9.流感病毒的快速检测方法
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流感试题1.关于流感病毒分型描述正确的是:AA.根据病毒粒核蛋白(NP)和膜蛋白(MP)抗原特性及其基因特性不同,对流感病毒进行分型。
B.流感病毒分为甲,乙,丙三型。
C.由于都是流感病毒,各型流感病毒可以在一个房间内进行隔离。
D.甲型病毒易发生变异,常引起流行,乙型病毒变型缓慢,流行比较局限,因此,不必重视乙型流感。
2.关于流感的传染源和传染期描述正确的有:DA.流感患者和隐性感染者是主要传染源。
B.从潜伏期末到发病的急性期都有传染性。
C.一般来讲,不用退热药物体温自行恢复正常后24小时已没有传染性。
D.以上都正确。
3.关于流感的主要临床表现以下描述不正确的有:DA.主要表现为发热、头痛、肌痛和全身不适起病,体温可达39-40℃;B.可有畏寒、寒战,多伴全身肌肉关节酸痛、乏力、食欲减退等全身症状,常有咽喉痛、干咳,可有鼻塞、流涕、胸骨后不适等;C.部分以呕吐、腹痛、腹泻为特点,常见于感染乙型流感的儿童;D.流感和普通感冒一样,不会引起并发症,预后良好。
4.重症流感的高危人群有:DA.年龄<5岁的儿童和年龄≥65岁的老年人;B.伴有以下疾病或状况者:慢性呼吸系统疾病、心血管系统疾病(高血压除外)、肾病、肝病、血液系统疾病、神经系统及神经肌肉疾病、代谢及内分泌系统疾病、免疫功能抑制(包括应用免疫抑制剂或HIV感染等致免疫功能低下);C.肥胖者[体重指数(body mass index,BMI)大于30,BMI=体重(kg)/身高 (m)2]和任何阶段的妊娠期妇女;D.以上都正确。
5.流感最常见的并发症是:AA.肺炎B.心脏损害C.肌炎和横纹肌溶解综合征D.神经系统损伤6.以下病原学检测方法哪种不能用于流感的确诊:CA.从患者呼吸道标本中分离和鉴定到流感病毒。
B.以RT-PCR(最好采用real-time RT-PCR)法检测呼吸道标本(咽拭子、鼻拭子、鼻咽或气管抽取物、痰)中的流感病毒核酸。
C.快速抗原检测方法可采用胶体金和免疫荧光法。
甲型流感病毒感染病毒检测的方法有哪些?甲型流感是一种由甲型流感病毒引起的呼吸道传染病。
与其他呼吸道感染相比,甲型流感的病毒传播能力较强,而且症状也比较严重。
在预防、治疗和后期恢复中,正确的检测方法是非常重要的。
本文将介绍甲型流感病毒感染的检测方法以及预防、治疗和后期恢复的注意事项。
甲型流感病毒感染的检测方法1.核酸检测(RT-PCR):核酸检测是目前甲型流感病毒感染的主要检测方法。
这种方法通过采集患者的呼吸道标本,如咽拭子、鼻咽拭子或痰液,提取其中的病毒核酸,然后利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术进行检测。
核酸检测的优点是准确度高,能够检测出病毒的存在,但需要在实验室条件下进行,耗时较长。
2.快速抗原检测(Rapid Antigen Test):快速抗原检测是一种简便、迅速的甲型流感病毒感染检测方法。
该方法通过检测标本中的特定病毒抗原,可以在数分钟内快速筛查出感染情况。
然而,与核酸检测相比,快速抗原检测的准确性略低,有时会出现假阴性结果。
因此,如果快速抗原检测结果为阴性,但临床症状明显,仍然需要进行核酸检测以排除感染。
3.血清学检测(Serologic Test):血清学检测通过检测患者血液中的特定抗体来判断是否感染甲型流感病毒。
这种检测方法主要用于疫情调查和流行病学研究,对于早期感染的诊断准确性较低。
以上三种检测方法各有优劣,医生会根据病情和实际需要选择合适的方法进行检测。
预防甲型流感病毒感染的注意事项预防甲型流感病毒感染是非常重要的,可以采取以下措施:1.接种疫苗:甲型流感病毒感染的最有效预防方法是接种相关的流感疫苗。
每年秋季接种疫苗可以有效提高免疫力,减少感染的风险。
接种疫苗还可以降低患者的病情严重程度,减少并发症的发生。
2.保持良好的个人卫生:勤洗手、使用洗手液消毒、避免接触口鼻眼等黏膜部位,是预防病毒传播的简单有效措施。
此外,尽量避免与感染者密切接触,特别是在流感高发季节。
3.注意健康状况:保持良好的生活习惯,均衡饮食,增强体质,提高免疫力,可以降低感染甲型流感病毒的风险。
甲型(H1N1)流感病毒实验室检测技术方案(试行)广州健仑生物科技有限公司整理本方案旨在为全国流感监测网络实验室提供甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案,不用作商业活动或赢利目的。
一、标本的采集种类和要求1、推荐采集的呼吸道标本种类疾病发病后应尽快采集如下标本:鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。
气管插管的病人也应收集气管吸取物。
标本应置于无菌病毒采样液,并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃(冰箱),并马上送至实验室。
(临床样品采集人员及实验室检测人员的感染控制指导请见相关文件。
)采样同时填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单。
(附表1)2、拭子的选择标本应使用头部为合成纤维的拭子(例如,聚酯纤维),用铝或塑料做柄。
不推荐棉拭子和木柄。
标本采集管应包含3毫升病毒采样液(含有蛋白质稳定剂,阻止细菌和真菌生长的抗生素,缓冲液)3、临床标本储存要求保存在4℃(不能超过4天)或者-70℃或-70℃以下。
有条件的实验室均应保存在-70℃或-70℃以下。
不应保存在-20℃。
4、标本的分装处理标本送至实验室后,立即进行处理,避免反复冻融。
将原始标本分为三份,一份用于核酸检测,一份用于病毒分离,一份保存待复核。
5、标本的运输疑似人感染甲型H1N1感染病例列为 A类,用UN2814包装运输。
填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单(附表2)。
二、核酸检测基于PCR原理的核酸检测方法是一种快速有效的诊断方法,在突发传染病应急工作中发挥了巨大作用。
1、基于real-time RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒(引物和探针序列为美国CDC设计):4月29日WHO网站上公布了美国CDC设计的针对此次甲型H1N1流感病毒的real-time RT-PCR引物和探针,此实验用于检测疑似甲型H1N1流感病例的呼吸道样本, 因此,用此real-time RT-PCR的方法,建议首先筛选甲型流感病毒并排除季节性流感病毒和H5N1禽流感病毒。
1.流感病毒是如何进入人体致病的?当人体通过呼吸道吸入含有流感病毒的飞沫或尘埃后,病毒直接侵犯呼吸道的纤毛状上皮细胞,并在纤毛状上皮细胞内复制(生长)繁殖,致使纤毛状上皮细胞造成变性坏死、脱落外,病毒还可向下侵犯气管、支气管、直至肺泡,造成粘膜下层出现出血、水肿等病理变化。
当病毒侵犯纤毛状上皮细胞后形成变性、坏死、脱落后,此时机体就可表现出流感的呼吸道症状,如出现粘膜下层出血、水肿,肺泡有纤维蛋白渗出等病理改变,患者会在出现流感呼吸道症状的基础上,再出现肺炎的临床表现。
2。
流感症状表现与流感病毒变异有什么关系?流感症状表现轻、重与流感病毒变异有关系,流感病毒主要分甲、乙、丙三型,其中乙、丙型病毒相对较稳定,甲型流感病毒较活跃,易通过病毒本身的神经氨酸酶和血凝素改变而出现变异并产生一种新的甲型流感病毒亚型。
一种新的甲型流感病毒重组后,常会表现出传播能力强,致病性较强等特征,另一方面,作为人群来讲,体内原有的抗流感免疫力已经不起作用,作为容易感染流感新甲型病毒亚型的人群,如一旦受到传染和感染后,病人所表现出的症状与未发生病毒变异期间感染后临床表现不一样,前者可表现出症状典型,婴幼儿体弱多病,老年人可表现症状重,并发肺炎等相对高,而后者则以类似上呼吸道感染的病人或不典型流感病人多见。
3。
婴幼儿与老年人患流感的症状表现有什么特点?后果如何?婴幼儿和老年人与其他人群尤其青壮年相比,表现在机体免疫和抗病能力,室外环境适应能力不及青壮年;这类人群多数以居室内活动为主,一旦感染流感病毒病毒后,所表现出来的症状和体征较重,后果也相对较青壮年重,主要表现为以下特色与后果:1、症状相对典型,可表现为高热不退、咳嗽明显、病情可持续发展,严重者可出现呼吸急促,紫绀等。
2、易发生肺炎型流感。
发病后易发生肺炎性流感,患者可在病后1-2天病情加重,出现持续高热,剧烈咳嗽、血性痰,继后出现呼吸急促、肺部炎症表现,X光检查可显示肺部炎症阴影.如治疗不及时,病情继续发展或严重者可导致因心血管功能不全或肺水肿而死亡.4.流感发病的临床表现有哪些特点?流感病毒感染的临床表现随病毒株,人群年龄,生理状态,既往史不同而异,可表现出不显性感染,显性感染,甚至死亡。
流感诊断标准流感,又称为流行性感冒,是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。
流感病毒主要分为甲型和乙型两种,其中甲型流感病毒又分为H1N1、H3N2等亚型。
流感的传播速度快,易引起大范围的流行,给人们的生活和工作带来了不小的困扰。
因此,及时准确地诊断流感对于控制疫情的蔓延至关重要。
本文将介绍流感的诊断标准,希望能对大家有所帮助。
首先,流感的临床表现是诊断的重要依据之一。
流感患者常表现为突然发热、头痛、肌肉疼痛、乏力、咽痛、干咳等症状。
与普通感冒相比,流感症状较为剧烈,且病程较短。
在流感高发季节,出现上述症状的患者,应高度怀疑患有流感。
其次,实验室检查是流感诊断的重要手段之一。
目前,常用的实验室检查方法包括病毒培养、免疫荧光抗体检测、快速抗原检测和核酸检测等。
这些检查方法可以帮助医生明确患者是否感染了流感病毒,对于流感的早期诊断和治疗具有重要意义。
此外,流感的流行病学调查也是诊断的重要依据之一。
当某一地区出现流感疫情时,医生可以通过流行病学调查,了解患者的病史、接触史和病毒的传播途径,从而及时采取控制措施,遏制疫情的蔓延。
最后,临床医生的临床经验和专业知识也是流感诊断的重要依据之一。
临床医生应结合患者的临床表现、实验室检查结果和流行病学调查,进行综合分析,做出准确的诊断。
同时,医生还应根据患者的病情,选择合适的治疗方案,提高治疗效果,减少并发症的发生。
综上所述,流感的诊断标准主要包括临床表现、实验室检查、流行病学调查和临床医生的临床经验和专业知识。
只有全面准确地掌握了这些诊断标准,我们才能及时发现和诊断流感,采取有效的控制措施,遏制疫情的蔓延,保障人民的身体健康。
希望本文对大家有所帮助,谢谢阅读。
流感病毒的快速检测方法一、RT-PCR快速诊断方法(一)生物安全要求(二)病毒核酸提取(三)RT-PCR(四)PCR 产物纯化(五)流感病毒RT-PCR检测引物二、免疫荧光方法检测流感病毒(一)原理(二)标本处理(三)间接免疫荧光法(四)结果判断三、实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)快速诊断检测(一)基本原理(二)实验试剂(三)实验步骤四、快速诊断试剂盒流感的快速检测方法,与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。
因此常用于流感暴发时早期病原学检测用。
流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。
这里介绍RT-PCR、Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。
无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。
一、RT-PCR快速诊断方法核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法,即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。
本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应(PCR)。
流感病毒的基因组是负链RNA,在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA 互补的DNA,即为cDNA。
逆转录酶(RT)就是用于合成cDNA的多聚酶,因此,扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。
RT-PCR需要一对型别特异引物,四种脱氧核苷酸(dNTPs),RNA模板,逆转录酶及Taq DNA 多聚酶;首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA,然后再进行聚合酶链反应经25~30个循环,使DNA产物达到倍增的效果。
(一)生物安全要求生物安全级别与个人防护要求:生物安全二级实验室,防护要求与二级实验室的要求相同。
并应遵守相应的生物安全规定。
进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时可以在生物安全二级实验室里进行,核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。
(二)病毒核酸提取1. 实验材料及仪器(1) QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit(Catalog# 74104)(2) β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)(3) 70% 乙醇(4) 无菌1.5ml 离心管(5) 10μl、20μl、200μl、1000μl加样器和枪头(6) 可调14K微型离心机(7) 旋转混合器2. 操作步骤(1) 取1支无菌、无RNA酶的1.5ml Eppendorf管,加入500μl RLT。
禽流感试题及答案一、单项选择题1. 禽流感是由哪种病毒引起的?A. 冠状病毒B. 流感病毒C. 腺病毒D. 疱疹病毒答案:B2. 禽流感病毒属于哪一类病毒?A. DNA病毒B. RNA病毒C. 逆转录病毒D. 朊病毒答案:B3. 禽流感病毒的传播途径主要包括哪些?A. 空气传播B. 食物传播C. 接触传播D. 以上都是答案:D4. 禽流感病毒对哪些动物具有感染性?A. 仅对人类B. 仅对鸟类C. 对人类和多种鸟类D. 对人类和部分哺乳动物答案:C5. 禽流感的典型症状包括以下哪些?A. 发热、咳嗽B. 腹泻、呕吐C. 肌肉疼痛、头痛D. 以上都是答案:D二、多项选择题6. 禽流感病毒的防控措施包括哪些?A. 疫苗接种B. 隔离感染动物C. 环境消毒D. 健康教育答案:ABCD7. 禽流感病毒的检测方法包括哪些?A. 病毒分离B. 血清学检测C. 核酸检测D. 病理学检查答案:ABC8. 禽流感病毒的流行特点包括哪些?A. 季节性流行B. 地区性流行C. 人畜共患D. 快速传播答案:ABCD三、判断题9. 禽流感病毒只感染鸟类,不会感染人类。
(对/错)答案:错10. 禽流感病毒可以通过直接接触感染的鸟类或其分泌物和排泄物传播给人类。
(对/错)答案:对四、简答题答案:禽流感病毒属于正黏液病毒科,具有单股负链RNA基因组,病毒颗粒呈球形或丝状,表面有突起,这些突起由血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)两种表面抗原组成。
12. 简述禽流感的预防措施。
答案:预防禽流感的措施包括:避免接触病死禽类,保持良好的个人卫生习惯,如勤洗手、戴口罩等;加强家禽饲养管理,实施生物安全措施;对疑似感染的禽类进行隔离和检测;在疫情发生时,及时进行疫苗接种和药物治疗。
五、论述题13. 论述禽流感病毒对公共卫生的潜在影响。
答案:禽流感病毒对公共卫生的潜在影响主要体现在以下几个方面:首先,禽流感病毒能够引起家禽的大规模死亡,导致经济损失;其次,禽流感病毒具有人畜共患的特性,能够感染人类,引发公共卫生危机;此外,禽流感病毒的变异速度快,可能出现新的病毒株,增加防控难度;最后,禽流感疫情可能引发社会恐慌,影响社会稳定和经济发展。
标准操作规程(SOP)——一、目的微量中和试验是一种敏感性高、特异性强的血清学方法,用于测定血清中的病毒特异性中和抗体水平。
中国国家流感中心的所有技术人员,必须按照本文件相关的操作规程,进行流感/禽流感微量中和抗体检测实验,以确保实验的准确性。
二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行流感/禽流感微量中和抗体检测。
三、责任进行流感/禽流感微量中和抗体检测的技术人员需严格按照规定进行操作。
四、程序(一)生物安全要求H5,H7亚型高致病性禽流感病毒,H2N2亚型流感病毒的操作需要在生物安全3级(BSL-3)实验室中进行。
其余流感病毒的操作需要在生物安全2级(BSL-2级)实验室中进行。
操作人员必须严格按照相应实验室的要求做好个人防护。
(二)材料1.中和反应实验材料(1)病毒:一般采用接种鸡胚尿囊腔后收获的流感/禽流感病毒液,在-70℃中保存,并且注意避免反复冻融。
进行中和试验之前,需先进行病毒滴度(TCID50)的滴定。
具体步骤如下,1)病毒的稀释:可采取对数或者半对数稀释的方法。
以下介绍半对数稀释法。
取1管冻存病毒尿囊液,用病毒培养液进行1:100稀释。
第一列4个孔每孔加入146μL 1:100稀释过的病毒液,其它各列每孔加入100 μL 病毒培养液。
然后用多道加样器从第一孔吸46μL 至第二孔,做系列半对数稀释,使之成为10-2、10-2.5、10-3、10-3.5……10-7。
每孔含有100μL 病毒液。
2)每孔加入100μL MDCK 细胞悬液(1.5×104细胞/孔),37℃,5%CO 2培养箱孵育18~22h 。
每一滴度作平行4孔。
3)细胞固定、ELISA 操作如下述。
4)OD 值 〉2倍MDCK 细胞对照OD 值判定为阳性5)病毒滴度计算见组织细胞半数感染量滴定SOP 。
(2)血清样品:包括待检血清、阳性及阴性血清对照。
如果待检血清有可能需要多次检测,则需将待检血清进行小量分装,-20℃至-70℃保存均可,避免多次反复冻融。
流感试题及答案一、单选题(30题)1、流感病毒根据核蛋白和基质蛋白分为几种型别?( C)A、一种B、二种C、三种D、四种2、甲型流感病毒根据哪种蛋白机构及其基因特性可以分成很多亚型?(B )A、血凝素B、血凝素和神经氨酸酶C、基质蛋白D、M蛋白3、甲型流感病毒的所有亚型都可以在什么中存在?( C )A、人类B、猪C、鸟类D、水貂4、流感流行具有一定的季节性,我国北方地区流行高峰一般发生在什么季节?(B)A、秋冬季B、冬春季C、夏秋季D、春夏季5、能引起世纪性流感大流行的流感病毒主要是什么?( A)A、甲型流感B、乙型流感C、甲型H1N1流感D、H3N2流感病毒6、1967-1968年流感大流行的主要毒株是什么?( D)A、H1N1B、H2N2C、甲型H1N1流感D、H3N2流感病毒7、1977-1979年流感大流行的主要毒株是什么?( A)A、H1N1B、H2N2C、甲型H1N1流感D、H3N2流感病毒8、我国流感监测中,流感样病例标本采集时间主要集中在几月份?( A)A、每年10月-次年3月B、4月-9月C、全年D、1月-6月9、我省每所流感监测哨点医院,每年至少需要采集多少份流感样病例标本?(B )A、120B、300C、400D、60010、流行性感冒属于哪类传染病?(C)A、甲类C、丙类D、乙类传染病甲类管理11、疫情暴发单位发现达到预警指标的流感样病例暴发疫情后,应在几小时内以电话或传真等方式向属地县级疾病预防控制机构(农村学校向当地乡镇卫生院防保组)报告?( B)A、1B、2C、3D、412、每一起流感样病例暴发疫情一般应采集多少份左右咽拭子、鼻拭子或鼻咽拭子样本?(B )A、5B、10C、20D、3013、每一起流感样病例暴发疫情采集的标本,应该在4℃条件下,于几小时内运送至对应的流感监测网络实验室?( B)A、12B、24C、36D、4814、流感监测网络实验室收到流感样病例暴发疫情标本后,要求在几小时内利用核酸检测方法进行流感病毒亚型鉴定?(B)A、12B、24D、4815、流感大流行一般存在几个流行高峰?(B )A、1B、2-3C、4D、516、现在流感疫苗主要是几价疫苗?(C)A、单B、2C、3D、417、对于流感患者最好在发病几小时后使用神经氨酸酶抑制剂有效?(A)A、48小时B、72小时C、96小时D、120小时18、流行性感冒最常见严重并发症是什么?( D)A、呼吸道疾病B、呼吸衰竭C、多器官功能衰竭D、重症肺炎19、流行性感冒实验室检测的“金标准”是什么?(D)A、分子生物学检测B、病毒抗原检测C、血清学诊断D、病毒分离20、对于疑似流感患者,采集急性期血清标本和恢复期血清标本检测,抗体滴度相差几倍以上才可视为流感确诊病例?(C )A、2B、3C、4D、521、最有效预防流感及其并发症的手段是什么?( C)A、减少外出B、抗病毒药物预防C、接种流感疫苗D、经常开窗、勤洗手22、流感疫苗接种最好在几个月前接种?( D)A、3月B、6月C、12月D、10月23、《山东省流感监测方案(2011年版)》要求一周,在同一学校、幼儿园或其他集体单位发生几例及以上具有流行病学关联的流感样病例就要求网络直报?(C )A、5B、10C、15D、3024、疑似流感病例恢复期血清应在发病后多长时间采集?(C)A、7天B、3天C、2-4周D、4-5周25、流感样病例暴发疫情突发公共卫生事件相关报告及时率达多少?(D )A、80%B、99%C、95%D、100%26、流感样病例指标是发热多少度,伴咳嗽或咽痛之一,缺乏其他实验室确定诊断依据?(A)A、≥38℃B、≥37℃C、≥38.5℃D、≥39℃27、流感样病例暴发网络直报后,要进行什么工作?(A)A、进程报告和结案报告B、结案报告C、进程报告D、不需开展其它活动28、2009年甲型H1N1流感首发于哪里?(D)A、中国贵州B、中国香港C、西班牙D、墨西哥29、1968年H3N2流感大流行首发于哪里?( B)A、中国贵州B、中国香港C、西班牙D、墨西哥30、常常引起局部暴发,不引起世界性流感大流行的是什么?( B)A、甲型流感病毒B、乙型流感病毒C、丙型流感病毒D、禽流感病毒二、多选题(20题)1、流感在流行病学上最显著的特点是什么?( ABD)A、突然暴发B、迅速扩散,从而造成不同程度的流行C、病死率高D、发病率高E、引起大流行2、流感的主要传染源是什么?( AB)A、流感患者B、隐性感染者C、接种过流感疫苗人群D、诊断为流感且完全康复的人群E、密切接触者3、流感主要通过什么途径进行传播?(ABC)A、空气飞沫B、口腔、鼻腔、眼睛等处粘膜C、接触流感患者的呼吸道分泌物、体液D、蚊虫叮咬E、握手4、根据流感症状和体征可以分为哪些流感?(ABC)A、单纯型流感B、中毒型流感C、胃肠型流感D、普通流感E、肺炎型流感5、下面哪些人群为预防流感的重点人群?(ABCD)A、儿童B、老年人C、妊娠妇女D、免疫缺陷人群E、中年人6、流感样病例标本一般采集的标本种类为哪些?( ABCDE)A、鼻拭子B、咽拭子C、鼻咽抽取物D、急性期血清E、恢复期血清7、对于流感病毒来说,实验室检测方法包括哪些?(ABCD)A、病毒分离B、核酸检测C、病毒抗原检测D、血清学诊断E、显微镜观察8、在流感流行时期,下面哪些症状可以考虑是流感病例?(ABCDE )A、发热伴咳嗽和/或咽痛等急性呼吸道症状B、发热伴原有慢性肺部疾病急性加重C、婴幼儿和儿童发热,未伴其他症状和体征D、老年人(年龄≥65岁)新发生呼吸道症状,或出现原有呼吸道症状加重,伴或未伴发热E、重病患者出现发热或低体温9、具有流感的临床表现,下面哪种可以确诊为流感病例?(ACD)A、流感病毒核酸检测阳性B、临床医生确诊C、流感病毒分离培养阳性D、急性期和恢复期双份血清的流感病毒特异性IgG抗体水平呈4倍或4倍以上升高E、单份血清标本抗体滴度在160以上10、流感病例出现下面哪些症状即可确定为重症流感病例?( ABCDE)A、神志改变,反应迟钝、嗜睡、躁动、惊厥等B、呼吸困难和/或呼吸频率加快C、严重呕吐、腹泻、出现脱水表现D、原有基础疾病明显加重,出现脏器功能不全或衰竭E、胸片显示双侧或多肺叶浸润影,或入院48小时内肺部浸润影扩大≥50%11、流感疫苗优先接种人群主要是哪些?(ABCD)A、6~59月龄婴幼儿B、≥60岁老人C、妊娠期妇女及计划在流感季节怀孕的妇女D、18岁以下青少年长期接受阿司匹林治疗者E、对鸡蛋过敏人群12、流感疫苗接种的禁忌者有哪些?(ABCD)A、对卵蛋白或任何疫苗过敏者B、中、重度急性发热者C、曾患格林巴利综合征者D 、医师认为其他不能接种流感疫苗者E、妊娠期妇女及计划在流感季节怀孕的妇女13、流感监测哨点医院流感样病例标本的采集数量正确的是哪些?(BC )A、每年4月-9月每月10-15份B、每年10月-次年3月每周采集10-15份C、每年4月-9月每月5-15份D、每年10月-次年3月每周采集5-15份E、每月采集30份14、县级疾控中心的工作职责主要是哪些?(ABCDE)A、开展流感样病例暴发疫情现场调查处置工作,按要求采集、保存和运送流感样病例暴发疫情标本;B、负责组织辖区内流感样病例暴发疫情监测等内容的培训C、指导辖区集体单位(特别是学校和托幼机构等人群密集区域)开展流感防治工作,开展流感防治的宣传教育与健康促进活动D、对乡镇卫生院(社区卫生服务中心)及村卫生室(社区卫生服务站)提供技术支持E、承担本级卫生行政部门和上级疾控机构临时交付的流行性感冒防控工作任务15、在流感流行季节,托幼机构或学校应采取下面哪些措施来预防流感?(ABCDE)A、晨检制度B、缺勤/缺课监测C、加强健康教育D、减少集体活动E、勤洗手、经常保持室内通风16、治疗流感病例最佳药物主要有哪些?(BC)A 抗菌素B奥司他韦C 扎那米韦D 糖皮质激素E 免疫球蛋白17、关于流感的叙述下列正确的有哪些?(ABDE)A、患者、隐性感染者为主要传染源B、病初2~3天传染性最强C、某一时期的流行多由多个血清型引起D、可以并发Reye综合征E、常有咽喉痛、干咳18、下列哪些是典型流感的主要临床表现?(ABCDE)A、突起畏寒、寒战和高热B、全身酸痛明显,尤以背部和腿部最为明显C、全身乏力明显,多数患者感觉十分虚弱而卧床多天D、可有咽喉刺痛、胸骨后不适E、食欲减退19、流感患者的肺炎,下列描述正确的是哪些?(ABCE)A、流感病毒本身可引起病毒性肺炎B、病程中若持续或反复发热,呼吸道症状加重,提示可能并发细菌性肺炎C、并存慢性心、肺疾病和免疫功能低下者,容易迅速致死D、都必须尽早应用抗生素E、护理上应密切观察患者的体征20、关于流感的预防与控制,重要的是哪些?(ABCE)A、建立一个规范、灵敏、高效的覆盖全国或全球的流感监测网络B、大力宣传接种流感疫苗,尤其高危人群C、对患者的呼吸道隔离D、首选抗病毒药物预防E、流感流行期间应避免大型聚会和活动,注意室内通风二、判断题(15题)1、根据流感病毒表面糖蛋白的不同流感病毒可分为多种不同的亚型,而且均可引起流感的大流行。
流感知识考核(90+题)1.流行性感冒是由()引起的一种急性呼吸道传染病,严重危害人群健康。
[单选题]*A流感病毒(正确答案)B感冒病毒C柯萨奇病毒D流行性出血热病毒2.()是预防流感病毒感染及其严重并发症的最有效手段:[单选题]*Λ抗病毒药物B多喝开水C多锻炼身体D接种流感疫苗(正确答案)3.流感流行季节,对临床怀疑为流感,特别是有重症流感高危因素的患者或者重症流感患者,应尽早(),减少并发症,降低病死率,缩短住院时间。
[单选题]*A住院B输液C抗流感病毒治疗(正确答案)D接种流感疫苗4.流感的易感性正确的是O[单选题]*A老人易感B儿童易感C普遍易感(正确答案)D成人易感5.以下说法正确的是()[单选题]*A接种流感疫苗可预防所有流感B接种流感疫苗可有效预防相应亚型的流感病毒感染(正确答案)C接种流感疫苗可预防甲流D接种流感疫苗可预防乙流6.流感潜伏期一般为O[单选题]*A1,天(正确答案)B3~8天C5~10天D7~14天7.流感病毒检测采样,最佳采集时间为O[单选题]*A发病当天B发病1周后C发病后的前3天,不超过7天(正确答案)D发病前1周8.面对流感患者,以下防护措施正确的是O[单选题]*Λ常规操作时佩戴医用外科口罩(正确答案)B接触被血液、体液、分泌物、排泄物等污染物品时可不戴手套,接触后洗手C接触非完整皮肤黏膜时戴一次性手套,脱手套后可不洗手D有喷溅可能或可能有气溶胶产生时,戴口罩、护目镜或面罩,无需穿一次性防渗隔离衣9.关于陪护的说法正确的是O[单选题]*A原则上需要陪护B原则上不设陪护(正确答案)C陪同人员进入患者房间,不必进行呼吸道症状筛查D对陪同人员提供手卫生指导、限制物表接触,使用个人防护设备(一次性医用口罩、手套),提醒呼吸卫生和科室礼仪E陪同人员在产生气溶胶操作的现场需要佩戴医用外科口罩10.辅助护理人员的防护正确的是()[单选题]*Λ佩戴一次性医用口罩B佩戴医用防护口罩C佩戴外科口罩(正确答案)D穿隔离衣、面罩、医用口罩,严格执行手卫生、消毒隔离措施11.关于流行性感冒下列哪项是错误的[单选题]*甲型流感易发生变异由流行性感冒病毒引起临床表现以上呼吸道症状较重全身中毒症状较重(正确答案)12.关于流行性感冒病毒下列哪项是正确的[单选题]*流行性感冒病毒属副粘液病毒甲、乙、丙、丁四型(正确答案)甲型不变异乙型及丙型可感染人类及多种动物13.流行性感冒的确诊的主要依据是[单选题]*发病季节呼吸道症状轻微而全身中毒症状重病毒分离(正确答案)血凝抑制试验14.流行性感冒的临床表现,下列不符合的是[单选题]*发热、头痛、肌痛和全身不适起病上呼吸道其他症状较轻或不明显(正确答案)年老患者或免疫力低下的患者感染流感,病情可持续发展肺外合并症多见15.流感的预防措施中下列哪项是错误的[单选题]*对流感患者进行隔离及治疗(正确答案)流感流行前接种流感疫苗流感流行前给所有易感人群使用金刚烷胺进行药物预防减少公众集会活动16.流行性感冒的确诊办法错误的是[单选题]*病毒分离培养阳性流感病毒核酸检测阳性发病季节(正确答案)急性期和恢复期双份血清的流感病毒特异性gG抗体水平呈4倍或4倍以上升高17.关于流行性感冒的流行病学特征,下列哪顼是错误的[单选题]*流感患者及隐性感染者为主要传染源动物亦可能为主要的贮存宿主和中间宿主呼吸道经空气飞沫传播乙型流感均为散发(正确答案)肺外并发症多见18.流行性感冒病毒分为甲、乙、丙、丁四型的依据[单选题]*所致疾病的临床特征流行特征病毒内部和外部抗原结构不同(正确答案)表面抗原血凝素19.关于流感的表述下列哪些是错误的[单选题]*由流行性感冒病毒引起临床表现以上呼吸道症状较重发热及全身中毒症状较重(正确答案)传染性强20.关于流感的治疗下列哪些是错误的[单选题]*对临床诊断病例和确诊病例应尽早隔离治疗非住院患者居家隔离,保持房间通风流感病毒高危人群尽早抗病毒治疗可减轻流感症状缩短流感病程尽早使用抗菌药物(正确答案)21.下列有关流感重症高危人群的表述错误的是[单选题]*年龄V5岁的儿童高血压患者(正确答案)年龄265岁的老年人妊娠期妇女22.流行性感冒的临床表现,下列不符合的是[单选题]*全身症状重上呼吸道卡他症状较轻或不明显年老患者或免疫力低下的患者感染流感,病情可持续发展肺外合并症多见(正确答案)23.下列有关流感预防的表述错误的是[单选题]*尽早服用抗生素可有效预防流感(正确答案)保持良好的个人卫生习惯也可预防流感接种流感疫苗是预防流感最有效的手段药物预防不能代替疫苗接种24.下列有关流感抗病毒治疗的表述错误的是[单选题]*抗流感病毒治疗要在病毒检测结果确诊后才可进行(正确答案)发病48h内进行抗病毒治疗可减少流感并发症、降低住院患者的病死率、缩短住院时间发病时间超过48h的重症患者依然能从抗病毒治疗中获益无重症流感高危因素的患者也可以进行抗病毒治疗25.下列药物对流感无效的是[单选题]*奥司他韦扎那米韦帕拉米韦抗生素(正确答案)26.下列有关流感表述错误的是[单选题]*潸伏期一般为1—7天并发症包括肺炎、神经系统损伤、心脏损害、肌炎、横纹肌溶解综合征和脓毒性休克等外周血常规检查常表现为白细胞升高(正确答案)临床表现多伴全身肌肉关节酸痛、乏力、食欲减退等全身症状27.下列药物对乙型流感无效的是[单选题]*奥司他韦扎那米韦帕拉米韦金刚烷胺(正确答案)28.流行性感冒属于哪类传染病[单选题]*甲类传染病乙类传染病丙类传染病(正确答案)其它重点监测传染病29.流行性感冒临床诊断病例及疑似病例上报传染病报告卡时限为[单选题]*2小时内12小时内24小时内(正确答案)48小时内30.关于流行性感冒诊疗错误的防控措施是[单选题]*做好预检分诊医生接诊时询问病人流行病学史,做好五早院内开展健康宣教流感性感冒相关知识恰当使用抗菌药物(正确答案)31.流感的确诊主要依据是O[单选题]*Λ.发病季节B.呼吸道症状轻微而全身中毒症状重C.病毒分离(正确答案)D.血凝抑制试验32.流感的临床表现,下列不符合的是O[单选题]*A.发热、头痛、肌痛和全身不适起病B.上呼吸道其他症状较轻或不明显(正确答案)C.年老患者或免疫力低下的患者感染流感,病情可持续发展D.肺外合并症多见33.流感患者根据传播途径应实施何种隔离:()[单选题]*Λ.接触隔离B.空气隔离C.飞沫隔离D.飞沫隔离和接触隔离(正确答案)34.流感病毒的生物学特征是不耐热,不耐低温和干燥,对紫外线和常用消毒剂敏感。
常用流感病毒实验室检测方法的比较摘要目的通过对四种常用流感病毒检测方法的比较,确定适用于常规监测及疫情暴发时的检测方法。
方法用四种方法对随机抽取的50份样品进行检测,对结果进行对比分析。
结果胶体金法虽简单快速,但漏检率较高(20.00%);RT-PCR法灵敏快捷,准确度高(34.00%);细胞培养法费用适中,检出率较高(14.00%);鸡胚培养法检出率最低(2.00%)。
结论胶体金法适合疫情现场检测,RT-PCR法适合实验室内快速检测,组织培养法适合常规监测,鸡胚培养法适合流感疫苗生产。
关键词组织培养;鸡胚培养;病毒分离;RT-PCR;流感病毒现在实验室对流感病毒的检测手段有很多种,在本科室常用的方法有胶体金法、细胞培养法、鸡胚培养法、RT-PCR法四种。
为实际工作中找到最适合的检测方法,更及时准确的提供检测结果,对实验室常用的四种流感病毒检测方法进行比较。
现报告如下。
1 资料与方法1. 1 检测样品2014年1~4月份本院对就诊的流感样病例(发热,体温≥38℃,伴咳嗽或咽痛之一者,未服用过抗病毒药物[1])采集的鼻咽拭子,随机抽取50份。
流感病毒采样管由北京友康恒业科技有限公司购买。
1. 2 实验方法1. 2. 1 胶体金法美国QUIDEL公司,QuickVue Influenza A+B Test,按照试剂盒说明书操作。
1. 2. 2 细胞培养法MDCK细胞由辽宁省疾病预防控制中心提供。
样品前处理:将采样管漩涡震荡10 s,反复挤压拭子头后弃去拭子,加入青霉素、链霉素、制霉菌素,4℃静置2 h。
细胞传代及病毒接种按照郭元吉等所著的《流行性感冒病毒及其实验技术》操作[2]。
样品接种MDCK细胞培养出的第一代病毒培养液用1%豚鼠血红血球进行微量血凝实验(haemagglutination assay,HA),HA≥1:8的第一代病毒培养液用血凝抑制法(hemagglutination inhibition,HI)进行流感病毒分型鉴定(鉴定试剂盒由国家流感中心提供)。
病毒性感冒需要做哪些检查?病毒性感冒是一种普遍的呼吸道传染病,通常由呼吸道病毒引起。
感冒的症状包括流感和喉咙痛,但这些症状也可能是其他疾病的表现。
为了明确诊断和确定治疗方案,医生可能建议一系列的检查。
1. 体格检查医生会进行体格检查,检查你的体温,观察你的喉咙,听取你的肺部和心脏听诊器意见。
体格检查有助于医生确定你是否有感冒的征象。
2. 咽拭子检查医生可能会建议进行咽拭子检查,以检查你的喉咙内是否有病毒残留。
这可以帮助确定感冒是否由病毒引起。
3. 血液检查血液检查可以帮助医生确定你体内是否有病毒存在。
通过检查白细胞计数和 C-反应蛋白水平等指标,医生可以更好地了解你的健康状况和感冒严重程度。
4. X光检查在某些情况下,医生可能会建议进行胸部X光检查,特别是当感冒引起呼吸困难或持续时间较长时。
X光检查可以排除其他可能的并发症,比如肺炎。
5. 聚合酶链反应(PCR)检测PCR检测是一种基因诊断技术,可以快速准确地检测出病毒性感冒的病原体。
医生可以通过这种检测方式确认感冒是否由特定的病毒引起,比如流感病毒或呼吸道合胞病毒。
6. 病毒培养在某些情况下,医生可能会通过病毒培养检测方法来检测感冒病原体,这需要在实验室环境中培养出病毒。
虽然这种方法比较耗时,但有时候仍然是必要的。
总的来说,对于病毒性感冒的检查主要是通过体格检查、咽拭子检查、血液检查、X光检查、PCR检测和病毒培养等手段来诊断确认。
针对感冒的治疗方案通常是对症处理,多休息、饮食清淡、多饮水等方法是帮助康复的重要措施。
希望以上内容能帮助你更好地了解病毒性感冒需要做哪些检查,以及治疗的方法。
如果症状持续或加重,请及时就医。
流感病毒的快速检测方法一、RT-PCR快速诊断方法(一)生物安全要求(二)病毒核酸提取(三)RT-PCR(四)PCR 产物纯化(五)流感病毒RT-PCR检测引物二、免疫荧光方法检测流感病毒(一)原理(二)标本处理(三)间接免疫荧光法(四)结果判断三、实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)快速诊断检测(一)基本原理(二)实验试剂(三)实验步骤四、快速诊断试剂盒流感的快速检测方法,与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。
因此常用于流感暴发时早期病原学检测用。
流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。
这里介绍RT-PCR、Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。
无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。
一、RT-PCR快速诊断方法核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法,即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。
本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应(PCR)。
流感病毒的基因组是负链RNA,在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA 互补的DNA,即为cDNA。
逆转录酶(RT)就是用于合成cDNA的多聚酶,因此,扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。
RT-PCR需要一对型别特异引物,四种脱氧核苷酸(dNTPs),RNA模板,逆转录酶及Taq DNA 多聚酶;首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA,然后再进行聚合酶链反应经25~30个循环,使DNA产物达到倍增的效果。
(一)生物安全要求生物安全级别与个人防护要求:生物安全二级实验室,防护要求与二级实验室的要求相同。
并应遵守相应的生物安全规定。
进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时可以在生物安全二级实验室里进行,核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。
(二)病毒核酸提取1. 实验材料及仪器(1) QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit(Catalog# 74104)(2) β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)(3) 70% 乙醇(4) 无菌1.5ml 离心管(5) 10μl、20μl、200μl、1000μl加样器和枪头(6) 可调14K微型离心机(7) 旋转混合器2. 操作步骤(1) 取1支无菌、无RNA酶的1.5ml Eppendorf管,加入500μl RLT。
一、RT-PCR快速诊断方法(一)生物安全要求(二)病毒核酸提取(三)RT-PCR(四)PCR 产物纯化(五)流感病毒RT-PCR检测引物二、免疫荧光方法检测流感病毒(一)原理(二)标本处理(三)间接免疫荧光法(四)结果判断三、实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)快速诊断检测(一)基本原理(二)实验试剂(三)实验步骤四、快速诊断试剂盒流感的快速检测方法,与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。
因此常用于流感暴发时早期病原学检测用。
流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。
这里介绍RT-PCR、Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。
无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。
一、RT-PCR快速诊断方法核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法,即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。
本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应(PCR)。
流感病毒的基因组是负链RNA,在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA互补的DNA,即为cDNA。
逆转录酶(RT)就是用于合成cDNA的多聚酶,因此,扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。
RT-PCR需要一对型别特异引物,四种脱氧核苷酸(dNTPs),RNA模板,逆转录酶及Taq DNA 多聚酶;首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA,然后再进行聚合酶链反应经25~30个循环,使DNA产物达到倍增的效果。
(一)生物安全要求生物安全级别与个人防护要求:生物安全二级实验室,防护要求与二级实验室的要求相同。
并应遵守相应的生物安全规定。
进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时可以在生物安全二级实验室里进行,核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。
(二)病毒核酸提取1.实验材料及仪器(1)QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit(Catalog# 74104)(2)β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)(3)70% 乙醇(4)无菌离心管(5)10μl、20μl、200μl、1000μl加样器和枪头(6)可调14K微型离心机(7)旋转混合器2.操作步骤(1)取1支无菌、无RNA酶的 Eppendorf管,加入500μl RLT。
(2)取采样液(鼻拭子、咽拭子、胸水等)或病毒培养物(鸡胚尿囊液或细胞培养液)100μl,加入上述Eppendorf管中。
(3)加5μl β-巯基乙醇,充分混匀。
(4)加600μl 70%乙醇,于旋转混合器混匀。
(5)从试剂盒中取出带滤膜的离心柱,并标上标本号。
(6)将第4步的混合液体分两次(每次600μl)吸入于滤柱中,12000rpm离心15秒,弃收集管中的离心液。
(7)滤柱仍放回收集管上,将第4步的混合液全部吸入滤柱中,12000rpm 离心15秒,弃收集管中液体。
(8)于滤柱中加入700μl RW1,12000rpm 离心15秒。
(9)从试剂盒中取出一支新的2ml收集管,将离心后的滤柱转到新的收集管上,于柱子中加入500μl RPE,12000rpm 离心15秒弃收集管中液体。
(10)滤柱放回收集管上,于滤柱中加入500μl RPE,13000~14000rpm 离心2分钟。
(11)从试剂盒中取出一支 Eppendorf管,将滤柱转到新的管上,于滤柱中加入30~50μl 无RNA酶的水,室温静置1~3分钟。
(12)12000rpm 离心1分钟,弃滤柱。
收集的离心液即为提取病毒的RNA,可以直接用于逆转录实验,或在-20℃以下保存,-30℃可保存3~4个月。
3.注意事项(1)试剂盒中的RPE液用前需加44ml无水乙醇,使终体积达到55ml。
(2)所有用过的枪头、收集管放入2%次氯酸钠消毒缸中过夜。
(三)R T-PCR1.一步法 RT-PCR(1)实验材料1)QIAGEN One Step RT-PCR Kit Cat No 2102122)RNase inhibitor 40u/μl(Promega)3)上游引物200ng/μl4)下游引物200ng/μl5)模板RNA(Templet RNA)(2)实验步骤1)PCR反应配置(在清洁区缓冲间,加RNA模板应在核酸室)无RNA酶水(Rnase Free Water)μl5×Buffer 10μl10mM dNTP 2μlEnzyme Mix 2μlRnase inhibitor μl上游引物1μl下游引物1μlRNA 模板5μl总量:50μl2)将PCR 反应管放入PCR扩增仪3)RT-PCR 反应条件:此循环的反应条件仅共参考,如果引物更换,相应的反应条件需要做适当调整。
60℃ 1 min42℃ 10 min50℃ 30 min95℃ 15 min94℃ 30 sec52℃ 30 sec72℃ 1 min返回第 5部,循环34次72℃ 10 min4℃ 保存4)PCR产物检测琼脂糖凝胶配置:用1×TBE 将琼脂糖配成%~%溶液,加热使之完全溶解。
冷却到50~60℃时加入溴化乙锭(Ethidium Bromide EB,10ug/μl),终浓度为μg/ml。
PCR产物检测:将凝胶放入电泳槽,加入1×TBE Buffer ,使它淹没过胶面。
每份标本取4μl PCR产物,与1μl 5×Loading Buffer 充分混匀后全加入凝胶孔中。
于同一凝胶的第一孔加入5μl分子量标准样品。
加完样后,盖上电泳槽盖子,接通电源,稳压100v,电泳时间约30~40min。
结果分析:用UV~254暗箱式紫外透射仪观察电泳结果,在透射波长254nm 下观察结果效果较好。
或者用凝胶成像系统观察电泳结果。
5)注意事项:含EB的琼脂糖经处理后放入科研垃圾袋内统一处理。
含有EB的凝胶处理方法:加1倍体积的L KMnO4,小心混匀。
加入1倍体积的 mol/L HCl,小心混匀。
于室温放置数小时。
加入1倍体积的 mol/L NaOH,小心混匀后即可丢弃。
2.二步法 RT-PCR(1)实验材料1)逆转录酶:AMV Reverse Transcriptase,Catalog# M5101 Paromeg2)5×RT Buffer3) 2.5mM dNTP4)Rnase inhibitor 40u/μl(Promega)5)上游引物200ng/μl6)下游引物200ng/μl7)无RNA酶的水(Rnase Free Water)8)Ex-Taq 酶5u/μl DRR 001A 250u (Takara)9)10×PCR Buffer(2)实验步骤1)逆转录反应(在清洁区缓冲间,加RNA模板在核酸提取室)无RNA酶的水μl5×RT Buffer 4μl2.5mM dNTP 2μl上游引物1μlRnase inhibitor μl逆转录酶1μlRNA 模板5μl总量:20μl将上述反应液混匀,42℃水浴作用1小时。
然后94℃ 3min ,放置冰上(下步PCR反应或-20℃ 待用)2)PCR反应配置(在清洁区缓冲间,加cDNA模板应在PCR扩增室)无RNA酶的水μl10×PCR Buffer 5μl2.5mM dNTP 2μl上游引物1μl下游引物1μlEx-Taq 酶μlcDNA 模板5μl总量:50μl3)将PCR 反应管放入PCR扩增仪4)PCR 反应条件:此循环的反应条件仅共参考,如果引物更换,相应的反应条件需要做适当调整。
94℃ 3 min94℃ 40 sec52℃ 40 sec72℃ 2 min返回第2部,循环30 次72℃ 7 min4℃ 保存PCR 产物检测:同一步法(四)P CR 产物纯化1.实验材料QIAquick Gel Extraction Kit Cat No 287042.操作步骤(1)PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳;(2)用干净的手术刀切割目的DNA片段,将切下的DNA胶放入离心管(切胶在暗箱或紫外透射仪下操作);(3)加3倍胶体积的Buffer QG(即100mg DNA胶加300μl Buffer QG);(4)水浴50℃孵育10min,直到DNA胶完全溶解(每隔2~3min 用旋转混合器混匀);(5)加一个胶体积的异丙醇(100mg DNA胶加100μl异丙醇);(6)从试剂盒中取出带滤膜的离心柱收集管,并标上标本号;(7)将上述DNA液吸入带滤膜的离心柱,13000rpm离心1min,弃收集管中废液,再将带滤膜的离心柱放回收集管;(8)于带滤膜的离心柱中加 Buffer QG,13000rpm离心1min,弃收集管中废液;(9)带滤膜的离心柱中加入 Buffer PE,放置2~5min,13000rpm离心1min,弃收集管中废液,再将带滤膜的离心柱放回收集管上,13000rpm离心1min;(10)将带滤膜的离心柱转移到一新的离心管上;(11)于带滤膜的离心柱中加20~30μl TE(或Rnase Free Water),室温3~5min,12000rpm离心1min,弃小柱,收集的离心液即为纯化的PCR产物,可直接用于测序。
(五)流感病毒RT-PCR检测引物A型检测引物:5’ CCG,AGA,TCG,CAC,AGA,GAC,TTG,AAG,AT5’ GGC,AAG,TGC,ACC,AGC,AGA,ATA,ACTB型检测引物5’ GGG,ACA,TGA,ACA,ACA,AAG,ATG5’ TGT,CAG,CTA,TTA,TGG,AGC,TGH1亚型鉴定引物5’ ACT,ACT,GGA,CTC,TGC,TGG,AAC5’ CAA,TGA,AAC,CGG,CAA,TGG,CTC,CH3亚型鉴定引物5’ ATC,AGG,GAG,AGT,CAC,AGT,CTC5’ ATG,CTT,CCA,TTT,GGA,GTG,ATG,CH5亚型鉴定引物5’ GAG,TGA,AGC,CTC,TCA,TTT,TG5’ GTA,CTT,CTT,GGT,TGG,TAT,TAT,TGT,ACG,TCCH5亚型鉴定引物5’ GGG,TGA,GCT,CAT,GTA,CA5’ YTG,AGT,CCC,CTT,TCT,TGAH5亚型鉴定引物5’ GCC,ATT,CCA,CAA,ACA,CCC5’ CT C,CCC,TGC,TCA,TTG,CTA,TGN1鉴定引物5’ AAG,GGG,TTT,TCA,TAC,AGG,TAT,GGT5’ TCT,GTC,CAT,CCA,TTA,GGA,TCCN2鉴定引物5’ GGA,AAT,CGT,TCA,TAT,TAG,CCC,ATT,G5’ AGC,ACA,CAT,AAC,TGG,AAA,CAA,TGC二、免疫荧光方法检测流感病毒(一)原理流感病毒主要感染呼吸道上皮细胞,因此在病人呼吸道标本的脱落细胞中含有流感病毒抗原,通过直接检查上皮细胞内病毒特异性抗原即可诊断。