免疫细胞化学常用试剂介绍.

免疫组化操作步骤一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。

3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0, 加水1000ml。

5. 酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。

b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7. 风裱剂：a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。

免疫组化原理步骤及试剂原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。

众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。

免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。

通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。

组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术。

它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。

当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。

由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。

2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。

基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。

免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。

免疫组化常用试剂免疫细胞化学常用试剂介绍佚名一、固定剂大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。

但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。

某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。

因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。

目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。

在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。

1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）试剂：多聚甲醛 40g0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。

该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。

另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。

2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠试剂：A液：多聚甲醛 40g蒸馏水 400mlB液：Na2HPO4·2H2O 16.88g蒸馏水 300mlC液：NaOH 3.86g蒸馏水 200m配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。

注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。

B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH 或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。

免疫组化常用标记物一、常用标志物1、ＣD15(LeuM1)---(阳性部位:细胞膜)。

就是一种由半乳糖、岩藻糖与N－乙酰葡萄糖组成得碳水化合物抗原,又称半抗原χ,就是粒／单核细胞相关抗原、免疫组织化学表达:成熟粒细胞、激活得淋巴细胞(主要就是T淋巴细胞)、R－S细胞、大多数腺癌等。

2、癌胚抗原(carcｉｎoeｍbrｙonic antigen,ＣEA)(CD６6e)——-(阳性部位:细胞膜／浆)、癌胚抗原就是表达于胎儿上皮细胞得一种糖蛋白,分子量为18０kＤａ。

存于某些恶性肿瘤组织尤其就是内胚层来源发肿瘤中,大多数胃肠道(包括胰腺)与肺腺癌均有表达,少量成人上皮细胞与良性肿瘤亦可表达、ＣＥA主要用于标记上皮性肿瘤,尤其就是腺上皮来源得腺癌。

3。

嗜铬素A(chｒomｏｇraｎiｎA,CgＡ)－－—(阳性部位:细胞浆)。

嗜铬素就是位于神经分泌颗粒内得酸性糖蛋白家族,就是一组可溶性酸性蛋白,分子量为７6～120 ｋDａ,分布广泛。

含量最丰富得就是嗜铬素A,另两个就是嗜铬素B与嗜铬素C。

几乎所有得神经内分泌肿瘤中均可检测到嗜铬素、嗜铬素A不仅存在于神经内分泌细胞得分泌颗粒中,也广泛分布于所有含有颗粒得内分泌细胞与神经内分泌细胞来源得肿瘤细胞、此抗体可以识别嗜铬素A 抗原羧基末端得片段,而不与氨基末端得片段反应,主要用于标记神经内分泌细胞及其来源得肿瘤、对小细胞癌进行抗原修复可提高检测得敏感性、4。

细胞角蛋白(cytokeratｉｎpan,广谱CK)－--AＥ1/AE3(阳性部位:细胞浆)。

此抗体可以识别绝大部分酸性细胞角蛋白(Ⅰ型/低分子量)与碱性细胞角蛋白(Ⅱ型/高分子量)、用于标记上皮及上皮来源得肿瘤,特别就是对鉴别与判断转移性肿瘤就是否为上皮源性具有一定得意义、５.细胞角蛋白5/6(cytokeratｉn 5／6,CK5/6)—－－(阳性部位:细胞浆)、在正常组织中,鳞状上皮与导管上皮得基底细胞以及部分得鳞状上皮生发层细胞、肌上皮细胞与间皮细胞阳性,腺上皮细胞阴性。

常用免疫组化试剂介绍概述免疫组化（IHC）是一门通过检测特定抗原在组织切片中的表达程度来揭示组织形态和细胞化学等方面信息的技术。

由于IHC是一种定性分析技术，所以该方法需要与定量技术（如分子生物学）结合使用，从而得到更准确的数据。

IHC涉及到多种试剂，其标记原理和表现形式各异，能够检测的抗原种类也不同。

本文将对常用的IHC试剂进行介绍，以此为指导，让大家更好地了解和应用IHC技术。

常用的免疫组化试剂抗原修复试剂抗原修复试剂（Antigen Retrieval）用于在组织样本中使细胞内蛋白与抗体亲和性和特异性增加。

这种试剂可通过热处理（如高压）或化学处理（如酶样蛋白和酸性处理）来复原被检测抗原的结构和功能。

常用的抗原修复试剂包括：EDTA、Tris、Citrate等。

原位杂交试剂原位杂交试剂（In Situ Hybridization）可检查DNA或RNA分子的特异性结合情况。

这种试剂可将RNA等分子与特定热稳定的蛋白质结合，用于检测基因突变等。

常用的原位杂交试剂包括：流式胶体金试剂、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、双链RNA原位杂交等。

细胞计数试剂细胞计数试剂（Cell Counting）用于获得细胞数量或结构变化。

这种试剂通常用于确定某一类细胞的数量、细胞计数和分离、细胞生长和分裂的应用。

常用的细胞计数试剂包括：皮质醇、14C-labeled thymidine等。

细胞信号转导试剂细胞信号转导试剂（Cell Signaling）用于研究细胞分子级别的通讯系统，并采取措施以确定物质在细胞内的作用机理。

常用的细胞信号转导试剂包括：抗体、试剂原和阻断类似物等。

同型抑制剂同型抑制剂（Isotype Control）用于在IHC实验中作为实验设计的对照组，以检测所观察的抗原与探测剂结合的特异性表现。

常用的同型抑制剂包括：IgG1、IgG2a和IgG2b等。

情况控制试剂情况控制试剂（Condition Control）用于确定IHC试验的最佳条件，包括温度、缓冲液、酸碱程度等。

免疫细胞化学（Coverslip）1.处理后的神经元，冰上吸去培养基，4℃PBS洗2次；（去掉培养基中的血清，排除血清引起的非特异，25K、5K模型可以省略此步。

）2.固定：用预冷的4％PFA(in PBS)，0.5ml/well，4℃放置固定40min，；（使蛋白质等凝固，保持细胞结构状态，维持细胞的抗原性。

）3.打孔：室温吸去PFA，用TBST（0.1％Triton X-100 in TBS）洗2次，5min/次；（Triton X-100是一种去垢剂，可以溶解细胞膜上的脂质，破坏细胞膜结构，促进抗体穿透细胞。

）以下操作可在Parafilm膜上进行（剪适当长度的Parafilm，展平，两端用透明胶粘贴固定在桌面上）：4.封闭：根据需要配好3％封闭血清(in TBST)，室温下吸取60ul/滴至膜上，从培养皿中夹取玻片覆盖在液滴上，有神经元一面朝下，注意赶去气泡且不要让玻片被液体浸没，封闭1h；（针对二抗宿主来源，主要封闭二抗非特异结合位点。

）5.孵一抗：用TBST洗一遍，操作同上，转移玻片至相应的一抗工作液(in 3%BSA in TBS)上，60ul/滴，阴性对照为一抗稀释液，室温孵育2h。

（取湿纸巾置于膜两旁，盖上盖子，以防止水分蒸发。

）6.用TBST洗2次， 10min/次；7.孵二抗；根据一抗种属来源选择合适的二抗(in 3%BSA in TBS)，60ul/滴，室温下避光孵育1h。

（注意抗体针对的种属，使用浓度：Alexa488、Alexa555为1：1000，Cy3、FITC为1：200。

）8.用TBST洗2次，5min/次。

（如抗体的非特异多也可多洗。

）9.Hoechst染色：把1000×Hoechst用PBS稀释，60ul/滴。

10.封片：10min后用TBST洗两次，5min/次，将玻片转移至滴有Mounting Medium的载玻片上。

（注意Mounting Medium的量要适中，保证玻片紧贴载玻片且无气泡。

常用免疫组化试剂（类别）介绍一、用于鉴别诊断（一）上皮源性：1、细胞角蛋白／cytokeratin.CK：目前，商品化的细胞角蛋白有20多种，不同的分子量代表不同类型的上皮标志。

通常将CK分为两大类型：Ⅰ型（低分子量）；Ⅱ型（高分子量）。

理论上讲，大多数单层上皮表达低分子量的CK；复层上皮多表达高分子量的CK；移形上皮（膀胱）和假复层上皮（呼吸道的被覆上皮）既表达低分子量的CK，也表达高分子量的CK。

在癌组织中，低分子量的CK多在腺癌中表达，高分子量的CK多在鳞癌中表达。

目前为止，未发现任何一种上皮只含有一种CK，某些上皮可含2－10种不同分子量的CK。

因此，目前试图应用单一的CK免疫表型来确定某种特定的上皮性肿瘤是不可能的。

同样，应用CK来区别腺癌、类癌和间皮瘤也是困难的。

因此，CK的免疫组化结果判断是一个较为复杂的问题，在应用这类标记物作为腺癌和鳞癌的鉴别应特别注意。

有必要时，应联合用多种CK加以综合判断。

CK的阳性表达还包括有间变癌、双向分化的滑膜肉瘤、脊索瘤、胚胎癌、间皮瘤、上皮样肉瘤、胸腺瘤等。

CK的阴性表达有：副节瘤单向分化的滑膜肉瘤、软骨（肉）瘤、精原细胞瘤、淋巴瘤、脑膜瘤、恶黑、恶纤组、软组织肉瘤（除特殊类型外）。

在判断CK免疫组化结果时应注意几点：（1）CK的单克隆抗体优于多克隆抗体；（2）CK常出现斑点状的假阳性反应，应注意识别；（3）虽然大多数CK多在胞浆表达，但CK17多在胞核表达；（4）绝大多数CK抗体需用胰酶消化，可增加阳性表达率和染色强度；（5）部分非上皮性肿瘤（平滑肌肉瘤）可见有CK表达，在诊断时应注意；（6）淋巴结、扁桃体和脾组织中的滤泡外的网织细胞含有CK8和18以及desmin，在判断淋巴结转移癌和肌源性肉瘤转移时应根据组织学综合判断。

2、上皮膜抗原（epithelialmembraneantigen／EMA）：EMA是上皮细胞分泌的一种乳脂小球膜糖蛋白，广泛存在于人体各种上皮细胞中（也存在于间皮细胞、浆细胞、组织细胞和T细胞淋巴瘤中），其分布与角蛋白相似，但对内脏腺上皮优于细胞角蛋白，尤其是分化差的癌EMA有时可呈强阳性表达。

常用生化试剂作用：1、蛋白酶K：能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，在尿素和SDS中稳定。

一般工作浓度是50—100μg/ml，推荐反应缓冲液：50mM Tris-HCl （pH7.5）,10mM CaCl2。

2、SDS：十二烷基硫酸钠，溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀。

3、IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，常用于蓝白斑筛选及IPTG 诱导的细菌内的蛋白表达等。

IPTG和乳糖的结构相似，所以它和乳糖一样，可以与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵子特异性结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类。

与乳糖不同的是，IPTG不被β-半乳糖苷酶水解。

常与X-GAL一起用于蓝白斑筛选。

作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定。

4、X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，是IPTG的显色试剂，在IPTG的催化下显蓝色。

常跟IPTG一起用与蓝白斑筛选。

5、G418：一种抗生素，对几乎所有的细胞都有毒性，是稳定转染最常用的选择试剂。

当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。

Ｇ418的这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。

6、DMSO：二甲基亚砜。

实验室常用于作液体层析溶剂，同时用作测试物质紫外消光值上时用作参照物。

能溶于所有烷烃和烯烃。

7、曲拉通X-100：TritonX-100，用的细胞裂解液成分之一，在保护蛋白活性方面有一定作用，能力介于NP40和SDS之间，偏向于NP40。

8、NP-40：很温和的去垢剂，1%浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱，结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。

1.pbs缓冲液PBS是磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline）一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。

它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，由于Na2HPO4和KH2PO4它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广；而NaCl和KCl主要作用为增加盐离子浓度。

如有需要PBS还可以补加1 mmol/L CaCl2和0.5 mmol/L MgCl2，以提供双价阳离子。

注：PBS不是磷酸缓冲液（phosphate buffer solution，PB）保存方法高温高压灭菌后置于4摄氏度冰箱保存待用。

PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L， KH2PO42mmol/LPBS缓冲液一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用，具体试剂一般也有不同的比例配方，在针对性上就有了更好的效果。

1x PBS缓冲液就是0.01M的PBS,可直接使用,2x PBS 就是2倍浓度,使用时稀释一倍使用。

0.1M的PBS一般不用来配置缓冲液,用于其它用处。

作用PBS是磷酸缓冲盐溶液的简称，不仅伪狂犬病毒要用它稀释，一般的有活性的生物制剂都要用它来稀释。

原因就是它具有盐平衡、可调整的适宜pH缓冲作用，蒸馏水不具有盐平衡作用，可以破坏生物蛋白的结构及生物特性；生理盐水不具有调整pH的作用，对完整的、具有活性的物质不能保证其在最适条件下参与生物反应，所以使用PBS是首选。

PBS也不是万能的，有的生物活性物质需要的条件比PBS还要高，就需要在平衡缓冲液中加入2.DMEM培养液DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。

与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（低于4500mg/L）和低糖型(低于1000mg/L)。

高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等 DMEM 是 dulbecco's modified eagle medium的缩写，所以其特点主要包括以下：（1）氨基酸含量为依格尔培养基的2倍，且含有非必需氨基酸，如甘氨酸等；（2）维生素含量为依格尔培养基的4倍；（3）含有糖酵解途径中的重要物质——丙酮酸；（4）含有微量的铁离子。

免疫组化原理步骤及试剂免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于生物医学领域的实验技术，用于检测组织切片中特定抗原的分布和表达水平。

它结合了免疫学和组织学的原理，能够在组织切片上定位和检测抗原，并通过染色方法将抗原可视化，从而实现对抗原的定性和定量分析。

免疫组化实验的步骤通常包括固定、脱脂、抗原修复、抗体和检测步骤。

下面将详细介绍每个步骤的操作和常用试剂。

1.组织固定：组织固定的目的是保持组织结构完整并固定细胞的抗原。

常用的固定试剂包括10%中性缓冲福尔马林（10% neutral buffered formalin，NBF）和乙醇等。

2.脱脂：脱脂是将组织切片中的脂质去除，以提高抗体对抗原的结合效率。

常用的脱脂试剂包括二甲苯、甲醛和乙醚等。

3.抗原修复：抗原修复是为了使被固定的组织恢复原样，增强抗原的可检测性。

抗原修复的方法包括热处理、酶解法和pH调整等。

常用的抗原修复试剂包括热解剂例如EDTA缓冲液、Tris-EDTA缓冲液，酶解剂例如胰蛋白酶和蛋白酶K，以及甲酸、盐酸等酸性溶液。

4.抗体：5.检测：检测步骤用于将抗原-抗体复合物可视化。

这通常通过染色方法完成。

常用的染色方法包括免疫酶标记、免疫荧光和免疫金标记等。

免疫组化实验所需的试剂种类繁多，下面列举一些常用的试剂：1. NBF（10% neutral buffered formalin）：用于组织固定，保持组织形态完整。

2.二甲苯：用于脱脂步骤，去除组织中的脂质。

3.甲醛：用于脱脂步骤。

4.乙醚：用于脱脂步骤。

5.EDTA缓冲液：用于抗原修复的热解剂。

6. Tris-EDTA缓冲液：用于抗原修复的热解剂。

7.胰蛋白酶：用于抗原修复的酶解剂。

8.蛋白酶K：用于抗原修复的酶解剂。

9.盐酸：用于抗原修复的酸性溶液。

10.一抗：选择特异性良好的一抗抗体，常用的有多克隆和单克隆抗体。

11.二抗：用于检测一抗结合的抗体，常用的二抗有反兔、反小鼠或反人的多克隆抗体。

免疫组织化学染色试剂免疫组织化学染色试剂是一种用于免疫组织化学染色的特殊试剂，通过与目标分子发生特异性反应，可使其在组织切片上呈现出明显的颜色反应，从而实现对目标分子的定位和定量分析。

免疫组织化学染色试剂主要包括抗体、底物和显色剂三个主要组成部分。

抗体是免疫组织化学染色的核心，其具有高度的特异性，能够与目标分子发生特异性结合。

根据所需检测的目标分子不同，可选择相应的一抗或二抗进行染色。

底物是抗体与目标分子结合后的标记物，一般通过与抗体结合的酶或荧光染料作为标记物，使其在组织切片上呈现出明显的染色信号。

显色剂是底物与标记物反应后形成的可见颜色产物，通过显色剂的作用，可以直观地观察和分析目标分子的分布和表达水平。

在免疫组织化学染色中，常用的试剂有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等酶标记试剂，以及荧光素酶、碱性磷酸酶和荧光染料等荧光标记试剂。

HRP和AP是常用的酶标记试剂，其优点是灵敏度高、信号稳定，适用于常规显微镜观察。

荧光标记试剂具有高度的灵敏度和多色选择性，适用于荧光显微镜观察。

免疫组织化学染色试剂的选择要根据实验需求和目标分子的特性来确定。

首先要选择合适的抗体，确保其与目标分子具有高度的特异性和亲和力。

其次，根据实验的目的和所需的信号强度，选择合适的标记物和显色剂。

最后，根据实验的具体要求和条件，选择适当的染色方法和试剂浓度，以确保最佳的染色效果。

免疫组织化学染色试剂在生命科学研究中起着重要的作用。

通过对组织切片的染色，可以实现对目标分子的定位和定量分析，从而揭示其在组织中的表达和分布特点。

免疫组织化学染色技术广泛应用于免疫学、细胞生物学、肿瘤学、神经科学等领域的研究中，为疾病的发生机制和治疗提供了重要的实验依据。

免疫组织化学染色试剂是一种重要的实验工具，能够实现对目标分子在组织切片中的定位和定量分析。

通过选择合适的抗体和标记物，以及优化试剂浓度和染色方法，可以获得清晰、准确的染色结果。

常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。

常用试剂有：1、0.01M(pH7.4)的磷酸盐缓冲生理盐水（PBS），稀释抗体和洗片子用；2、清洁液、纯水，洗玻片用3、多聚赖氨酸处理载玻片，防止脱片4、固定液：4%多聚甲醛；5、梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋；6、抗原修复液：枸橼酸缓冲液（pH6.0）；7、H2O2，灭活内源性过氧化物酶8、血清清蛋白（BSA）封闭液；9、显色液：根据酶来选择，如果是HRP就用DAB，如果是AKP，就用NBT/BCIP，免疫荧光则不需要10、树胶封片液一般的sp法步骤啊,具体如下：1. 烤片，68℃，20分钟,2. 常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯I 20min --二甲苯II 20 min--100%酒精I 10min --100%II 10min --95% 5min-- 80% 5min-- 70% 5min3.阻断灭活内源性过氧化物酶：3%H2O2 37℃孵育10min，PBS冲洗3X5min；4. 抗原修复:置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15－20min），自然冷却20min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min。

5. 正常羊血清工作液封闭，37℃10 min，倾去勿洗.6. 滴加一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；滴加生物素标记二抗, 37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;7. 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;8. DAB/ H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。

1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。

Triton X-100 (曲拉通X-100) 化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种优异的表面活化剂、润湿及洗涤剂。

1、在免疫组织化学(厚切片) 和免疫细胞化学中，Triton X-100 被用来做细胞破膜剂/细胞通透剂，即在细胞膜上打孔，可以溶解细胞膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆内，这样抗体就能进入内与相关的抗原结合了。

2、Triton X-100一般在阻断缓冲液中或稀释缓冲液中使用，基本不用做洗液。

使用浓度0.2%。

较厚的石蜡切片更应该应用Triton X-100，这样可以获得更好的染色背景。

3、在PBS中加入0.2%-0.5%的Triton X-100，可以使片子冲洗更充分，特别是一抗孵育后使用，可以降低背景。

做细胞爬片的免疫组化时，需要在细胞膜上打孔要用到Triton X-100，可以用0.1%Triton X-100(用0.1%柠檬酸三钠缓冲液配制)破膜。

内源生物素含量较高的组织切片做免疫组化，当一抗孵育后可以在PBS中加入0.2%-0.5%的Triton X-100进行洗涤，这样能降低背景。

0.1％浓度，4度预冷的。

作用时间为10分钟用Triton－X100就可以破膜对于抗原表达在胞浆，可以用0。

1％的triton20分钟，不要时间长,免得抗原外溢,如果是0.3%,时间放短也可以,具体的时间还要根据自己的具体情况摸一下. 免疫组化的玻片准备,一般是先用洗衣粉将玻片洗净.流水冲洗干净,泡酸48小时,然后流水冲洗,洗净,放于蒸馏水中洗三次,然后于无水酒精洗片,将玻片放置于铝饭盒中,烤箱80度烤干,冷却后用多聚或APES处理,烤干即可.1 将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中，按2*104/ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。

2 PBS清洗标本3次各1 min。

3 冰丙酮固定15 min。

4 空气干燥5min。

5 PBS清洗标本3次各2 min。

SMA抗体试剂（免疫组织化学）说明书SMA抗体试剂（免疫组织化学）说明书【产品名称】通⽤名称：SMA抗体试剂（免疫组织化学）英⽂名称：FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Smooth Muscle Actin, Clone 1A4, Ready-to-Use (Dako Omnis)【包装规格】12mL【预期⽤途】体外诊断⽤途。

在常规染⾊（如：HE染⾊）基础上进⾏免疫组织化学染⾊，为医师提供诊断的辅助信息。

SMA抗体试剂/检测试剂盒（免疫组织化学），预期与Dako Omnis全⾃动免疫组化染⾊设备配合使⽤，进⾏免疫组化（IHC）分析。

该抗体可标记福尔马林固定⽯蜡包埋(FFPE)组织中的平滑肌细胞、肌成纤维细胞和肌上⽪细胞。

其结果有助于区分平滑肌瘤、平滑肌⾁瘤（1）和多形性腺瘤（2）。

该抗体与其他相关抗体联合使⽤有助于疾病的鉴别诊断。

临床上解释任何染⾊或其缺失都需辅以使⽤恰当对照的形态学研究，并应由有资质的病理医师结合患者临床病史和其他诊断检测进⾏评价。

该抗体预期在使⽤⾮免疫组化法的常规病理学染⾊对肿瘤进⾏初步诊断的基础上使⽤。

【检验原理】胞质肌动蛋⽩属于细胞⾻架蛋⽩微丝系统中的⼀员，是哺乳动物和鸟类中表达最保守的⼀类蛋⽩。

肌动蛋⽩包含六种亚型，其氨基酸序列不同，但分⼦量均为42 kDa。

这些亚型显⽰了超过90%的总体序列同源性，但在肽链N端的18个残基中仅有50-60%的同源性。

因此N端区域是区分不同亚型的主要抗原区域（3）。

在不同的肌⾁组织中⼜有不同特异性的α亚型，如⾻骼肌α-、⼼肌α-和平滑肌α-肌动蛋⽩（4）。

β-和γ-肌动蛋⽩可能存在于肌⾁细胞以及⾝体其他⼤多数细胞类型中，包括⾮肌⾁细胞（5）。

参考Dako“免疫组化染⾊⼀般说明”或“IHC程序检测系统说明”，以获取以下信息：程序原理、所需未提供材料、储存、标本制备、染⾊程序、质量控制、故障排除、染⾊判读和⼀般局限性。

常用免疫组化试剂介绍完整版免疫组化试剂是一类用于检测细胞和组织中特定分子的试剂。

它们能够与目标分子发生特异性的结合反应，通过显色、荧光等方式实现目标分子的定位和检测。

常用的免疫组化试剂有抗体、底物、荧光染料等。

下面将详细介绍常用的免疫组化试剂。

一、抗体单克隆抗体：单克隆抗体是由单个克隆的B细胞分泌的抗体组成。

它们具有更高的特异性和一致性，适用于特定的免疫组化实验。

单克隆抗体一般通过酶联免疫吸附试验或杂交瘤技术获得。

二、底物底物是一种被特定酶催化后能够产生染色或荧光信号的化学物质。

在免疫组化实验中，常用的底物有DAB、VIP、AP、HRP等。

DAB：DAB（3,3'-二氨基联吡啶）是一种常用的免疫组化染色底物。

当DAB与过氧化物酶结合后，在特定条件下会产生棕色沉淀物，用于检测目标分子的位置。

VIP：VIP（维珍纳胶体阳离子）是一种特殊的底物，其在经过过氧化物酶催化后，形成带有阳离子电荷的胶体颗粒。

VIP用于染色后，可以形成黑色沉淀物。

AP：AP（碱性磷酸酶）是一种常用的底物，可以和特定基质反应生成可见或荧光信号。

AP基质有两种常用的类型，一种是快速红色溶液（Fast Red），另一种是紫色溶液。

HRP：HRP（过氧化物酶）是一种广泛使用的底物，在过氧化物酶的作用下可以产生明亮的荧光或染色信号。

HRP染色通常呈现为褐色或黑色。

三、荧光染料荧光染料是一种通过吸收特定波长的光线并在另一个波长下发射荧光的化合物。

免疫组化实验中常用的荧光染料有FITC、TRITC、Cy3、Cy5等。

FITC：FITC（荧光异硫氰酸酯或荧光同硫氰酸酯）是一种常用的绿色荧光染料，其在激发波长为488nm的波长下产生绿色荧光。

TRITC：TRITC（荧光异硫氰酸酯）是一种常用的红色荧光染料，其在激发波长为568nm的波长下产生红色荧光。

Cy3：Cy3是一种荧光发色团，其在激发波长为550nm的波长下产生黄绿色荧光。

Cy5：Cy5是一种荧光发色团，其在激发波长为650nm的波长下产生红色荧光。