巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶基因的克隆和表达

第15卷第1期1999年2月中国生物化学与分子生物学报Ch inese Jou rnal of B i ochem istry and M o lecu lar B i o logyV o l.15,N o.1Feb.19993　联系人　T el:(021)643744302289,Fax:(021)64338357E2m ail:zhongyi@黄艳红:女,32岁,博士收稿日期:1997212212,修回日期:1998204201・研究简报・巨大芽孢杆菌青霉素酰化酶在枯草杆菌中的表达及其分离纯化黄艳红　袁中一3　王应睐(中国科学院上海生物化学研究所,上海200031)Expression and Pur if ica tion of the PGA gene ofB acillus m ega ter ium i n B acillus subtilisHU AN G Yanhong,YU AN Zhongyi,W AN G Y inglai(S hang hai Institu te of B ioche m istry,Ch inese A cad e my of S ciences,S hang hai　200031) Abstract　Pen icillin G acylase(PGA)gene of B acillus m eg a terium w as in serted in to the p las m id of pM A5E.coli2B.subtilis shu ttle vecto r,then the recom b inan t p las m id pM A GA w as tran sfo rm ed in to B.subtilis BCL1050.T h is is a secrete system,in w h ich PGA can be exp ressed and secreted in2 to cu ltu re m edium directly,p roviding a conven ien t m ean s of ob tain ing relatively p u re enzym e in large quan tity.A fter cu ltu ring fo r24hou rs in rich m edium,the enzym e activity reached abou t1.4 U m l.PGA exp ressed in B.subtilis BCL1050w as p u rified app rox i m ately6002fo ld by p henylala2 n ine hydrop hob ic ch rom atograp hy,amm on ia su lfate p reci p itati on,size exclu si on ch rom atograp hy and D EA E2Sep hadex A250ch rom atograp hy.T he p u rified enzym e,w ith an app rox i m ate m o lecu lar w eigh t of82kD,app eared to be hom ogeneou s judged by SD S2PA GE analysis.T he m ass ofΑandΒsubun its determ ined by SD S2PA GE w as54.95kD and21.88kD resp ectively.Key words　B acillus m eg a terium,Pen icillin acylase,Exp ressi on,B acillus subtilis,Pu rificati on 青霉素酰化酶(PGA)在医药工业起着重要的作用,它能够水解青霉素G产生62氨基青霉烷酸(62A PA)和苯乙酸,62A PA是半合成青霉素的关键中间体.该酶广泛存在于各种微生物中如真菌和细菌中.国际上对E.coli、A rth robacter v iscosus、K luy vera citrop h ila来源的PGA研究较多,对巨大芽孢杆菌(B acillus m eg a terium)来源的青霉素酰化酶研究较少,并且对它的表达研究大部分是在大肠杆菌表达系统中进行的.枯草杆菌(B acillus subtilis)作为表达系统有以下优点:(1)它能够把有功能的蛋白直接分泌到胞外;(2)非致病性;(3)没有明显的偏爱密码子.它的非致病性决定了它在食品卫生方面有广阔的应用前景.我们尝试用枯草杆菌表达系统对巨大芽孢杆菌来源的PGA进行表达研究.巨大芽孢杆菌的PGA基因克隆到大肠杆菌2枯草杆菌穿梭质粒pM A5中,再转化到枯草杆菌BCL1050中,在H p a 启动子作用下进行表达.表达产物通过苯丙氨酸2Sep haro se24B柱、Sep hacryl 2100和2250柱纯化得到了纯度达90%以上的青霉素酰化酶.1　材料与方法111　枯草杆菌质粒的抽提、感受态细胞的制备和质粒的转化　参照文献[1].112　外源基因的表达把重组表达质粒pM A GA转化到枯草杆菌BCL1050,接种单菌落于3m l LB(含Km50Λg m l),37℃培养过夜,取上述过夜菌以0105%的接种量于新鲜的LB(Km)培养液中,37℃振荡培养24 h,即可得含酶的发酵液.113　酶活力测定酶活力测定采用N IPAB方法[2]和PDAB方法[3].酶活力单位定义为每分钟产生1Λm o l62A PA 所需酶量.114　青霉素酰化酶的分离纯化苯丙氨酸2Sep haro se4B柱层析(按文献[4]和[5]方法制备苯丙氨酸2Sep haro se4B),Sep hacryl S2 100分子筛柱层析,D EA E2Sep hadex A250柱层析参照有关文献进行.2　结果与讨论211　表达载体的构建和转化通过PCR技术,从巨大芽孢杆菌CA2098菌种中获得青霉素酰化酶基因,克隆到pB luescri p t+SK 中,得到重组质粒p SKGA(513kb).p SKGA用E co R 、B am H 切下p ga,连接到N d e 、B am H 酶切的pM A5中,产生重组质粒pM A GA(919kb). pM A5是一个大肠杆菌2枯草杆菌穿梭质粒,核苷酸长度为715kb.用B am H 、E co R 把重组质粒pM A GA切开,经连接转化,筛选到只带有卡那霉素抗性的质粒pM A GA2(6115kb)(F ig.1),将pM A2 GA,pM A GA2分别转化到枯草杆菌受体菌BCL1050中,得到BCL1050(pM A GA)与BCL1050 (pM A GA2).BCL1050是一个在染色体上去除大部分蛋白酶基因的工程菌[6],外源基因能在BCL1050中得到很好的表达,并且稳定性好,BCL1050 (pM A GA)培养24h的发酵液4℃放置1周酶活力不下降.枯草杆菌质粒的转化与大肠杆菌质粒转化不同,枯草杆菌感受态转化质粒发生在生长的特殊阶段,转化效率最高的感受态是对数期后生长3h 的菌,与起始培养菌的生长率无大关系[7].212　青霉素酰化酶的表达以0105%接种量将过夜菌BCL1050 (pM A GA)接种于80m l LB培养基(含50Λg m l Km).测菌体生长曲线和产酶活力曲线.发现在24 h产酶量已趋于稳定,活力单位为018U m l.把含有pM A GA2的BCL1050过夜菌接种于新鲜的LB 中培养,与BCL1050(pM A GA)比较,发现BCL1050 (pM A GA)的菌生长较慢,但活力高.BCL1050 (pM A GA2)的菌体虽然生长快,但活力低.同时,采用不同的培养基如丰富培养基来进行发酵,发现酶活力比在LB培养基中活力高.培养24 h后LB培养基中的酶活力为018U m l,丰富培养基中的酶活力则已达114U m l.继续延长培养在LB培养基中的酶活力基本稳定而丰富培养基中的酶活力还在增加.84h后酶活力达到4U m l.提高F ig.1　Constructi on of B.subtilis exp ressi on vecto r接种量到2%和5%,发现相同时间酶活力并未因接种量增大而提高.还测定了在丰富培养基中接种量为0105%发酵液中菌体内的酶活力,1m l发酵液中菌体内的酶活力单位24h为011U m l,48h为0115U m l,68h为0114U m l,84h为011U m l,菌体内的酶活力稍有变化.发酵液中酶活力一直增长的原因可能有二:一是随着培养时间的延长,新生菌不断产生酶,有累积效应;二是大量老的菌体死亡,分解释放出菌体内残留的酶,所以酶活力一直在增加.在巨大芽孢杆菌中,PGA的产生受葡萄糖的抑制,把丰富培养基中的葡萄糖去掉,发现BCL1050(pM A GA)发酵液酶活力不仅不增高,反而下降.重组质粒pM A GA只含有PGA的结构基因,不含有它的调控基因,所以重组表达菌种BCL1050(pM A GA)中葡萄糖并未抑制PGA的产生,反而是菌体生长所需的营养成分.213　青霉素酰化酶的分离纯化在含有22%硫酸铵的磷酸缓冲液中,青霉素酰化酶与苯丙氨酸224通过疏水相互作用071中国生物化学与分子生物学报15卷而吸附,其它疏水性弱的杂蛋白则不被吸附.当硫酸铵浓度降低时,使它们之间的疏水作用减弱而解吸,PGA 被洗脱下来[5].这一纯化步骤可除去培养基中的大部分杂质,而吸附大部分酶分子.产率为81%,达到浓缩酶的作用.收集的活力峰直接加入硫酸铵使其浓度达75%饱和度,经过沉淀离心可以得到80%的酶.再通过分子筛,除去小分子和大分子的杂蛋白.最后经过D EA E 2Sep hadexA 250柱层析,在pH 715时,酶分子带负电荷,能与C l -进行交换.经过这几步的纯化,SD S 2PA GE 显示出只有两个亚基的条带(F ig .2),酶的纯化倍数提高了600倍(T ab le 1).F ig .2　SD S 2PA GE pattern of purified penicillin acylase 1:P ro tein m arkers2:Purified PGA samp le (10Λg )Table 1　Pu rificati on of pen icillin acylase from the recom b 2inan t B acillus subtilis pM A GA (BCL 1050)To tal vo lum e m l To tal p ro tein m g To talactivity U Specific activity U ・m g -1Yeild (%)Ferm entati on bro th 10001602736817501023100Phe 2Sepharo se　ch rom atography 9183173001733159381155Ammonium sulfate p reci p itati on 819431129615461888014Sephacryl S 2100163251223210991213116D EA E 2Sephadex A 250343155118141814214　青霉素酰化酶分子量的确定12%SD S 2PA GE 电泳测定蛋白质的分子量.测量和计算标准蛋白质和PGA 两亚基的相对迁移率m R (样品迁移距离染料迁移距离),以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率m R 作图,得到标准曲线,根据Α、Β亚基的相对迁移率,从标准曲线上查出它们的分子量分别为54195kD 和21188kD ,这与从PGA 基因推导出的分子量59107kD 和22188kD 基本相符.致谢:对美国D arto is 博士所提供的枯草杆菌受体菌BCL 1050和穿梭质粒pM A 5深表谢忱.References1　贾盘兴,蔡金科编著.微生物遗传学实验技术.北京:科学出版社(J ia Panxin ,Cai J inke .L aboratory M anual of M icrobiology Ge 2netics.Beijing :Science P ress ),1992:130～1372　上海第三制药厂,一种快速简便的测量青霉素酰化酶的方法.医药工业(Shanghai T h ird Pharm acial Facto ry .M ethod to deter 2m ine penicillin acylase fast and conviniently .M ed Ind ),1978,7:22～243　Balasingham K ,W arburton D ,D unnill P ,L illy M D .T he iso la 2ti on and k inetics of penicillin am idase from E scherich ia coli .B ioch i m B iop hy s A cta ,1972,276:250～2564　徐俊,祁俊,袁中一.共价法固定化胰蛋白酶的研究.生物工程学报(Xu Jun ,Q i Jun ,Yuan Zhongyi .I mmobilizati on of T ryp sin onSepharo se derivatives using vari ous covalent bonding m ethods .Ch in J B iotechnol ),1993,9(1):69～735　费俭,顾秋.疏水层析法纯化青霉素酰化酶.生物化学与生物物理学报(Fei J ian ,Gu Q iu .Study on hydrophobic ch rom atogra 2phy of B .M eg 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2003 年6 月 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities June 2003 文章编号:1003-9015(2003)03-0266-06重组枯草芽孢杆菌生产青霉素G酰化酶发酵条件的研究徐志南, 陈秀奇, 陈新爱, 岑沛霖(浙江大学化学工程与生物工程学系, 浙江杭州 310027)摘要: 对产青霉素G酰化酶的温度诱导型重组枯草芽孢杆菌发酵条件进行了研究。

结果表明，培养基的最佳氮源和碳源组成为：35g⋅L−1牛肉膏、3g⋅L−1葡萄糖和6g⋅L−1淀粉；最佳诱导时机是细胞对数生长的中后期，诱导前应将pH调节至中性；最佳诱导条件为升高温度至50℃并维持4min；随后将温度降低到34℃进行重组蛋白的表达。

在上述条件下，PGA的表达水平可以达到5.8U⋅mL−1。

SDS-PAGE电泳分析表明该重组菌能够将绝大部分表达的PGA分泌到细胞外，而且表达的PGA蛋白占有高比例(≥90%)。

关键词：　青霉素G酰化酶; 温度诱导; 重组枯草杆菌; 发酵条件中图分类号：TQ920.1; Q55 文献标识码：A1 前言β-内酰胺类抗生素及其中间体的生产正经历一场变革，传统的化学转化工艺正在为酶促反应所取代[1]。

青霉素G酰化酶(Penicillin G acylase,E C 3.5.1.11,PGA)是β-内酰胺类抗生素工业中最为关键的酶之一，既能催化青霉素G水解成为6-氨基青霉烷酸和苯乙酸，又能催化头孢霉素C生产7-氨基头孢烯酸，还能用于高效催化半合成头孢菌素的合成。

工业化生产PGA主要采用大肠杆菌和巨大芽孢杆菌，虽然经过复杂的诱变育种，仍存在产酶水平较低、变温发酵和需要苯乙酸诱导等缺点[2]。

目前，国内外研究者都在利用基因重组技术将PGA基因克隆并在大肠杆菌或芽孢杆菌中表达，以期大幅度提高PGA的产量和简化生产工艺[3~6]。

与重组大肠杆菌系统相比，重组枯草杆菌系统具有较强的表达蛋白后加工能力，产物能够分泌到胞外，从而有利于目标蛋白的分离和纯化[7]。

引言蛋白质是重要的生物大分子，蛋白质种类繁多，功能各异。

生物体内的许多蛋白质的含量都非常少，为了大量获得具有某种特定用途的蛋白质，可以通过基因克隆将目的蛋白的核酸序列导入某种宿主细胞中，使宿主细胞大量合成该种蛋白质。

这种将基因与合适质粒载体重组后转入宿主细胞以大量合成蛋白质的技术称为蛋白质表达。

蛋白质表达在生物技术、食品、医药卫生、养殖和环保等行业均有广泛的应用。

蛋白质表达技术所涉及的各个要素（表达载体、宿主、启动子和信号肽等）可以统称为蛋白质表达系统。

蛋白质表达系统的常用表达宿主包括属于真核生物的酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物细胞以及属于原核生物的大肠杆菌、芽孢杆菌和链霉菌。

其中大肠杆菌是被研究最早、最深入、应用最广的。

巨大芽孢杆菌作为革兰氏阳性杆菌，其无内毒素和胞外蛋白酶，能高效地将蛋白质分泌到胞外，在蛋白表达方面具有较大的优势。

本文介绍了巨大芽孢杆菌的生理特征和表达系统各关键元素的研究现状，为进一步开展巨大芽孢杆菌表达系统及其应用的研究提供参考。

　一、巨大芽孢杆菌概述巨大芽孢杆菌（Priestia megaterium）是革兰氏阳性杆菌，属于需氧芽孢杆菌。

如图1所示，它的体积约是大肠杆菌的100倍，由此在1884年被命名为巨大芽孢杆菌[1]。

它广泛存在于植物、土壤、海水和人类口腔等各种环境中[2]。

它可以利用的碳源包括单糖、二糖、多糖、甘油以及甘蔗糖蜜等，基于其体积大、高渗透耐受性、可适应多种环境和利用多种碳源的特点，巨大芽孢杆菌可作为蛋白质和细胞各组成部分的生产宿主或载体[3]。

巨大芽孢杆菌是革兰氏阳性杆菌，缺乏外细胞膜，则巨大芽孢杆菌表达系统研究进展综述◎　姚婉议　刘 欣　杨晓雯　林伯坤*　邹堂斌*（广东医科大学公共卫生学院东莞市环境医学重点实验室，广东　东莞　523808）【摘　要】蛋白质表达系统是大量制备目的蛋白质的主要技术手段。

巨大芽孢杆菌不产生内毒素和胞外蛋白酶，能高效地分泌蛋白质到胞外，具有体积大、高渗透耐受性、环境适应性强、可利用多种碳源以及可以稳定地维持各种质粒载体等特点，是理想的蛋白质表达系统宿主，目前已得到较系统地开发，用于生产重组蛋白质以及其他大分子和小分子。