流感病毒核酸检测作业指导书

一、目的确保H5N1禽流感疑似病例标本得到有效的检测，为禽流感H5N1感染提供可靠的实验室诊断依据。

国家流感中心实验室按照规定方法对疑似H5N1禽流感感染病例的标本进行处理和检测，使疑似禽流感病例标本的处理和检测得到有效的控制。

保证检测结果的快速性和可靠性，同时确保样本不被污染和污染环境。

二、范围适用中国国家流感中心操作人员进行疑似H5N1禽流感病例标本的检测。

三、定义核酸序列依赖性扩增（Nuclear acid sequence-based amplification ，NASBA ）检测技术是一项快速等温核酸扩增并能实时观测结果的检测技术，该技术的检测反应有赖于AMV 逆转录酶、噬菌体T7 RNA 多聚酶、核糖核酸酶H 、两种特别设计的特异性寡核苷酸引物和分子信标探针共同协作而完成。

如下是在检测结果分析中涉及到的几个概念：1．样品检测信号值（WT signal ）：在扩增过程中分子信标探针与靶基因发生特异性结合后，产生荧光信号的荧光信号被收集经软件转换后的强度值，即WT signal 。

2．阈值（threshold ）：在NASBA 反应过程中会产生荧光信号，阈值是判断阴性或阳性结果的荧光信号界线值，样本荧光信号≥阈值者为阳性，反之为阴性。

图1：NASBA 检测标准曲线Time WT Signal标准操作规程（SOP H5N1 NASBA四、背景本SOP是为了疑似H5N1禽流感感染的诊断而制定，确保禽流感病例诊断的快速性和可靠性，同时要求实验操作过程中标本不被污染或污染环境。

五、程序（一）生物安全要求标本裂解在BLS-3实验室，其余操作部分在具有规范分区（体系配制区、核酸提取区和检测分析区）的BSL-2级实验室进行并遵守相应生物安全规定。

详细生物安全防护参见“生物安全个人防护SOP”。

（二）材料及仪器1．梅里埃公司 Nulisens EasyQ 检测分析系统。

2．孵育器3．离心机4．移液器：规格分别为0.5~10μL、20~200μL和100~1000μL各一支。

流感病毒的核酸检测技术操作规范（一）流感病毒Conventional one step RT-PCR 检测应用核酸检测技术为疑似流感病毒感染病例诊断提供依据，为流感病毒的型别和亚型的鉴定提供技术方法。

按照规定方法对标本和病毒进行处理和检测，保证检测结果的快速性和可靠性，同时确保样本不被污染和污染环境。

1.生物安全要求实验室操作应当遵守生物安全实验室的有关生物安全的规定。

季节性流感病毒生物安全二级，疑似高致病禽流感病例标本需在BSL-2级实验室操作，采取BSL-3级防护；核酸提取及加RNA模板可在BSL-2级实验室生物安全柜内操作；PCR反应体系配制在体系配制区；PCR产物检测在电泳区操作。

2.主要试剂（所列厂家仅用作举例，实验室可自行选择）注：*引物序列详见表1.3.设备（1）BSL-2生物安全柜；（2）可调转速最大至140rmp的离心机；（3）涡旋混合器；（4）10p L，1pL，2pL，10^L量程移液器；（5）PCR 仪；（6）电泳槽和电泳仪；（7）凝胶成像系统。

4.质量控制（1）实验检测所需核酸提取试剂和一步法RT-PCR检测试剂不同批号之间需进行灵敏度的检测。

同一试剂不同批次的灵敏度的检测至少半年一次。

（2）实验检测除待检标本外还需设置阳性对照及阴性对照，阳性对照核酸事先应稀释分装，经Real-time PCR检测Ct值在30以内；阴性对照为DEPC处理水Real-time PCR检测Ct值为0.5.实验步骤（1）实验注意事项由于PCR检测灵敏度高，因此必须采取一些预防污染的措施，以避免假阳性结果的出现，建议采取如下方法：a）核酸提取、反应液配制及检测反应进行应在独立的房间中进行。

b）不同的房间配制相应的专用耗材和设备，不可交叉使用。

c）配制反应液时，应穿着干净的实验服，带无粉手套进行操作。

d）实验操作期间，如怀疑有污染，请更换手套。

e）试剂及反应管的盖子应尽可能盖上。

（2）设备准备操作台的表面、枪头和离心机应保持洁净，可用5%漂白剂或其它清洁剂，如可以去除DNA酶的试剂擦拭台面，以减少核酸污染的风险。

高致病性禽流感检测诊断作业指导书高致病性禽流感检测诊断作业指导书一、高致病性禽流感血凝抑制（HI）试验1.适用范围该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。

可用于流感病毒分离株HA亚型的鉴定，也可用来检测禽血清中是否有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体。

HI试验可用来鉴定所有的流感病毒分离株，可用来检测禽血清中的感染或免疫抗体。

2.检测试剂配置2.1 阿氏（Alsevers）液配制称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌，4℃保存备用。

2.2 10%和1%鸡红细胞液的制备2.2.1 采血：用注射器吸取阿氏液约1mL，取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约2～4mL，与阿氏液混合，放入装10mL阿氏液的离心管中混匀。

2.2.2 洗涤鸡红细胞：将离心管中的血液经1500～1800 r/min 离心8分钟，弃上清液，沉淀物加入阿氏液，轻轻混合，再经1500～1800 r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，加入阿氏液20 mL，轻轻混合成红细胞悬液，4℃保存备用，不超过5天。

2.2.3 10%鸡红细胞悬液：取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离心管中离心1500～1800 r/min 8分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红细胞体积(mL)，加入9倍体积(mL)的生理盐水，用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞混合均匀。

2.2.4 1%鸡红细胞液：取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1mL，加入9mL 生理盐水，混合均匀即可。

3.检测步骤3.1 在微量反应板的1孔～12孔均加入0.025mL PBS，换滴头。

3.2吸取0.025mL病毒悬液（如感染性鸡胚尿囊液）加入第l孔，混匀。

流感病毒核酸检测标本采集、送检、处理流程1. 引言流感病毒核酸检测是一种常用的检测方法，可以用于流感的早期诊断和监测。

本文档旨在提供流感病毒核酸检测标本采集、送检和处理的详细流程，以确保准确、及时和安全的检测结果。

2. 标本采集标本采集是流感病毒核酸检测的第一步，正确的采集方法对于后续检测结果至关重要。

以下是标本采集的步骤：1. 选择合适的采集时间：流感病毒在病程初期时最容易检测到，因此最好在症状开始后的48小时内采集标本。

2. 选择合适的采集方法：常见的标本采集方法包括咽拭子采集、鼻拭子采集和咳痰样本采集。

根据临床需要和采集者的经验选择合适的采集方法。

3. 采集过程：采集者应使用无菌手套，并根据操作要求进行准确的采集。

在采集过程中，要避免其他污染源的接触，确保标本的纯净度。

4. 标本保存和运输：采集后，标本应立即储存于适当的中，并在规定的时间内送往实验室进行处理。

3. 送检送检是将采集的标本送往实验室进行核酸检测的步骤。

以下是送检的流程：1. 填写申请单：在送检前，检测人员应填写标本的相关信息，如姓名、性别、年龄等，并注明流感病毒核酸检测的要求。

2. 标本包装：将已采集的标本放入密封袋中，确保袋子密封良好，避免标本在运输过程中的泄漏。

3. 运输方式：根据实验室的要求，选择适当的运输方式。

一般情况下，标本应使用专用的运送盒，采取冷链运输以确保标本的质量。

4. 相关文件：将申请单和相关的送检文件一同放入密封袋中，以便实验室对标本的追踪和管理。

4. 处理流程实验室收到标本后，需要进行一系列处理步骤以获得准确的核酸检测结果。

以下是处理流程的主要步骤：1. 样本接收：实验室收到标本后，应及时确认标本的完整性和相关信息的准确性，并记录相关数据。

2. 样本处理：对标本进行必要的预处理，如离心、去除细胞和红细胞沉淀等，以提取标本中的核酸。

3. 核酸提取：使用合适的提取试剂和方法，从标本中提取核酸。

在提取过程中，应采取相关措施以防止实验室内的交叉污染。

甲乙流操作简易流程甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂（胶体金法）操作简易流程【检验原理】本品利用免疫层析技术，采用双抗体夹心法检测甲型和乙型流感病毒抗原。

【储存条件及有效期】4℃～30℃保存，产品有效期24个月。

铝箔袋开封后，测试卡应在1小时内尽快使用。

样本提取液使用后应立即加盖，并置于阴凉处或冰箱内，请在有效期内使用。

【样本要求】采集样本的无菌拭子推荐使用PP（聚丙烯）杆的聚酯海绵拭子。

1. 2.2.标本采集后应尽快采用病毒采样液或本试剂盒提供的样本提取液进行处理。

如不能立即处理，标本应立即置于干燥、消毒并严格密封的塑料管内储存，2℃～8℃下可保存8小时，-70℃可长期保存。

【检验方法的局限性】1. 本试剂仅供检测鼻咽拭子和口咽拭子的呼吸道分泌物。

2. 测试的准确性取决于采集样本过程，样本采集不当、样本储存不当、样本不新鲜或样本反复冻融均会影响检测结果。

3. 采集的样本若存在个别药物如高浓度的非处方药和处方药（鼻腔喷雾剂）会干扰结果。

若结果可疑，请重新测试。

5. 本试剂的检测结果仅供临床参考，不得作为临床诊治的唯一依据，对患者的临床管理应结合其症状/体征、病史、其它实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

6. 受抗原类检测试剂方法学的限制，其分析灵敏度普遍较核酸类试剂低，故实验人员应对阴性结果给予更多的关注，需结合其它检测结果综合判断，建议对有疑问的阴性结果采用核酸检测或病毒培养鉴定方法进行复核。

7. 对甲型流感病毒的检测，建议对阳性结果进一步实验以确认甲型流感病毒的亚型，并向当地公共卫生预防机构咨询协商处理。

8. 有关假阴性结果的可能性分析：①不合理的样本采集、转运及处理、样本中病毒滴度过低均有可能导致假阴性结果。

②病毒基因变异可能导致抗原决定簇的改变，从而造成假阴性结果，使用单克隆抗体的试剂更易发生此类情况。

③最适样本类型以及感染后的最佳采样时间（病毒滴度峰值）未经验证，因此，在同一患者分次、多部位采集样本可能会避免假阴性。

医院人感染H7N9禽流感病毒核酸检测标准操作程序一、目的确保人感染H7N9禽流感病毒核酸检测过程标准化、规范化，降低人为不规范操作对检测结果造成的影响，保证结果的准确性和可重复性。

二、适用范围医疗机构临床基因扩增检验实验室按照《关于医院开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测有关工作的通知》（卫办医政函〔2013〕383号）和《关于做好医疗机构人感染H7N9禽流感检测试剂供给保障工作的通知》（卫发明电〔2013〕29号）有关要求，使用国家疾病预防控制中心制备或商品化试剂盒开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测工作。

三、样本采集、运送和保存尽量采集病例发病早期的呼吸道样本(上呼吸道样本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液, 下呼吸道样本包括痰液、气管吸取物、肺洗液、肺组织等)。

可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高检出率。

患者有下呼吸道样本时，应优先采集。

根据试剂说明书对样本采集方法有关要求，制订样本采集标准操作程序（SOP），并组织样本采集人员进行培训及考核。

样本的采集应当严格按照SOP进行。

样本采集后，按照《人间传染病的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒的相关规定进行包装，用密封容器立即送往实验室。

若气温高时，需放入冰块降温。

样本抵达实验室后，应尽快进行检测，24小时内能检测的样本可置于2～8℃暂时保存，24小时内无法检测的样本则应置于≤-70℃状态保存。

如无-70℃保存条件时，可于-20℃冰箱暂存。

样本避免反复冻融。

样本采集、处理、运输及保存不当时，可因病毒RNA降解出现假阴性结果，也可因为样本“污染”出现假阳性结果。

四、PCR检测（一）样本处理样本的核酸提取应当在样本处理区进行。

按所采用的商品化试剂盒说明书要求，取适量待检样本、阳性及阴性对照进行核酸提取。

样本应尽可能新鲜，提取过程应严防RNA酶污染及操作不当导致的RNA降解。

提取过程如涉及离心步骤，应采用低温冷冻离心机；在生物安全柜内进行加样、提取过程中，为防止RNA降解，可将试管架置于托盘内平铺的碎冰上。

流感病毒核酸检测—标本运输
概述
本文档旨在介绍流感病毒核酸检测标本的正确运输方法。

标本运输的合理性和规范性对于确保检测结果的准确性至关重要。

标本选择
在进行流感病毒核酸检测标本运输前，应首先选择合适的标本类型。

一般而言，下呼吸道标本（如咽拭子、鼻拭子、痰液等）是流感病毒核酸检测的常用标本。

标本采集
标本采集过程中，务必注意以下要点：
- 使用无菌采集工具进行标本采集；
- 遵循相关标本采集操作规范，确保采集到足够的标本量；
- 避免标本污染，确保标本的纯净度。

标本包装
在标本运输过程中，正确的包装是保证标本完整性和安全性的关键。

- 使用合适的，如密封的塑料袋或标本收集管；
- 标记标本信息，包括患者姓名、采集日期和时间等；
- 在包装中添加吸收剂，以保持标本的湿润状态。

标本运输
标本运输的目的是确保标本在运输过程中的稳定性和安全性。

- 使用适当的运输，如特制冷藏盒或冰袋；
- 保持适当的温度，根据标本类型选择合适的运输温度，如冷藏运输或干冰运输；
- 注意防止标本的震动和碰撞，减少标本破损的风险。

运输信息记录
在标本运输过程中，记录运输信息是非常重要的。

- 记录标本的运输起始时间和截止时间；
- 记录标本的运输温度，确保温度要符合标本运输要求；
- 记录每个运输阶段的标本位置，以便跟踪运输进展。

结束语
流感病毒核酸检测标本的正确运输过程对于确保检测结果的准
确性至关重要。

请在进行标本运输时，遵循本文档所述的正确方法，确保标本完整性和安全性，并记录相关信息以便跟踪运输进展。

甲型乙型流感病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）操作规程1 目的：规范操作流程，确保检测结果的准确性可靠性。

2 范围：甲型/乙型流感病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）3 操作人：甲型/乙型流感病毒核酸检测人员对此规程负责4 内容：4.1 核对本次实验所有标本与申请单对应的编号，统计本次实验标本总数，确定所需实际量。

实际检测数量为所需检测样本数量和阴阳对照品总和。

4.2 试剂准备：4.2.1 进入试剂准备区，更换本区实验服和实验鞋，戴上手套、口罩。

4.2.2 打开照明灯，从冰箱中取出本次实验所需试剂。

4.2.3 打开超净工作台，在废液缸中加入新鲜配置的10%的次氯酸钠溶液。

4.2.4 取出本次实验所需耗材，如离心管、离心管架、吸头。

将试剂盒中的核酸扩增反应液、酶混合液、检测液、阳性对照、空白对照、DNA提取液取出，置于离心管架上。

待室温溶解后，瞬时离心，备用。

4.2.5 根据样本量计算需准备检测试剂人份数N（N=样本数+阳性对照+空白对照）。

4.2.6 按比例（核酸扩增反应液7.5μl/人份+酶混合液5μl/人份+甲型/乙型流感病毒反应液4μl/人份+去RNA酶水 3.5μl/人份）将各组分在离心管中混匀后瞬时离心，配置成PCR-mix，并按20μl/管依次分装到对应编号PCR八连管中。

4.2.7 将分装好的PCR-mix盖上PCR板盖，放到传递窗，收拾好试验台，将垃圾桶内的废弃物丢弃到医疗垃圾桶中并用10%的次氯酸钠溶液清洗干净，将移液器调回最大量程，换下本区工作服。

4.3 样本处理：4.3.1 进入样本处理区，更换本区实验服和实验鞋，戴上手套、口罩。

4.3.2 开启生物安全柜照明灯，将样本、试剂、分装好的PCR-mix放入生物安全柜内，在废液缸中加入新鲜配置的10%的次氯酸钠溶液。

4.3.3 取200μl的待测样本、阳性对照、弱阳性对照和空白对照用病毒核酸提取试剂盒提取核酸。

本试剂盒的阳性对照、弱阳性对照、空白对照参与提取，用于对环境的监控和试剂的质控。