7免疫细胞化学综合应用

免疫细胞化学染色技术在胸腹水诊断中的应用宋东明朱安峰（长春市中心医院病理科，吉林长春，130051）【摘要】目的通过借助于抗原抗体的特异性结合，达到识别组织和细胞中某些化学成分的目的，并明确其在细胞内的定位。

方法统计2011年全年间门诊、病房已出现胸腹水症状的患者经过脱落细胞学免疫化学染色技术方法处理标本。

结果采用半定量法以确定免疫反应的强度，阳性细胞数目及确定抗原存在的部位。

结论免疫细胞化学已经成为细胞学诊断最常使用的特殊诊断手段。

【关键词】免疫细胞化学；细胞学；抗原修复技术细胞学诊断主要依赖于细胞涂片常规染色检查，取决于其形态学的基本特点。

但经常会遇到一些诊断困难病例，对于细胞工作者一个极大的挑战是间皮细胞、组织细胞与癌细胞，特别是腺癌细胞的鉴别诊断，也就是胸腹水中良性间皮细胞与转移癌的诊断问题。

此时辅助诊断方法或特殊诊断技术则十分重要。

近代研究证实，免疫细胞化学（Immunocytochemistry）已经成为最常使用的特殊诊断手段。

该方法是借助于抗原抗体的特异性结合，达到识别组织和细胞中某些化学成分的目的，并能明确其在细胞内的定位。

通常将抗体做酶标记以显示颜色，即酶标技术。

目前已有多种商品化的单克隆及多克隆抗体，可用于肿瘤来源的鉴别诊断，常常能给诊断以很大帮助。

1 材料与方法1.1细胞涂片制备本文所检查的对象系我院2011年1年间门诊、病房的出现胸腹水症状的患者，由临床医师在直视或B超、X线、CT引导下进行穿刺抽取浆膜腔积液，每人送检1-2次，经高速（1500—2000r/min）离心10分钟后，撇去上清液，收集沉渣，涂抹法每次制备3张涂片，待涂片潮干时，95%酒精固定15—30分钟，最长不超过3天，经苏木素、伊红（HE）染色，中性树胶封片后，进行光学显微镜下观察。

阅片后登记在册，阳性标本归档保存，以备复查比较。

1.2免疫化学染色技术方法1.2.1涂片：各种细胞涂片、印片、微量细胞离心涂片及细胞组织微小组织片等均要求均匀，平薄，并保证足够的细胞数。

细胞（组织）化学和免疫化学染色技术细胞化学（cytochemistry）或组织化学（histochemistry），是细胞学（cytology）或组织学与生物化学（biochemistry）相结合的一门科学。

细胞化学染色（cytochemical staining）是在血细胞的原位上研究其化学成分的性质，包括蛋白、脂类、糖类、无机盐和酶等，在保持细胞形态的基础上进行化学的定位、定性及半定量的观察，是血液病形态学诊断中的一个重要手段。

细胞免疫化学（immunocytochemistry）又称免疫细胞化学或免疫组织化学（immunohistochemistry）染色，是鉴定某些细胞或组织的病态细胞（如微小巨核细胞）和白血病的重要的辅助性检验技术。

一、涂片细胞化学和免疫化学染色技术（一）细胞化学染色1.铁染色正常骨髓中存在一定量的贮存铁，以含铁血黄素的形式贮存，多分布在巨噬细胞内，称为贮存铁。

骨髓中幼红和晚幼红细胞含有铁颗粒，为细胞内铁，含内铁的细胞称为“铁粒幼细胞”，少数成熟红细胞也含有小的铁颗粒，称为“铁粒红细胞”。

以上铁质均可用普鲁士蓝反应加以显示。

（1）原理：骨髓内含铁血黄素的铁离子和幼红细胞内的铁颗粒，在盐酸环境下与亚铁氰化钾作用，生成蓝色的亚铁氰化铁沉淀（普鲁士蓝反应），定位于含铁粒的部位。

（2）试剂：铁染色液（临用时配制）：200g/L亚铁氰化钾溶液5份加浓盐酸1份混合；复染液：1g/L沙黄溶液。

（3）操作：取新鲜含骨髓小粒的骨髓涂片，于铁染色架上，滴满铁染色液；室温下染色30分钟，流水冲洗，复染液复染30秒；流水冲洗，晾干后镜检。

（4）结果判定1）细胞外铁：细胞外铁呈蓝色的颗粒状、小珠状或团块状，细胞外铁主要存在巨噬细胞胞质内，有时也见于巨噬细胞外。

“-”为涂片骨髓小粒全无蓝色反应；“+”为骨髓小粒呈浅蓝色反应或偶见少许蓝染的铁小珠；“++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的片状或弥散性阳性物；“+++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的密集小块或成片状；“++++”为骨髓小粒铁粒极多，密集成片。

病理检验技术模拟考试题与答案一、单选题（共100题，每题1分，共100分）1、尸体剖检完成后的处理，下面的方法不正确的是A、尸体剖检后不需对尸体做任何修复工作B、尸检人员在专用卫生间内淋浴C、认真清洗尸检台和尸检室，进行环境消毒D、尸体剖检后需对尸体做适当的修复工作E、进行器械消毒，并按照有关规定处理尸检污物正确答案：A2、疑似印戒细胞癌组织可选用下列哪种染色方法明确其黏液性质A、马休黄猩红蓝染色法B、Schiff阿尔辛蓝地衣红染色法C、过碘酸希夫染色法D、Jurgens甲基紫染色法E、刚果红染色法正确答案：B答案解析：Schiff阿尔辛蓝地衣红染色法用于手术标本及胃肠道上皮黏液内镜活检组织染色。

胃黏膜肠化生上皮和胃肠肿瘤的酸性黏多糖呈蓝色，中性黏多糖呈棕色。

3、关于苦味酸固定液的描述错误的是A、不能软化火棉胶B、穿透慢，组织收缩明显C、能沉淀一切蛋白质D、固定组织时间不宜超过24小时E、对脂肪和类脂无固定作用正确答案：A4、下列不是免疫组织化学染色中修复抗原的方法的是A、微波加热B、蛋白酶消化C、高压加热D、冷冻E、水浴加热正确答案：D5、关于荧光显微镜图像的记录方法，下列错误的是A、要结合形态学特征和荧光的颜色和亮度综合判断B、要及时摄影记录结果C、曝光速度要慢D、荧光显微镜可用CCD与计算机连接，可将图像存在计算机硬盘上E、暂时不观察时，应用挡板遮盖激发光正确答案：C答案解析：因紫外光对荧光淬灭作用大，因此曝光速度太慢，就不能将荧光图像拍摄下来。

6、下面的组织透明剂可作为骨组织石蜡切片透明剂的是A、水杨酸甲酯B、氯仿C、松油醇D、丁香油E、香柏油正确答案：A7、凝集素在免疫细胞化学中的应用，以下正确的是A、直接法是将凝集素直接与切片反应B、间接法是将生物素化的凝集素与切片反应后，再与ABC复合物结合C、糖一凝集素一糖法是用微量的凝集素与切片进行反应，然后与过氧化物酶标记的特异性糖基结合D、对照试验是将凝集素预先与相应的糖在室温孵育，再将此凝集素进行孵育，结果应为阳性E、凝集素法特异性差，但是灵敏度高正确答案：B8、欲显示各种酶的组织切片，应选择的固定液是A、AF液B、10％中性甲醛C、丙酮D、95％乙醇E、75％乙醇正确答案：C答案解析：丙酮的作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。

免疫组织化学技术的应用免疫组织化学技术概述免疫组织化学技术是一种利用免疫学原理进行生物分子检测和定位的技术。

它采用抗体与特定抗原结合的顺反应原理，在组织切片中检测和定位某一特定分子。

原理免疫组织化学技术利用抗体与特定抗原结合的顺反应原理，即对一种特定抗原有高度选择性的抗体与组织样品中的该抗原相结合产生可见的信号。

这种信号可以是产生光学、荧光或颜色改变等形式。

应用1.生物医学研究：免疫组织化学技术可以检测组织中特定蛋白质的分布和表达，是研究生物医学领域中蛋白质分子组学的基础技术之一。

2.临床诊断：免疫组织化学技术可以应用于肿瘤诊断、流行病学调查等领域。

通过检测某些肿瘤标志物、细胞表面分子和内分泌指标等，可以帮助医生进行正确诊断。

3.药物制剂：免疫组织化学技术可以帮助研究药物分布和作用机制。

例如，在研究心血管药物时，可以用抗体检测受体的表达和分布，从而了解药物作用机制和药效。

优点1.高度特异性：免疫组织化学技术可以准确地检测特定分子，避免了其他分子的干扰。

2.高灵敏度：可以检测极微量的分子，并精确定位其位置。

3.多样性：可以应用于不同分子种类的检测和定位，有很大的应用前景。

局限性1.抗体交叉反应：某些抗体可能对多种分子有交叉反应，导致误判。

2.样品制备：样品的制备和处理对结果产生影响，需要更加严格的标准化。

3.价格昂贵：用于免疫组织化学技术的抗体相对价格较高，加上试剂盒和设备的购买，成本较高。

结论免疫组织化学技术作为一种重要的实验室技术，具有广泛的应用前景。

这种技术可以在细胞和分子层面上全面解析生物体的结构和功能，是生物医学领域中不可或缺的技术之一。

免疫组织化学技术的操作步骤1.标本制备：首先需要采集组织样本，处理后制成组织切片。

2.抗体处理：挑选合适的抗体，经过处理（如荧光标记、酶标记等），制成特定的抗体试剂。

3.特定抗原检测：在组织切片上滴加特定抗体试剂，进行特定抗原的检测。

4.反应信号检测：根据抗体的标记方式，进行相应信号的检测。

免疫组织化学在兽医临床诊断的应用摘要:免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

随着免疫组织化学技术的不断发展和成熟，该技术已经被广泛的应用在兽医临床疾病的病原体诊断上。

免疫组织化学技术不仅能够准确地检测病原体，而且也广泛应用于病原在机体组织中的定位和动态分布特点研究、新病原的发现、活体动物中病原的检测、以及对固定组织进行回顾性研究等，也早已成为现代病理学研究手段之一。

关键词：免疫组织化学技术；兽医临床诊断；组织分布；定位正文：免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是利用免疫学的核心抗原与抗体特异性结合的原理，用标记抗体追踪抗原，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂, 如酶、金属离子、同位素等显示一定的颜色，并借助显微镜、荧光显微镜、电镜对其颜色进行观察，以达到检测抗原物的目的一门细胞化学技术。

免疫化学技术具有特异性强、敏感性性高，定位准确的优点，因此，该技术可以应用于提高临床病理诊断的准确度。

免疫组织化学技术可以在石蜡切片、冰冻切片以及细胞制品上检测组织中广泛的病原体，从而可以分析出动物体内病原在组织中的动态分布情况，这些都使得IHC在兽医临床诊断中成为了一个重要的便捷、高效精确地检测病原体的检测及辅助诊断工具。

1对特殊病原的检测张静【1】以SPF 雏鸡为研究对象，新城疫中等毒力活疫苗，人工发病，利用免疫组织化学方法中的ABC（抗生物素－生物素－过氧化物酶复合物）法来检测。

结果在实验鸡组织切片中可见到阳性染色，背景较清晰，说明实验鸡组织中含有鸡新城疫病毒。

利用免疫组织免疫法中的ABC法成功建立了人工病例，NDV抗原分布于实验鸡组织中。

王泽、夏志平等人【2】应用抗狂犬病病毒的特异性抗体及免疫组织化学方法检测接种了狂犬病病毒SRV一9毒株感染的小鼠脑组织，并对狂犬病病毒抗原进行了组织定位分析。

免疫组织化学在肿瘤诊断和治疗中的应用随着肿瘤的不断发展和进步，现代医学技术也得到了飞速的发展，其中免疫组织化学被广泛应用于肿瘤的诊断和治疗。

免疫组织化学是一种使用特异性抗体来检测和识别分子的技术，因为癌细胞在细胞膜、核糖体和其他细胞结构上具有特异性表达的蛋白质，因此这种技术可以确定癌细胞的特征和性质，从而为肿瘤的治疗和预防提供了可靠的依据。

一、免疫组织化学在肿瘤诊断中的应用免疫组织化学在肿瘤诊断中发挥着重要的作用，其最主要的用途是用于肿瘤病理学的诊断和分类。

通过对癌细胞表面和核内标志物的检测，可以明确一种癌症的类型和级别，从而为治疗提供依据。

例如，通过检测鳞状细胞癌中的角蛋白和基底细胞癌中的细胞角蛋白可以确定其类型，通过检测HER2蛋白质的表达可以确定其对激素治疗的敏感性。

此外，免疫组织化学也可以用于肿瘤的分期，例如检测Ki67和PCNA的表达可以判断肿瘤细胞的增殖指数，从而判断肿瘤的活跃程度和预后。

二、免疫组织化学在肿瘤治疗中的应用免疫组织化学在肿瘤治疗中也有着广泛的应用，主要是通过抗体治疗、免疫细胞治疗和癌症疫苗等方式进行。

目前最常用的是抗体治疗，即通过抗体对靶向分子的结合来抑制或杀死肿瘤细胞。

例如，通过单克隆抗体治疗HER2阳性的乳腺癌或腺癌。

此外，免疫细胞疗法也正在逐渐发展，这种疗法使用体内产生或外部培育的免疫细胞来抵抗肿瘤细胞，并且目前已经证实在某些肿瘤治疗中的有效性。

最后，癌症疫苗是一种通过刺激宿主免疫系统来杀死或抑制肿瘤细胞的免疫疗法，目前也在不断发展和完善。

三、免疫组织化学的局限性和发展免疫组织化学在肿瘤诊断和治疗中的应用虽然比较广泛，但其还存在一些局限性。

首先，抗体对特异性分子的识别和结合具有一定的局限性，可能无法覆盖细胞表面和核内所有的蛋白质和标志物。

其次，某些蛋白质的表达可能会影响不同治疗方案的效果，因此在肿瘤治疗中肿瘤标志物的选择非常重要。

最后，抗体治疗、免疫细胞治疗和癌症疫苗等免疫治疗的发展离不开高质量、高特异性抗体的发展及其特异性的验证，这需要不断的研究和发展。

免疫组化一，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。

在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。

免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。

直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。

目前通常选用免疫酶组化间接染色法。

三，免疫组化步骤1，切片，烤片60℃，1h；2，脱蜡及复水二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min， 75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；4，微波修复将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次；5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；6，封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体；7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；8，PBS洗涤3次，每次3min；9，滴加二抗，37℃，15-30min；10，PBS洗涤3次，每次3min；11，滴加SABC，37℃， 30min；12，PBS洗涤3次，每次5min；13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；14，DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；16，苏木素复染2min，自来水冲洗；17，脱水30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；18，树胶封片，镜检。