免疫细胞化学 (abcam新版指南)ICC-IMMUNOCYTOCHEMISTRY

第一章免疫细胞化学基本概念及发展简史一．免疫细胞化学的基本概念免疫细胞化学（immunocytochemistry)是利用特异性抗原抗体反应，观察和研究组织细胞特定抗原(或抗体)的定位和定量的技术。

应用免疫细胞化学技术可以在光镜和电镜水平观察细胞膜及细胞内某种抗原物质的存在。

从而为生物医学研究生命大分子,特别是那些对细胞化学方法来说尚无作用物或作用物特异性不强的酶、蛋白质、激素及受体蛋白等在组织内分布、细胞内定位以及代谢状态等，提供了特异性强、灵敏度高而又直观化的原位分析细胞组成物质的细胞化学手段。

二．免疫细胞化学的发展简史1941年，Coons等创立了荧光抗体法1959年，Singer创立了铁蛋白法1966年，Nakane等创立了免疫酶技术1971年，Faulk和Taylor 创立了免疫胶体金法1976年，Bayer等提出了亲合组织化学法第二章免疫细胞化学相关的组织学和细胞学技术一．取材（一）组织标本的取材1.活检钳的刃口锋利，以免组织受挤压。

2.取所需组织：主要病变区、病灶与正常组织交界区。

必要时取远离病变区的正常组织作为对照。

3.为充分保存组织的抗原性，取材要快，尽量保持组织新鲜。

（二）细胞标本的取材1．印片法应用：活检标本、手术切除的标本。

方法:新鲜标本以最大面剖开暴露病区，载玻片轻压病区，脱落细胞黏附于载玻片上，立即浸入固定液中5－10分钟，取出自然干燥,低温保存。

优点:简便省时，细胞抗原保存较好。

缺点:细胞分布不均重叠，影响标记效果.2．穿刺吸取涂片法应用：实质器官的病变区.方法：①穿刺液较少时直接涂片，力求均匀。

②穿刺液较多时，穿刺液滴入1－2毫升Hanks液（RPMI1640液）内，轻搅，500rpm离心5－10分钟，弃上清，制成细胞悬液(2x106细胞/ml)，吸一滴于载玻片上，轻涂，干后固定。

优点：细胞均匀.缺点：细胞易变形。

3．体液沉淀涂片法①细胞数多，取一滴直接涂片。

②细胞数少，取5毫升自然沉淀液以1500rpm离心10分钟，弃上清，将沉淀涂片，略干后固定备用。

免疫组织化学染色（IHC）定义：免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

免疫组化原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。

众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。

免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。

通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。

组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

免疫组化检测标本1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片；2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片。

免疫组化操作步骤①石蜡切片制作1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4% 多聚甲醛溶液内固定12 h。

2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，70%酒精1 h，80%酒精1 h，95%酒精1 h，无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各1 h3、透明：1:1无水乙醇二甲苯溶液30 min，二甲苯溶液中10 min（组织块透明即可）。

Moc-31、EMA、CEA在良恶性胸腹水鉴别诊断中的应用罗锦;朱正鹏;贾国凤;方静怡;马健波;张睿【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2015(000)010【摘要】目的：探讨Moc-31、EMA、CEA在良恶性胸腹水鉴别诊断中的应用价值。

方法136例胸腹水标本行细胞涂片瑞氏染色、细胞块 HE 及免疫细胞化学( immunocytochemis-try, ICC) SP法染色并观察。

结果细胞形态学结合ICC染色分析后,恶性胸腹水检出率由22．1%(30/136)提高到30．9%(42/136)。

Moc-31、EMA、CEA在恶性和良性胸腹水中的阳性率分别为95．2%和1．1%、92．9%和16．0%、88．1%和0．0。

三者在良恶性胸腹水中的表达差异有统计学意义(P<0．01)；其中Moc-31敏感性最高,CEA特异性最高。

同时通过联合检测其他免疫指标证实肿瘤细胞的组织学来源。

结论应用胸腹水细胞块ICC技术联合检测Moc-31、CEA、EMA,能显著提高细胞学诊断的准确性；同步检测其他免疫标记可以进一步明确其组织学分型及来源。

【总页数】3页(P1177-1179)【作者】罗锦;朱正鹏;贾国凤;方静怡;马健波;张睿【作者单位】湖北医药学院附属东风医院病理科，十堰 442008;湖北医药学院附属东风医院病理科，十堰 442008;湖北医药学院附属东风医院病理科，十堰442008;湖北医药学院附属东风医院病理科，十堰 442008;湖北医药学院附属东风医院病理科，十堰 442008;湖北医药学院附属东风医院病理科，十堰 442008【正文语种】中文【中图分类】R730.4【相关文献】1.CEAmRNA、CEA蛋白检测在良恶性胸腹水中鉴别诊断的价值 [J], 陈杰;张雪华;张行;潘锵荣2.液基细胞学检测联合DNA倍体分析在良恶性胸腹水鉴别诊断中的应用 [J], 王应霞;张旋;吴莹莹;舒然;潘国庆3.pH与CEA及CA-199联合检测对良恶性胸腹水的鉴别诊断价值 [J], 钱同胜;刘云4.MOC-31和CD44v6在良恶性腹水鉴别诊断中的应用 [J], 陈江帆;姜海娇;祝迪;王秀茹;李建华5.细胞形态学结合胸腹水／血清CEA比值在良恶性胸腹水鉴别诊断中价值 [J], 杨志军;王玉平;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

免疫组织化学技术在肿瘤诊断中的应用引言：免疫组织化学技术（Immunohistochemistry，简称IHC）是一种基于抗体与抗原特异性反应的特殊染色技术，具有高灵敏度、高特异性和广泛的应用范围。

在肿瘤诊断中，免疫组织化学技术被广泛应用于肿瘤类型鉴定、预后判断和治疗选择等方面，并逐渐成为肿瘤诊断领域的重要工具。

一、肿瘤类型鉴定免疫组织化学技术可通过检测肿瘤标志物的表达情况来确定肿瘤的类型。

不同类型的肿瘤会表达特定蛋白，通过观察这些蛋白的表达情况，可以为准确诊断提供线索。

例如，在乳腺癌中，雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）的阳性表达对于判断患者是否适合内分泌治疗非常重要；HER2蛋白过度表达或基因扩增则与Herceptin治疗的有效性相关。

另外，通过检测细胞角蛋白、细胞间连接蛋白等标志物的表达情况，可以帮助判断肿瘤是否来源于上皮组织或间质组织。

二、预后判断免疫组织化学技术在预后判断方面也具有重要意义。

通过评估肿瘤标志物的表达强度和分布范围，可以对患者的生存期和复发风险进行初步判断。

例如，在乳腺癌中，Ki-67是一种与细胞增殖密切相关的标志物，其高表达往往与较差的预后相关；p53蛋白过度表达与恶性程度增加以及放化疗抵抗有关。

通过检测这些标志物，可以为患者提供更加个体化和精确的治疗方案。

三、治疗选择免疫组织化学技术在治疗选择方面也能够发挥作用。

目前很多靶向药物的应用都会依赖于特定分子标志物在患者肿瘤组织中的表达情况。

通过检测这些标志物，可以确定患者是否适合接受特定的靶向治疗。

例如，EGFR是结肠癌中艾司唑仑的治疗标志物；ROS1在非小细胞肺癌患者中能够预测克唑替尼的应用效果。

四、技术进展与挑战随着免疫组织化学技术的不断发展，一些新的标志物已经被引入到临床实践中。

如PD-L1在肺癌和其他恶性肿瘤中的表达与免疫检查点抑制剂治疗反应相关；BRCA1/2基因突变是用于判断乳腺和卵巢癌家族遗传风险和药物敏感性的重要指标。

免疫细胞化学ICC检测流程（本方法适用于贴壁型细胞作爬片及检测）细胞片制作1）细胞固定液Carnoy固定剂配制方法：无水酒精：氯仿：冰醋酸（乙酸）按照体积比6：3：1的比例混合2）操作：3-1消化贴壁细胞，镜下观察，一般一个T25的瓶子可以铺一个6孔板的量3-2将盖玻片以镊子夹住一角，泡入酒精消毒后，火上烤几秒钟，冷却后放入6孔板中，要能差不多盖住孔的大部分面积为好3-3将细胞放入孔中分散，避免污染3-4待细胞贴壁长至60-70%盖片面积时（这个过程中可以根据试验设计，施加干扰因子或药物处理等。

具体时间由自己把握），即可倒掉培养液，取出盖片；3-5盖片用PBS或双蒸水轻轻洗涤（注意：洗涤片子时力度不要太大，避免细胞脱落，以下的处理同）几次以去掉残留的培养液，要注意细胞片的正反面，不要弄反了。

3-6 将细胞片浸入上述固定液（根据试剂情况选择合适的固定液，一般推荐Carnoy固定剂），固定时间15-20分钟即可3-7 取出细胞片，自然晾干，可以直接进行染色实验，接下述染色流程如不染色则按照下列流程处理保存细胞片3-8 将细胞片依次进入75%、80%、90%、95%、100%、100%酒精、二甲苯中各5分钟，取出3-9将细胞片用透明胶带贴附在载玻片上（细胞片的两端用透明胶固定贴好就可以了）3-10 放进冰箱冷冻室保存（-20度）。

一般可以保存10-15天时间，细胞不变形不溶解染色ICC二抗为福州迈新公司，KIT0305，浓缩型羊抗鼠/兔超敏SP试剂盒1）1×PBS缓冲液（0.01 M，pH7.2）洗涤切片3×5M；2）3%H2O2（以PBS缓冲液或甲醇配置）滴加在切片上，室温（18-30℃）静置10min；3）PBS洗2～3次各5min，故洗涤时动作不宜剧烈（以下相同）；4）滴加正常山羊血清封闭液,室温10-15min。

甩去多余液体。

5）滴加一抗50μL，置于湿盒内，4℃抗体孵育过夜或者37℃，1h，防止切片干燥。

请问你曾经被IHC、ICC和IF所困扰过吗？作者：北京义翘神州在实验中，有没有一种感觉，就是对免疫组化(IHC)，免疫细胞(ICC)，以及免疫荧光(IF)傻傻分不清，那么今天我们就来讨论一下这三者的区别，先贴图上来以便有个大致的区分。

从图中我们可以看出，免疫检测技术可以根据报告标签的不同，分为免疫化学和免疫荧光两类，而根据样品类型不同，可以分为组织和细胞检测技术。

因此，才会延伸出三个相近的概念。

为了更好的区分这三个概念，我们还可以根据他们的英文词根来分析一下，他们的英文名分别是免疫组织化学Immunohistochemistry (IHC)，免疫细胞化学Immunocytochemistry (ICC)，免疫荧光 Immunofluorescence (IF)。

词根分析：Immuno-指的是免疫技术（例如，抗体和抗原的结合）Histo-指的是组织（细胞以及它周围的细胞外基质）Cyto-指的是细胞（不包含细胞外的基质）Chemistry-在这里指的是化学检测方法（例如，颜色的变化）Fluorescence-对被激发的荧光团的检测通过对词根的解释，相信你在心中不再迷茫了吧。

这三个应用技术都属于免疫技术，都是将抗原与抗体的结合可视化，即通过一定的方法可以直接看到实验结果。

而常用的方法就是化学显色和荧光显色。

如果报告标签是酶促的，就是免疫化学，如果是荧光的，就是免疫荧光。

其实我们纠结免疫荧光的一个原因还在于免疫荧光的英文名字Immunofluorescence (IF)，但若是写成免疫组织荧光(IHF)或是免疫细胞荧光(ICF)，那我们是不是就豁然开朗了。

虽然这两个词汇在英文文献中应用的还不是很广泛，但绝对不是我自己杜撰的哦，已经有些学者在使用了，规范化应该也只是时间的问题。

可能文字描述还是有些晦涩难懂，那我们就直接上图吧。

先不看下面答案，仅从几张图片，你能明白哪张图代表哪种应用吗？A免疫组织化学：兔EGFR单克隆抗体（10001-R043-50）—人胎盘B 免疫细胞化学：兔α微管蛋白单克隆抗体抗—MEF1细胞C免疫荧光组织：兔Cdk5单克隆抗体—鸡脑组织D免疫荧光细胞：兔JNK2/MAPK9（10745-R004-50）单克隆抗体—人Hela细胞A图和B图是免疫化学（Immunochemistry），这种应用是抗体检测目标蛋白，发生了化学反应，然后显色，根据样本类型的不同，又可以分为免疫组织化学（A）和免疫细胞化学（B）。

ICC-免疫细胞化学染色
原代培养海马细胞神经元的鉴定
将大鼠海马神经元细胞终浓度（2*106个/ml）接种于铺有盖玻片并经多聚赖氨酸包被好的6孔板中，每孔2.5ml，培养条件同上，培养至第8天，用免疫组化法鉴定。

步骤如下：
1.吸弃培养液用PBS冲洗3遍，冷丙酮固定10min。

2.PBS冲洗3遍，3%H2O2（30%双氧水和纯甲醇按1:9的容积比混合）封闭内源性过氧化物酶，室温下10min。

3.PBS冲洗3遍，0.3%Triton破膜（溶解细胞膜，细胞核膜细胞器膜上的脂质）15min，PBS洗3遍。

4.10%羊血清封闭，室温10min，吸弃上清（不洗）。

一抗37℃反应1h（20μL的NSE+1ml稀释液），设空白对照，以PBS代替一抗
5.PBS洗3*5min，二抗（羊抗兔）室温下18min，PBS洗3*5min，SABC复合物37℃，18min。

（二抗标记的FITC在紫外光激发下显色）
6.PBS洗3*5min，DBA显色（5min）。

镜下观察，自来水终止。

DBA稀释度（1:50），苏木素复染（3min），95%乙醇脱水，二甲苯透明20min，中性树胶封固，风干，镜下观察。

注：PBS用0.01M的（配置成0.1M的，用时稀释）。

免疫细胞化学（immunocytochemistry）是将免疫学基本原理与细胞化学技术相结合所建立起来的新技术，根据抗原与抗体特异性结合的特点，检测细胞内某种多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。

肽类与蛋白质种类繁多，均具有抗原性，当将人或动物的某种肽或蛋白质作为抗原注入另一种动物体内，则产生与该抗原相应的特异性抗体（免疫球蛋白）；将抗体从血清中提出后，结合上某种标记物，即成为标记抗体。

用标记抗体与组织切片标本孵育，抗体则与细胞中相应抗原发生特异性结合，结合部位被标记物显示，则在显微镜下观察到该肽或蛋白质的分布。

用荧光素（常用异硫氰酸）标记抗体，并于荧光显微镜下观察，称免疫荧光术。

如抗体与辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）等结合，进行酶显示后，可在光镜或电镜观察，用于电镜者则称为免疫电镜术（immunoelectronmicroscopy)此外，以铁蛋标记抗体白标记抗体，称铁蛋白标记法,也能用于电镜下观察。

标记抗体与抗原结合方式主要有两种：①直接法：用标记抗体与抗体中的相应抗原直接结合，操作方法简便，特异性高，但敏感性较差，此法可用于检定未知抗原；②间接法：先用未标记的具有特异性的第一抗体与样品中的相应抗原结合，然后再以标记的第二抗体与特异性的第一抗体结合；第二抗体是用第一抗体作为抗原注入另一动物体内诱导产生的抗体，然后再结合以标记物。

通过这样的放大作用，使抗原分子上的标记物大大增多，故间接法较直接法的敏感性大为增高，约高5～10倍，故应用更为广泛。

间接法中较常用的，如过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物法(peroxidase anti-peroxidase complexmethod，标记方法PAP法)，该法除需一抗和二抗外，还需要制备HRP标记的抗酶抗体,即以HRP作为抗原免疫动物，制成抗HRP抗体，再以HRP对标记该抗体，制成稳定的环形PAP复合物。