微生物显微计数--血球计数板法

一、实验目的1. 掌握血球样板计数法的基本原理和操作步骤。

2. 学习利用血球样板计数法对微生物进行计数。

3. 提高对微生物计数结果的分析能力。

二、实验原理血球样板计数法是一种利用显微镜直接计数微生物数量的方法。

该方法适用于各种微生物的计数，如细菌、酵母、真菌等。

计数原理是将一定稀释度的微生物悬液滴加到血球样板计数室中，在显微镜下直接观察并计数。

血球样板计数室由一块特殊的载玻片构成，其上有四条槽构成三个平台，中间较宽的平台被一短横槽隔成两半。

每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格。

每个大方格分为16个中方格，每个中方格又分为25个小方格。

每个大方格中的小方格总数为400个，每个大方格的边长为0.1mm，因此计数室的容积为0.1mm³。

计数时，通常只计数四个四周大方格内的细胞数。

然后求出每个大方格的平均值，即可得出一个大方格中的平均细胞数。

再根据菌液稀释倍数，计算出1ml菌液中的总细胞数。

三、实验材料1. 血球样板计数室2. 显微镜3. 试管4. 吸管5. 微量移液管6. 细胞悬浮液7. 稀释液8. 滤纸四、实验步骤1. 准备工作：将血球样板计数室及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。

2. 制备细胞悬液：将细胞悬浮液吸取少许，注入试管中，加入适量的稀释液，搅拌均匀。

3. 稀释：根据细胞悬液的浓度，将细胞悬液进行适当的稀释，以便在计数时细胞数适中。

4. 计数：将稀释后的细胞悬液吸取少许，滴加到血球样板计数室的盖片边缘，使培养液自然渗透填满计数室。

等待一段时间，让细胞全部沉降到计数室底部。

5. 观察：将计数板放在显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在的位置，然后转换到高倍镜观察。

计数四个四周大方格内的细胞数，记录下来。

6. 计算结果：根据计数结果和菌液稀释倍数，计算出1ml菌液中的总细胞数。

五、实验结果与分析1. 实验结果：通过血球样板计数法，得到酵母菌的计数结果为N个细胞/ml。

微生物的计数一一血球计数板法【摘要】测定微生物细胞数量的方法很多，有分光光度法、显微直接计数法和平板计数法。

分光光度法比较简便，易操作，但是会使数据严重偏大。

而平板计数法则会使实验数据严重偏小。

显微汁数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有朵菌或杂质，常不易分辨。

菌体较大的酵母菌或覆菌抱子可釆用血球讣数板，一般细菌则釆用彼得罗夫•霍泽（Petrof Hausser）细菌讣数板。

两种讣数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。

而血球讣数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。

本实验采用血球计数板法，主要U的是了解血球计数板法的构造和使用方法，学会用血球讣数板对酵母菌细胞进行计数。

一、实验目的与要求1、了解微生物汁数常用的三种方法：分光光度法；平板计数法；血球计数板法。

2、了解血球计数板的构造和使用方法。

3、学会用血球讣数板对酵母细胞进行计数。

二、基本原理利用血球讣数板在显微镜下直接讣数，是一种常用的微生物讣数方法。

此法的优点是直观、快速。

将经过适当稀释的菌悬液（或泡子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。

由于计数室的容积是一定的（0.1mm'）,所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数LI来换算成单位体积内的微生物总数Uo III于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故乂称为总菌计数法。

血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上山四条槽构成三个平台。

中间的平台乂被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。

计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格乂分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格乂分成16个小方格。

但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的,即16X25=400小方格。

实验七微生物显微计数-－血球计数板法一、目的要求1．了解血球计数板的构造和使用方法。

2．学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。

二、基本原理利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。

此法的优点是直观、快速。

将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。

由于计数室的容积是一定的（0．1mm2），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。

由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。

血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。

中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。

计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。

但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格。

每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm3。

在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。

下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数因1ml=1cm3=1000mm3，=50000A·B（个）同理，如果是16个中方格的计数板，设五个中方格的总菌数为A＇，则三、器材酿酒酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管。

四、操作步骤1．稀释将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。

血球板计数法（25x16)
器材：血球计数板、显微镜、盖玻片、酒精、胶头滴管、吸水纸、纱布若干、蒸馏水、移液管
操作步骤：1.配置菌悬液：将样用单层纱布过滤，摇晃后用移液管取适量样品至容量瓶中稀释（稀释情况依菌数量定，一般蜡牙菌放罐时稀释400倍，酵母干粉取0.25g稀释至250ml）
2.镜检计数室：将干净的血球计数板放置显微镜下，视野内若有菌，重新清洗，直至完全清洁
3.制板：取干净的载玻片，放置血球计数板中央，用胶头滴管轻轻的沿盖玻片边缘滴入（两侧均滴），放平，用吸水纸吸取边缘多余菌液，静止约5min
4.计数：选取5个中方格（每个中方格内有16个小方格）计数，格线上的一般只数上方和右方的。

5.清洗血球计数板，轻轻放置酒精瓶中
计算：
每毫升细菌个数=50000 *菌液稀释倍数*5个小方格中的细菌个数
每克细菌个数=50000*菌液定容体积x*5个小方格中的细菌个数/菌重量/(1-干粉含水量）
注意事项：
1.计数时，轻轻转动细焦，以便把视野内不同形状的菌全部看到；
2.不可用力擦拭血球计数板，以免留下划痕
3.配制时一定要摇匀后再制片
4.干粉含有一定水分，最后计算结果要除去含水量。

微生物的显微直接计数法实验原理测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。

显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。

菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。

两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。

而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。

血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。

中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图21-1），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。

但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。

计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。

盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。

使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。

已知：1mm3体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3所以：1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数K=4×106 。

因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d）实验器材1．活材料：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培养液。

2．器材：显微镜、血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。

实验四 微生物显微镜直接计数法和死活细胞的鉴定 以及四大类微生物菌落形态的比较和识别微生物显微镜直接计数法一、实验目的1、学习使用血球记数板测定微生物数量的方法。

2、学习并掌握形态观察及死活细胞的鉴别方法。

二、实验原理酵母菌显微直接计数—血球计数板三、实验材料显微镜、血球记数板、酵母菌悬液、盖玻片、无菌滴管、吸水纸、擦镜纸.四、实验步骤1、取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖血盖片。

2、取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。

3、用10×(40x)镜观察并将计数室移至视野中央。

4、在10×(40x)镜下计数：计数5个中格的平均值，最后再换算到每mL 菌液中的含菌数。

注意事项：计上不计下，计左不计右。

出芽计一半。

五、实验结果将显微计数结果记录于下表中。

T 表示五个中方格中的总菌数。

各中格中菌数T二室平均值个/ml12345第一室第二室六、问题与讨论在显微镜下直接测定微生物数量有什么优缺点？有何改进方法？②酵母菌死活细胞的鉴定一、实验原理美蓝是一种无毒的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。

用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。

因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色，借此即可对酵母菌的死活细胞进行鉴别。

二、实验材料酵母菌悬液、0.1 ％吕氏碱性美蓝染色液显微镜、载玻片、盖玻片。

三、实验步骤美蓝镜片的观察1）在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色掖，然后按无菌操作用吸取计数时酵母菌样品液放在染液中，混合均匀。

2）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。

3）将制片放置约1min后镜检，低倍镜到高倍镜观察，根据颜色来区别死活细胞。

注意事项1、加染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。