等；2. 仪器：高效液相色谱仪、超声波清洗器、电子天平、移液器、离心机等。

四、实验方法1. 标准曲线制备：准确称取一定量的咖啡因标准品，用甲醇溶解并配制成一系列浓度的标准溶液。

将标准溶液进样，以峰面积为纵坐标，浓度（mg/L）为横坐标，绘制标准曲线。

2. 样品前处理：准确吸取一定量的可乐饮料，加入适量甲醇，超声处理一定时间，待溶液澄清后，离心分离。

取上清液进样。

3. HPLC分析：根据实验要求，选择合适的色谱柱、流动相、流速、检测波长等条件，进行HPLC分析。

4. 数据处理：将样品峰面积与标准曲线进行比对，计算出样品中咖啡因的含量。

五、实验结果与分析1. 标准曲线：本实验制备的标准曲线线性范围为0.5～30 mg/L，相关系数为0.9999，说明该方法具有良好的线性关系。

2. 样品测定：根据标准曲线，计算出可乐饮料中咖啡因的含量。

3. 结果分析：本实验测定的可乐饮料中咖啡因含量与市售可乐饮料标签标注的咖啡因含量基本一致，说明该方法能够准确测定可乐饮料中咖啡因含量。

六、实验结论1. 本实验采用高效液相色谱法测定可乐饮料中咖啡因含量，操作简单、快速、准确，具有良好的重复性和重现性；2. 该方法为消费者了解可乐饮料中咖啡因含量提供了一种有效的检测手段。

高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量在日常生活中，饮料是我们常见的饮品之一。

而咖啡因作为许多饮料中的一种重要成分，其含量的测定具有重要的意义。

高效液相色谱法（HPLC）是一种广泛应用于分析化学领域的技术，它能够准确、快速地测定饮料中咖啡因的含量。

咖啡因，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤，是一种天然存在于咖啡、茶、可可豆等植物中的生物碱。

由于其具有兴奋神经中枢、提高警觉性和缓解疲劳等作用，被广泛添加到各种饮料中，如咖啡、茶饮料、可乐等。

然而，过量摄入咖啡因可能会对人体健康造成一定的影响，如失眠、焦虑、心悸等。

因此，准确测定饮料中咖啡因的含量对于保障消费者的健康和权益至关重要。

高效液相色谱法是一种基于液体流动相和固定相之间的分配作用来分离混合物中各组分的方法。

它具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、重复性好等优点，适用于各种复杂样品的分析。

在测定饮料中咖啡因的含量时，高效液相色谱法通常采用反相色谱模式，即以非极性的固定相和极性的流动相进行分离。

首先，样品的前处理是测定的关键步骤之一。

对于饮料样品，一般需要进行适当的稀释和过滤，以去除其中的杂质和颗粒物，避免对色谱柱造成堵塞和污染。

对于一些含有较多色素和糖分的饮料，可能还需要进行萃取或固相萃取等净化处理，以提高分析的准确性和可靠性。

在进行高效液相色谱分析时，需要选择合适的色谱柱、流动相、检测波长等条件。

常用的色谱柱有 C18 柱，其具有良好的分离性能和稳定性。

流动相通常由水和有机溶剂（如甲醇、乙腈）组成，并添加适量的酸（如磷酸、乙酸）来调节 pH 值，以改善色谱峰的形状和分离效果。

检测波长一般选择在 270 280nm 之间，因为咖啡因在这个波长范围内有较强的吸收。

仪器设备方面，高效液相色谱仪主要由输液系统、进样系统、色谱柱、检测系统和数据处理系统组成。

输液系统负责输送流动相，使其以稳定的流速通过色谱柱；进样系统用于将样品准确地引入色谱柱；色谱柱是分离的核心部件；检测系统用于检测分离后的组分，并将其转化为电信号；数据处理系统则对检测信号进行采集、处理和分析，最终给出样品中咖啡因的含量。

高效液相色谱法分析饮料中咖啡因的含量1. 实验目的和要求1.1 熟悉高效液相色谱仪的结构。

1.2了解反相高效液相色谱的原理与应用。

1.3掌握外标定量法。

2. 实验原理咖啡因属黄嘌呤衍生物，化学名称为1，3，7-三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。

咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神亢奋。

咖啡因在咖啡中的含量约为1.2%~1.8%，在茶叶中约为2.0~4.7%。

可乐饮料、止痛药等含咖啡因。

咖啡因的分子式为C8H10O2N4，其化学结构式如下图：在化学键合相色谱法中，若采用的流动相的极性大于固定相极性，则称为反相化学键合相色谱法。

该方法是目前应用最为广泛的色谱方法。

本实验采用C18键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，即为一种反相色谱法。

通过紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度以最小二乘法进行线性回归，作出标准曲线，在根据试样中的咖啡因峰面积，由标准曲线计算出试样中咖啡因的浓度。

3. 实验仪器与试剂3.1 仪器高效液相色谱仪（带自动进样器，或配置微量进样器）超声波清洗仪分析天平3.2 试剂咖啡因对照品甲醇（色谱纯）纯净水3.3 试样市售可乐。

4. 实验步骤4.1 色谱条件色谱柱：C18，4.6×150mm，5μm流动相：甲醇-水（60：40，v/v）流速：0.8mL·min-1检测波长：254nm柱温：30℃进样量：10μL4.2 操作步骤●精密配制含咖啡因浓度为约1mg·mL-1的咖啡因甲醇溶液。

●将上述溶液用甲醇稀释为含咖啡因浓度分别为20、40、80、160、320 μg·mL-1等5份对照品溶液。

●根据前述色谱条件，将仪器调节至进样状态，待仪器流路与电路条件达到平衡状态后，色谱工作站记录的基线呈平直，即可进样分析。

●依次分别吸取10μL的5份对照品溶液进样分析，记录色谱数据。

●将可乐试样20mL经超声波脱气后，精密吸取10μL可乐试样，进样分析，记录色谱数据。

高效液相色谱法分析饮料中咖啡因的含量院（系）生化系年级2009级专业制药工程姓名吴雄辉学号0940902007课程名称基础化学实验报告实验日期2011年12月日实验地点3L 5楼指导教师夏湘黄玉一．实验目的（1）熟悉高效液相色谱仪的结构，理解反相HPLC的原理和应用；（2）掌握外标定量法。

二．实验原理咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称为1，3，7-三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。

它能兴奋大脑皮层，使人精神亢奋。

咖啡因在咖啡中的含量约为1.2%-1.8%，在茶叶中约为2.0-4.7%。

可乐饮料、止痛药等均含咖啡因。

咖啡因的分子式为C8H10O2N4，其化学结构式如下图：在化学键合相色谱法中，若采用的流动相的极性大于固定相的极性，则称为反相化学键合相色谱法。

该方法是目前应用最为广泛的色谱方法。

本实验采用C18键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，用紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作标准曲线，再根据试样中咖啡因的峰面积，由标准曲线计算出试样中咖啡因的浓度。

三．实验用品仪器：高效液相色谱仪、恒流泵、超声波清洗仪、紫外光检测器等。

试剂：甲醇（分析纯）、咖啡因（分析纯）、二次蒸馏水咖啡因标准溶液的配制：（1）标准储备液配制含咖啡因1000ug/mL的甲醇溶液，备用。

（2）标准系列溶液用上述备用液配制含咖啡因20ug/mL、40ug/mL、80ug/mL、160ug/mL、320ug/mL的甲醇溶液，备用。

试样市售的可口可乐和百事可乐。

四．实验条件（1）色谱柱长150mm，内径4.6mm，装填C-18烷基键合物，颗粒度10μm 的固定相（2）流动相甲醇-水（60：40），流量0.6m/mim（3）紫外光度检测器测定波长254mm，灵敏度0.08（4）进样量10μL五．实验步骤（1）将配制好的流动相置于超声波清洗仪上脱气15min；（2）根据实验条件，将仪器按照仪器的操作步骤调节至进样状态，待仪器液路和电路系统达到平衡时，色谱工作六站或记录仪的基线呈平直，即可进样；（3）依次分别吸取10μL的可乐试样进样，并记录各色谱仪的数据；（4）分别将约20mL的可口可乐和百事可乐试样置于25mL的容量瓶中，用超声波清洗仪脱气15min；（5）依次分别吸取10μL的可乐试样进样，记录各色谱仪的数据；（6）试验结束后，按要求关好仪器。

实验21 高效液相色谱法测定饮料中咖啡因【实验目的】1. 熟悉反相色谱法的工作原理和应用；2. 学习液相色谱仪的基本结构和基本操作；3. 掌握高效液相色谱法定性、定量分析的原理和方法。

【实验原理】1. 基本原理色谱法的实质是一种物理化学分离、分析方法，它利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别，经过反复多次的分配实现组分分离。

根据各组分在色谱图上的保留时间（或保留距离），可直接进行组分的定性分析；测量各峰的峰面积或峰高，即可作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定相应组分的含量。

高效液相色谱法（HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，引入气相色谱理论，并在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器从而实现分离分析的方法。

根据使用的固定相及分离机理不同，高效液相色谱法分为液-固吸附色谱法、液-液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。

（1）正相色谱法采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。

常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等），被分离组分按极性从小到大的顺序流出色谱柱。

（2）反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。

适用于分离非极性和极性较弱的化合物，被分离组分按极性从大到小的顺序流出。

液-液分配色谱能分离多种类型化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、染料、甾族化合物等。

反相色谱法在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。

2. 咖啡因咖啡因又称咖啡碱，由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。

它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋，被广泛应用于食品、饮料的生产工艺中，成为各种功能性饮品的重要成分之一。

实验一高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因咖啡因(caffeine)又名咖啡碱，属甲基黄嘌呤化合物，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤，具有提神醒脑等刺激中枢神经作用，但易上瘾。

为此，各国制定了咖啡因在饮料中的食品卫生标准，美国、加拿大、阿根廷、日本、菲律宾规定饮料中咖啡因的含量不得超过200 mg/L，我国到目前为止咖啡因仅允许加入到可乐型饮料，其含量不得超过150 mg/kg，为了加强食品卫生监督管理，建立咖啡因的标准测定方法十分必要。

高效液相色谱法(HPLC)是可乐型饮料、咖啡和茶叶以及制成品中咖啡因含量的测定方法，简单、快速、准确。

HPLC法检出限:可乐型饮料为0.72mg/L;茶叶、咖啡及其制品为1.8 mg/100g。

一、实验原理咖啡因的甲醇液在286nm波长下有最大吸收，其吸收值的大小与咖啡因浓度成正比，从而可进行定量。

二、试剂1 甲醇HPLC试剂2 乙腈HPLC试剂3 三氯甲烷分析纯（必要时需重蒸）4 超纯水18. 2 M5 无水硫酸钠分析纯6 氯化钠分析纯7 咖啡因标准品纯度98%以上三、仪器和设备1 液相色谱：型号2 色谱柱Bondapak TMC 18 (30 cm X 3.9 mm id)3 预柱RESA VETMC184 超声清洗器(CQ250)5 混纤微孔滤膜四、分析步骤1 试样处理（1）可乐型饮料a 脱气：试样用超声清洗器在40℃下超声5 minb 过滤：取脱气试样10.0 mL，通过混纤微孔滤膜过滤，弃去最初的5mL，保留后5mL备用。

（2）咖啡、茶叶及其制成品：称取1g已经粉碎且小于30目的均匀试样或液体试样放入100 mL烧杯中，先加2 mL～3 mL超纯水，再加25 mL三氯甲烷，摇匀，在超声处理机上萃取1 min(30 s二次)，静置30 min，分层。

将萃取液倾入另一100 mL 烧杯。

在试样中再加20 mL三氯甲烷，重复上述萃取操作步骤，弃去试样，合并二次萃取液，加入少量无水硫酸钠和5 mL饱和氯化钠，过滤，滤入50 mL容量瓶中，用三氯甲烷定容至50 mL。

实验2、高效液相色谱法测定可乐中的咖啡因含量一、实验目的1、学习高效液相色谱仪的基本操作；2、掌握标准曲线法（外标法）定量分析的方法；3、掌握UV检测器的工作原理及应用范围。

二、实验原理根据朗伯－比尔定律（A=abc）：在一定浓度范围内，样品中被测组分的含量与响应值（峰面积或峰高）成正比。

用标准物质配制一系列不同浓度的标准样品，在一定的色谱条件下，分别测定标准样品和试样的峰面积，以标准溶液的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，采用最小二乘法回归得到被测样品标准曲线的方程；将测得试样的峰面积代入方程，计算得到试样中咖啡因的含量。

三、仪器、试剂及色谱条件仪器：Agilent 1200 HPLC；C18高效液相色谱柱，Φ 4.6mm×15cm，填料粒度5μm；紫外光检测器（DAD）；微量进样器（25μL）；色谱条件：流动相：甲醇：水=65：35（V/V），1mL/min；检测波长：254nm；色谱柱温度：30℃；进样量：10μL。

试剂：无水甲醇、咖啡因（均为分析纯试剂）、市售可乐、超纯水。

四、实验步骤1、流动相的配制：甲醇、水分别须经0.45微米有机膜、水相膜过滤后使用；2、流动相脱气：将流动相置于超声波清洗器上脱气15min（本机配自动脱气装置，脱气过程略）；3、标准溶液的配制：配制咖啡因含量为20、40、80、160、320μg/mL的甲醇溶液；4、按仪器操作说明打开计算机和主机，进入色谱工作站，设定色谱条件；5、启动色谱系统，调整仪器基线，待基线稳定即可进样；7、用进样器分别抽取10.0μL系列标准液及样品，排出注射器中气泡，插入六通阀的进样孔进样，仪器自动开始采集、保存数据；8、实验结束后，用纯甲醇清洗色谱柱及进样器，关闭仪器。

五、数据处理及实验结果以标准溶液的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，采用最小二乘法回归得到标准曲线方程，计算可乐中咖啡因的含量，实验结果见下表。

HPLC测定可乐中咖啡因含量实验结果表六、思考题1、标准曲线法定量准确度的影响因素有哪些？2、为什么流动相必须要经过脱气、过滤处理？3、紫外检测器适合于分析那些种类的物质？实验、GC-MS定性分析混合溶剂的成分一、实验目的1、学习GC-MS的基本操作；2、掌握GC-MS的构成及工作原理；3、了解谱库检索法定性分析有机化合物的方法。

高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因一、目的要求1、学习高效液相色谱仪的操作。

2、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理。

3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。

二、基本原理咖啡因又称咖啡碱，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱，它属黄嘌呤衍生物，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤。

咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。

咖啡中含咖啡因约为 1.2~1.8%，茶叶中约含2.0~4.7%。

可乐饮料、APC 药片等中均含咖啡因。

其分子式为C 8H 10O 2N 4，结构式为： NN 3H 3COO N N CH 3定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。

用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其它组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统。

如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间t R 和峰面积A 后，可直接用t R 定性，用峰面积A 作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。

三、仪器和试剂1、日本岛津公司LC-20A高效液相色谱仪。

2、色谱柱：Kromasil C18，5µ 150×4.6mm。

3、流动相：30%甲醇（色谱纯）+70%高纯水；流动相进入色谱系统前，用超声波发生器脱气10min。

4、咖啡因标准贮备溶液：将咖啡因在110℃下烘干1h。

准确称取0.1000g咖啡因，用二次蒸馏水溶解，定量转移至100mL容量瓶中，并稀释至刻度。

标样浓度1000μg·mL-1。

5、测饮料试液：可乐，茶叶，速溶咖啡。

6、20μL平头微量注射器。

四、实验步骤1、标准贮备液配制质量浓度分别为20、40、60、80μg·mL-1的标准系列溶液。

（1mL，2mL，3mL、4mL稀释为50mL）2、谱仪器条件：3、泵的流速：1.0mL/min；检测波长：275nm；进样量：10μL；柱温：室温。

实验四高效液相色谱分析饮料中的咖啡因
一、实验目的
1、掌握高效液相色谱的工作原理及基本结构；
2、了解高效液相色谱色谱柱及检测器的类别；
3、掌握用高效液相色谱进行定量和定性分析的原理；
二、实验原理（预习《仪器分析教程》第十五、十七章，根据下面纲要完成
实验原理的预习）
高效液相色谱是一类应用广泛的现代仪器分析技术，属于分离分析方法。

高效液相色谱主要由：高压输液系统、进样系统、分离系统－色谱柱、检测系统四部分组成。

利用保留时间可以进行定性分析，根据色谱峰高或者峰面积可以进行样品的定量分析。

三、仪器试剂
1、仪器：Agilent 1100高效液相色谱分析系统；C-18反相色谱柱；紫外可见吸
收单波长检测器；手动六通阀进样器；液相色谱用微量进样注射器；
2、试剂：咖啡因系列标准溶液；色谱纯水和甲醇；可口可乐；
四、实验步骤
1、仪器构造和原理讲解；
2、开机用洗脱剂平衡色谱柱半个小时；
3、依次测定系列咖啡因标准溶液的色谱流出曲线；绘制标准工作曲线；
4、测定可乐样品的色谱流出曲线，计算出可乐中咖啡因的含量。

五、数据处理及结果讨论
对实验数据进行分析和讨论。

六、思考题
1、高效液相色谱的流动相为什么要预先除气，常用的除气方法有那些？
2、反相柱的固定相和流动相分别具有什么特征？
3、如何提高色谱柱的柱效？。

反相高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因的含量前言：本次实验报告在前言中简单阐述HPLC 基本原理，介绍HPLC 仪器的结构特点和应用范围；研究对象的化学结构、理化常数和文献报道测定方法。

咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称1,3,7-三甲基黄嘌呤，可由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。

它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。

咖啡中含咖啡因1.2%－1.8％，茶叶约含2.0%－4.7％。

可乐、APC 药片中均含有咖啡因。

其分子式为C 8H 10O 2N 4，结构式：N N N NCH 3CH 3CH 3OO一、仪器与试药高效液相色谱仪（日本岛津）。

咖啡因对照品；甲醇为色谱纯；百事可乐（康师傅乌鲁木齐饮品有限责任公司）；红牛（红牛维他命饮料有限公司）；叶尔羌茶（新疆叶尔羌茶有限责任公司）。

二、方法与结果2.1 色谱条件 色谱柱：C18（4.6x150mm ，5µm ），流动相：甲醇:水=30:70，测定波长280nm ，柱温30℃，流速：1ml/min ，进样量：10μL 。

2.2 系统适用性实验 取供试品20µL 进样，记录色谱图，咖啡因峰的保留时间为 4.253 min ，各峰与相邻峰的分离度为 ，拖尾因子为 ，符合药典规定，理论塔板数按咖啡因峰计算大于2000。

对照品及供试品的色谱图如下：⑴ 对照品的色谱图0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0min0510152025303540455055mVDetector A Ch1:280nm1.4981.6104.3005.112⑵ 供试品的色谱图0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0min01234567891011121314mVDetector A Ch1:280nm 0.8001.5182.1582.3284.3425.1022.3 溶液制备精密称取咖啡因对照品10mg ，加甲醇定容至10ml 。

高效液相色谱法测定可口可乐中咖啡因的含量姓名：学号：前言高效液相色谱是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广、色谱柱可反复使用的特点。

咖啡因（Caffeine ）是日常饮料中主要成分，据查验，1g雀巢咖啡含35咖啡因，1g茶含20-35mg，而1000ml可乐饮料中含90-100mg[1]。

咖啡因亦称咖啡碱，是一种甲基黄嘌呤，属生物碱类物质，化学名称为l，3，7一三甲基一3，7一二氢一1H一嘌呤一2，6一二酮水合物，化学式C。

H。

N。

0：，相对分子质量为194．2，易溶于水、乙醚、氯仿、二氯甲烷，能溶于乙醇、丙酮、醋酸乙酯，难溶于乙醚和苯，熔点为235～237℃，白色结晶粉末，无臭，味苦，有风化性[2]。

咖啡因是从茶叶、咖啡果中提炼出来的一种生物碱，属黄嘌呤类，药理作用相似，咖啡因的中枢兴奋作用较强，临床主要用作中枢兴奋药。

适度地使用有祛除疲劳、兴奋神经的作用，临床上用于治疗神经衰弱和昏迷复苏。

但是，大剂量或长期使用也会对人体造成损害，特别是它也有成瘾性，一旦停用会出现精神萎顿、浑身困乏疲软等各种戒断症状，被列入受国家管制的精神药品范围。

化学名称1,3,7-三甲基黄嘌呤，可由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。

它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。

常用来测定咖啡因的方法有滴定法[3]，紫外分光光度法[4]，高效液相色谱法[5]，气相色谱法[6]，毛细管电泳法[7]等。

1试剂、仪器和药品仪器：KQ3200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司；AL204电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；Waters-2695高效液相色谱仪（美国；试剂：甲醇为色谱纯、超纯水；样品：可口可乐饮料(市售)；对照品：咖啡因(原料药)；2色谱条件1.色谱柱：INERTSIL-ODS-SP-18( 4.6×150mm，5um)；2.流动相：甲醇：水=35:65（V/V）；3.流速：1ml/min；4.检测波长：270nm；5.柱温：25℃。

反相高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因的含量前言：本次实验报告在前言中简单阐述HPLC 基本原理，介绍HPLC 仪器的结构特点和应用范围；研究对象的化学结构、理化常数和文献报道测定方法。

咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称1,3,7-三甲基黄嘌呤，可由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。

它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。

咖啡中含咖啡因1.2%－1.8％，茶叶约含2.0%－4.7％。

可乐、APC 药片中均含有咖啡因。

其分子式为C 8H 10O 2N 4，结构式：N N N NCH 3CH 3CH 3OO一、仪器与试药高效液相色谱仪（日本岛津）。

咖啡因对照品；甲醇为色谱纯；百事可乐（康师傅乌鲁木齐饮品有限责任公司）；红牛（红牛维他命饮料有限公司）；叶尔羌茶（新疆叶尔羌茶有限责任公司）。

二、方法与结果2.1 色谱条件 色谱柱：C18（4.6x150mm ，5µm ），流动相：甲醇:水=30:70，测定波长280nm ，柱温30℃，流速：1ml/min ，进样量：10μL 。

2.2 系统适用性实验 取供试品20µL 进样，记录色谱图，咖啡因峰的保留时间为 4.253 min ，各峰与相邻峰的分离度为 ，拖尾因子为 ，符合药典规定，理论塔板数按咖啡因峰计算大于2000。

对照品及供试品的色谱图如下：⑴ 对照品的色谱图0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0min0510152025303540455055mVDetector A Ch1:280nm1.4981.6104.3005.112⑵ 供试品的色谱图0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0min01234567891011121314mVDetector A Ch1:280nm 0.8001.5182.1582.3284.3425.1022.3 溶液制备精密称取咖啡因对照品10mg ，加甲醇定容至10ml 。