流感病毒及实验室检测

流感【概述】流行性感冒简称流感，是流感病毒引起的急性呼吸道传染病，也是一种潜伏期短、传染性强、传播速度快的疾病。

其主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播。

典型的临床症状为:高热、乏力、头痛、全身酸痛等全身中毒症状重而呼吸道症状较轻。

一般冬、春季节为高发期，所引起的并发症和死亡现象非常严重。

由于流感病毒致病力强，易发生变异，若人群对变异株缺乏免疫力，易引起暴发流行，迄今世界已发生过5次大的流行和若干次小流行，造成数十亿人发病，数千万人死亡。

【病原学】(一)结构流感病毒最早是在1933年由英国人威尔逊·史密斯(Wilson Smith)发现，当时被称作Hl Nl。

属正赫液病毒科，呈球形或丝状，直径80一120nm，有包膜，是一种RNA病毒。

病毒由核衣壳与外膜组成。

病毒核衣壳含核蛋白(NP)、多聚酶和核糖核酸(RNA ) o NP具有型特异性，抗原性较稳定。

多聚酶负责流感病毒RNA转录，由三个亚单位组成:PB1 ,PB2和PA，通常将这三种蛋白称为3P蛋白。

单股负链核糖核酸(ss-RNA)为流感病毒的基因组，甲型、乙型流感病毒RNA共分8个节段。

1-7节段分别编码以下蛋白:PB2,PBI,PA,HA,NP,NA,M，目前认为第8节段是编码起连接RNA功能的非结构蛋白(NSl 和NS2 )，各片段间可发生遗传物质的重组、交换、重组，最终导致新抗原、新亚型的出现。

外膜由脂质双分子层与基质蛋白(M)组成，后者又分为M1,M2两型，M1蛋白为外膜内层，M2蛋白为外膜上的氢离子通道。

基质蛋白抗原性较稳定，也具有型特异性。

脂质双层除了磷脂分子外，还包含两型以辐射状突出于病毒体外的糖蛋白，即血凝素(hemagglutinin , HA )(棒状三聚体)和神经氨酸酶( neuraminidase , NA)蘑菇形四聚体)} o HA能引起红细胞凝集而得名，其水解产物通过与宿主细胞膜上的唾液酸受体作用，协助病毒吸附于宿主细胞表面并进一步进人细胞内，是流感病毒致病的重要因素;NA具有水解唾液酸的作用，能水解宿主细胞表面唾液酸受体特异性糖蛋白末端的N一乙酞神经氨酸，协助与宿主细胞结合的新病毒颗粒释放，感染未受染细胞的，从而促进流感病毒进一步扩散、繁殖，也是流感抗病毒药物的一个作用靶点。

禽流感诊断标准国标
禽流感是一种由禽流感病毒引起的传染病，其症状包括高热、
咳嗽、呼吸困难、鼻涕、眼睛发红、腹泻等。

为了及早发现和诊断
禽流感病例，国家制定了一系列的禽流感诊断标准，以确保病例得
到及时处理和控制。

以下是关于禽流感诊断标准的详细内容：
1. 临床表现：
- 病鸟出现高热（体温超过40℃）；
- 呼吸道症状，如咳嗽、喘息、呼吸困难等；
- 眼睛发红、流泪、眼结膜充血；
- 鼻涕、喷嚏、打喷嚏；
- 腹泻、食欲不振、体重下降。

2. 流行病学史：
- 病鸟与禽流感病毒感染源（如感染禽类或野禽）有接触史； - 病鸟与禽流感病例有密切接触史；
- 病鸟所在地区有禽流感疫情。

3. 实验室检测：
- 采集病鸟的呼吸道分泌物、血液或组织样本；
- 使用特定的禽流感病毒检测方法，如PCR（聚合酶链反应）或病毒分离；
- 检测结果显示禽流感病毒的阳性。

4. 病理学检查：
- 对于因禽流感死亡的禽鸟，进行病理学检查；
- 发现典型的病理变化，如肺部出血、肺炎、肠道炎症等。

5. 疫情调查：
- 对病例进行流行病学调查，包括病鸟的饲养环境、接触史、传播途径等；
- 对疫情进行监测和报告。

以上是关于禽流感诊断标准的详细内容，国家制定这些标准是
为了确保禽流感病例能够及时诊断和控制，防止疫情扩散。

如果发
现禽流感症状或有相关流行病学史，建议立即向当地卫生部门报告，并采取适当的防控措施。

甲型/乙型流感病毒实验室活动风险评估报告一、生物学特征（一）种类和分型流行性感冒病毒（influenza virus），是正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的代表种，简称流感病毒，包括人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，是流行性感冒（流感）的病原体。

其中甲型流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行。

例如1918～1919年的大流行中，全世界至少有2000万～4000万人死于流感；乙型流感病毒对人类致病性也比较强，但是人们还没有发现乙型流感病毒引起过世界性大流行；丙型流感病毒只引起人类不明显的或轻微的上呼吸道感染，很少造成流行。

甲型流感病毒于1933年分离成功，乙型流感病毒于1940年获得，丙型流感病毒直到1949年才成功分离。

流感分类根据流感病毒感染的对象，可以将病毒分为人类流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒以及禽流感病毒等类群，其中人类流感病毒根据其核蛋白的抗原性可以分为三类:甲型流感病毒（Influenza A virus），又称A型流感病毒乙型流感病毒（Influenza B virus），又称B型流感病毒丙型流感病毒（Influenza C virus），又称C型流感病毒感染鸟类、猪等其他动物的流感病毒，其核蛋白的抗原性与人甲型流感病毒相同，但是由于甲型、乙型和丙型流感病毒的分类只是针对人流感病毒的，因此通常不将禽流感病毒等非人类宿主的流感病毒称作甲型流感病毒。

在核蛋白抗原性的基础上，流感病毒还根据血凝素HA和神经氨酸酶NA的抗原性分为不同的亚型。

（二）形态结构流感病毒呈球形，新分离的毒株则多呈丝状，其直径在80至120纳米之间，丝状流感病毒的长度可达4000纳米。

流感病毒结构自外而内可分为包膜、基质蛋白以及核心三部分。

病毒的核心包含了存贮病毒信息的遗传物质以及复制这些信息必须的酶。

流感病毒的遗传物质是单股负链RNA，简写为ss-RNA，ss-RNA与核蛋白 (NP)相结合，缠绕成核糖核蛋白体 (RNP)，以密度极高的形式存在。

1. 范围适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离和鉴定。

2. MDCK细胞培养程序2.1 生物安全要求MDCK细胞培养实验室生物安全级别：BSL-2 ，所有操作必须在BSL-2实验室的生物安全柜里进行。

2.2 材料2.2.1 生长成片的MDCK细胞2.2.2 无菌的T25细胞培养瓶2.2.3 D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）2.2.4 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃2.2.5 HEPES缓冲液，1M母液2.2.6 胎牛血清2.2.7 EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃2.2.8 7.5%牛血清白蛋白组分V2.2.9 1mL、10mL无菌移液管2.2.10 70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。

2.3 实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。

如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。

2.3.1 D-MEM培养液的准备500mL D-MEM液中加入：a）青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素）。

b）7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL（终浓度：0.2%）。

c）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。

2.3.2 细胞生长液的准备胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。

2.3.3 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。

2.3.4 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。

然后用移液管吸去EDTA胰酶。

2.3.5 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。

2.3.6 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。

吉林省2023—2023年流感病毒监测结果分析吉林省2023—2023年流感病毒监测结果分析随着世界经济和人口的不断增长以及国际交往的不断加强，流感等传染病的爆发和流行已成为全球关注的重要问题。

吉林省流感病毒监测是为了在全省范围内精密监测流感相关病毒的动态变化和流行趋势。

针对吉林省2023—2023年的流感病毒监测，本文将基于相关数据进行分析。

一、监测方法吉林省流感病毒监测体系主要由两个方面组成：标本采集和实验室检测。

标本采集方面包括呼吸道标本、血清等，实验室检测方面针对采集样本分别分离、鉴定和确认病毒种类及亚型。

2023年到2023年，吉林省流感病毒监测工作从年初开始，全省各级疾控中心和医院、各级疾病预防控制机构和疾病监测点，共计2023个，参与了流感病毒监测工作。

二、实验室检测结果2023年到2023年，吉林省共检测出流感病毒阳性标本12000余份，占检测总数的7%。

其中，甲型流感病毒样本共检测阳性9867份，占总阳性样本的82.2%；乙型流感病毒阳性样本共计2118份，占总阳性样本的17.8%。

而且在2023年，吉林省还注重了新型冠状病毒的监测管控，实验室检测结果显示，该病毒在吉林省未出现。

三、流感病毒感染趋势吉林省流感病毒监测数据显示，2023—2023年的流感病毒流行情况整体呈现斜升上升趋势，并在冬季高峰突出，与历年流行周期相似。

其中，甲型流感病毒感染人群主要为15~64岁的劳动力人口，而乙型流感病毒感染人群则以儿童和老年人为主，与其它流感季节相比，感染人数略有下降。

而且在针对性流感疫苗接种人群中，2023年接种率有所提高。

四、流感病毒变异情况与往年相比，2023—2023年的流感病毒变异较小且变异型谱广泛，主要为A/H1N1pdm09和A/H3N2、B/Victoria和B/Yamagata四个亚型，其中A/H1N1pdm09和A/H3N2两个亚型所占比例相对较高。

吉林省流感病毒监测结果提示，目前在吉林省尚未出现变异亚型毒株，在全球范围内变异亚型病毒影响不断扩大，此对流感疫苗的研发提出了新挑战。

流感诊断方案流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，具有较强的传染性和季节性特点。

为了准确迅速地进行流感的诊断，以下是一份流感诊断方案，供临床医生参考。

一、病史询问在进行流感的诊断前，医生首先应该详细询问患者的病史，包括以下内容：1. 症状的起始时间：了解患者的起病时间，对于判断是否是流感以及流感的阶段具有重要意义。

2. 症状的具体表现：询问患者出现的症状，如发热、咳嗽、咽痛、头痛、肌肉酸痛等，并记录下症状的持续时间和严重程度。

3. 是否有接触流感患者的史：尤其关注患者是否有与确诊的流感患者或疑似流感患者有密切接触的史。

二、体格检查在病史询问之后，医生需要进行一系列的体格检查，包括以下方面：1. 测量体温：流感的主要临床表现之一是发热，因此医生应使用准确的体温计对患者进行体温测量。

2. 观察呼吸道症状：医生应仔细观察患者的呼吸状态，了解有无咳嗽、咽部炎症等症状。

3. 检查淋巴结：医生可以通过触诊患者的淋巴结，了解有无肿大。

三、辅助检查为了进一步明确诊断，医生可以进行以下辅助检查：1. 实验室检查：a. 呼吸道样本检测：通过采集患者的咽拭子或鼻拭子等样本，利用PCR技术检测流感病毒的核酸，以确认流感的诊断。

b. 血液检查：包括白细胞计数、C-反应蛋白（CRP）等指标的检测，有助于评估炎症的情况。

四、临床诊断标准在病史询问、体格检查和辅助检查等综合分析的基础上，医生可以根据以下临床诊断标准进行判断：1. 流感样病例：患者具有流感的典型症状（如发热、咳嗽等）且有流感病毒感染的流行病学史。

2. 确认病例：患者的病原学实验室检测结果为流感病毒核酸阳性。

五、鉴别诊断在流感的诊断过程中，医生还需要进行鉴别诊断，以排除其他与流感具有相似症状的疾病，如普通感冒、鼻咽癌等。

此时，医生可根据患者的具体表现和实验室检查结果，综合判断来进行鉴别诊断。

六、治疗建议对于被诊断为流感的患者，医生应根据患者的具体情况提出相应的治疗建议，包括以下内容：1. 给予症状缓解治疗：根据患者的临床症状，可以考虑给予发热、咳嗽等症状的缓解药物。

流感样病例判断标准一、什么是流感样病例？流感样病例是指与流感病毒感染相关的疾病症状。

在临床上，流感样病例通常表现为发热、咳嗽、喉咙痛、鼻塞、流涕等呼吸道症状。

此外，也可能出现全身不适、乏力、肌肉疼痛、头痛等症状。

流感样病例具有传染性，可以通过飞沫传播给他人。

二、流感样病例判断标准根据世界卫生组织和国家卫健委的指南，以下是流感样病例的判断标准：1. 发热患者体温超过38℃，通常是突然起病的。

2. 呼吸道症状患者出现咳嗽、喉咙痛、鼻塞、流涕等呼吸道症状。

3. 全身不适患者感到乏力、肌肉疼痛、头痛等全身不适症状。

4. 流感流行季节发病流感通常在寒冷的季节更容易发病，特别是在冬季流感流行季节。

5. 接触史患者是否接触过流感病毒感染的人群，比如家庭成员、同事、朋友等。

6. 流感病毒检测结果通过采集患者鼻咽部或咽拭子样本进行实验室检测，能够检测到流感病毒核酸。

三、流感样病例的诊断流程在医疗机构中，对于怀疑流感样病例的患者，通常需要进行以下步骤来进行诊断：1. 病史询问医生会询问患者的病史，包括发病时间、症状持续时间、接触史等。

2. 体格检查医生会对患者进行体格检查，包括测量体温、听诊呼吸音、观察喉咙状况等。

3. 实验室检查医生可能会采集患者的鼻咽部或咽拭子样本，送往实验室进行流感病毒核酸检测。

4. 影像学检查在一些特殊情况下，医生可能会建议进行胸部X光或CT等影像学检查来排除其他呼吸道感染。

四、流感样病例的治疗与预防1. 治疗方法针对流感样病例，通常采取以下治疗方法：•对于轻型流感样病例，通常建议休息、补充水分、适度运动，辅助治疗如清热解毒药物、退烧药等。

•对于重症或疑似重症患者，可能需要住院治疗，采取抗病毒药物治疗、氧疗等。

•在治疗过程中，医生也会根据患者的具体情况进行个体化治疗。

2. 预防措施流感的传播主要通过飞沫传播，因此采取以下预防措施可以有效减少流感的传播：•注重个人卫生习惯，比如勤洗手、正确使用口罩等。

流行性感冒（以下简称流感）是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，在世界范围内引起暴发和流行。

流感起病急，虽然大多为自限性，但部分因出现肺炎等并发症可发展至重症流感，少数重症病例病情进展快，可因急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和/或多脏器衰竭而死亡。

重症流感主要发生在老年人、年幼儿童、孕产妇或有慢性基础疾病者等高危人群，亦可发生在一般人群。

2017年入冬以来，我国南北方省份流感活动水平上升较快，当前处于冬季流感流行高峰水平。

全国流感监测结果显示，流感样病例就诊百分比和流感病毒检测阳性率均显著高于过去三年同期水平，流感活动水平仍呈现上升态势，本次冬季流感活动强度要强于往年。

为进一步规范和加强流感的临床管理，减少重症流感发生、降低病死率，在《甲型H1N1流感诊疗方案（2009年第三版）》和《流行性感冒诊断与治疗指南（2011年版）》的基础上，结合近期国内外研究成果及我国既往流感诊疗经验，制定本诊疗方案。

1、病原学流感病毒属于正粘病毒科，为RNA病毒。

根据核蛋白和基质蛋白分为甲、乙、丙、丁四型。

目前感染人的主要是甲型流感病毒中的H1N1、H3N2亚型及乙型流感病毒中的Victoria和Yamagata系。

流感病毒对乙醇、碘伏、碘酊等常用消毒剂敏感；对紫外线和热敏感，56℃条件下30分钟可灭活。

2、流行病学（一）传染源流感患者和隐性感染者是流感的主要传染源。

从潜伏期末到急性期都有传染性。

受感染动物也可成为传染源，人感染来源动物的流感病例在近距离密切接触可发生有限传播。

病毒在人呼吸道分泌物中一般持续排毒3-6天，婴幼儿、免疫功能受损患者排毒时间可超过1周，人感染H5N1/H7N9病例排毒可达1～3周。

（二）传播途径流感主要通过打喷嚏和咳嗽等飞沫传播，也可经口腔、鼻腔、眼睛等黏膜直接或间接接触传播。

接触被病毒污染的物品也可引起感染。

人感染禽流感主要是通过直接接触受感染的动物或受污染的环境而获得。

（三）易感人群人群普遍易感。

甲型流感的临床表现与诊断方法甲型流感是一种由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其临床表现与诊断方法在医学界受到广泛关注。

本文将探讨甲型流感的典型症状以及医生常用的诊断方法，以提高对该疾病的认识和早期诊断的准确性。

一、临床表现甲型流感的临床表现与其他上呼吸道感染有许多相似之处，但也存在一些特殊症状，主要包括以下几个方面：1. 突发高热：患者常在短时间内出现高热，体温可达39-40摄氏度，热度持续时间较长。

2. 干咳喉痛：患者常出现干咳、喉痛等呼吸道症状，咳嗽剧烈，可伴有胸闷、气促等。

3. 全身症状：患者可能出现全身不适、乏力、肌肉酸痛和头痛等症状，食欲减退，容易出现体重下降。

4. 鼻塞流涕：部分患者可能会出现鼻塞、流涕等类似于感冒的上呼吸道症状。

5. 消化系统症状：一些患者在发病初期可能会出现恶心、呕吐、腹泻等消化系统症状。

二、诊断方法针对甲型流感的诊断，医生通常会采用多种方法进行综合分析，确保准确诊断并及时给予患者治疗。

以下是常用的一些甲型流感的诊断方法：1. 临床症状评估：医生会通过详细了解患者的病史和主诉，观察患者的体温、咳嗽、呼吸和其他症状，根据甲型流感的临床特点来初步判断是否可能患上该病。

2. 实验室检查：医生会采集患者的咽拭子或其他呼吸道样本，进行实验室检查，主要通过PCR技术检测流感病毒核酸，确认是否感染甲型流感病毒。

3. 快速诊断试剂盒：医生也可以使用快速诊断试剂盒来快速初步判断患者是否感染甲型流感病毒。

这种方法简便、快速，但准确性相对较低。

4. 血清学检测：医生可通过血清学检测来发现患者体内抗体的产生情况，进一步确认甲型流感的感染。

5. 影像学检查：在某些情况下，医生可能会进行胸部X光或CT扫描等影像学检查，以排除其他肺部疾病，并评估并发症的情况。

三、预防措施甲型流感的传播速度快，患者密切接触者易受感染。

因此，预防措施尤为重要。

以下是一些常用的预防措施：1. 接种疫苗：及时接种针对甲型流感的疫苗是有效预防的最佳方法。

2024甲/乙型流感病毒抗原检测（附方法的局限性）检测适应征：流感是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，一般表现为发热，伴畏寒、寒战、头痛、肌肉、关节酸痛、极度乏力、食欲减退等全身症状，常有咽痛、咳嗽，可有鼻塞、流涕、胸骨后不适、颜面潮红、结膜轻度充血，也可有呕吐、腹泻等症状。

检测标本采集：1、鼻腔分泌物采集:收集鼻腔分泌物时,将拭子插入鼻腔中分泌物最多处，轻轻转动并向鼻腔内部推动拭子，直至鼻甲（离鼻孔约2.0-2.5Cm）受阻处,贴鼻腔壁旋转拭子三次,取出拭子。

2、咽喉分泌物采集:将拭子从口腔完全插入咽喉中，以咽喉壁、上颗扁桃体的发红部位为中心，适度用力擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，应避免触及舌部，取出拭子。

检测方法：胶体金标记免疫层析法检测结果的解释与建议:1.如果鼻咽拭子结果是阴性的，然而患者的临床表现非常像，这时候还不能完全排除流感，这时候就需要临床医生结合症状、体征、病史、其它实验室检查等，判断是否需要用药。

2.对临床诊断病例和确诊病例应尽早隔离治疗。

3.住院治疗标准(满足下列标准1条或［条以上)(1)妊娠中晚期妇女。

(2)基础疾病明显加重，如慢性阻塞性肺疾病、糖尿病、慢性心功能不全。

慢性肾功能不全、肝硬化等。

(3)符合重症或危重流感诊断标准。

(4)伴有器官功能障碍。

4.非住院患者居家隔离，保持房间通风。

充分休息，多饮水，饮食应当易于消化和富有营养。

密切观察病情变化，尤其是儿童和老年患者。

5.流感病毒感染高危人群容易引发重症流感，尽早抗病毒治疗可减轻流感症状,缩短流感病程，降低重症流感的病死率。

6.避免盲目或不恰当使用抗菌药物。

仅在流感继发细菌性肺炎、中耳炎和鼻窦炎等时才有使用抗生素的指征。

7.儿童忌用阿司匹林或含阿司匹林药物以及其他水杨酸制剂。

检测方法的局限性:1∙测试的准确性取决于采集样本过程，样本采集不当会影响检测结果，如临床怀疑为流感，而咽拭子抗原阴性，必须再次复查，排除取材不到位2.采集的样本若存在个别药物如高浓度的非处方药和处方药（鼻腔喷雾剂）会干扰结果。

流感病毒分离标准操作规程(SOP)病毒分离分离病毒是诊断病毒性疾病最常用，并且高度敏感的方法之一。

分离出的病毒须经免疫学、基因分析或电子显微镜等进一步鉴定确诊。

病毒可长期保存，亦可用来作抗原性、基因特性或药物敏感性等分析。

病毒分离亦受一定限制。

目前用于分离病毒的组织细胞种类有限，每种细胞只能用来分离培养一或数种病毒。

MDCK（狗肾细胞）是目前用于分离培养流感病毒最常用的细胞系。

分离流感病毒最常用的活体是鸡胚，目前有些实验室用MDCK细胞代替鸡胚分离培养流感病毒。

由于MDCK细胞属肿瘤细胞系，故用该细胞分离的病毒不能用于疫苗生产。

各实验室应同时采用鸡胚和MDCK两种方法分离病毒，不应放弃用鸡胚分离病毒的方法。

流感病毒细胞分离标准操作规程材料：1、细胞瓶或细胞管培养成片的MDCK细胞2、TPCK处理胰酶（牛胰腺来源XIII型）Sigma Cat. # T-86423、HEPES 缓冲液, 1 M 母液GIBCO BRL Cat. # 15630-0234、D-MEM培养基，GIBCO BRL Cat. # 11965-0925、青、链霉素母液(10,000 U/ml 青霉素G; 10,000 µg/ml 硫酸链霉素) ，GIBCO BRL Cat. # 15140-0236、牛血清白蛋白组分V, 7.5%溶液，GIBCO BRL Cat. # 15260-0117、放置于2ml wheaton 小瓶中的临床样品8、T-25培养瓶用于病毒培养，（组织培养管也可被应用，若样本量大的话应选用培养瓶，细胞数量按规定调整。

）9、1ml 滴管10、10ml 滴管培养基和试剂的准备：（建议：要求经常检查试剂使用的有效期）500 ml D-MEM液中加入：青、链霉素母液5 ml (终浓度达: 100 U/ml 青霉素and 100 µg/ml 链霉素)牛血清白蛋白12.5 ml (终浓度: 0.2 %)HEPES缓冲液12.5 ml (终浓度: 25 mM)病毒生长液：每500毫升不含血清的D-MEM液之中加0.5 ml of TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/ml ）使TPCK-胰酶的浓度为2 µg/ml。

禽流感（avian influenza ，AI ）是由正粘病毒科、流感病毒属A 型流感病毒引起的禽类（家禽或野禽，以及部分哺乳动物）传染病[1]。

禽流感病毒血清亚型众多，抗原变异性强，宿主范围广泛，亚型间无交叉保护性，使得禽流感频繁暴发，成为养禽业的一大毁灭性疫病。

尤其是高致病性禽流感，是OIE 规定的法定报告A 类动物疫病[2]。

禽流感病毒在流行的过程中不断变异，跨越宿主屏障，H5N1亚型禽流感病毒和H7N9亚型禽流感病毒屡次暴发疫情，给养禽业和人类的生命安全带来巨大的威胁。

H9亚型禽流感病毒并未被规定为高致病性禽流感，往往被人们所忽视，从而造成了以H9亚型为主的低致病性禽流感的大范围流行和对养禽业产生持续危害。

此外，有研究显示H9N2亚型禽流感病毒在全世界范围内广泛传播的同时也以重配的方式产生新型禽流感病毒[3,4]。

目前国内外检测禽流感病毒最常用和经典的方法是鸡胚病毒分离，并且是国际贸易中指定的检测方法，但该方法技术要求高、耗费时间长，在疫情暴发时不利于病原的快速诊断和疫情控制。

以分子生物学技术为基础的荧光PCR 方法已成为病原核酸检测的主要方法，目前市场的禽流感病毒检测手段多以单重RT-PCR 为主，不能区分具体亚型，但在平时疫情检测和实施扑灭措施时对这些病毒亚型进行快速检测和定型非常重要。

本研究基于Taq-Man-MGB 荧光RT-PCR 技术建立一种禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR 检测方法，能够在一次反应中对样本中的病毒进行快速定型，满足准确、快速的检测需求。

1材料与方法1.1质粒样品携带禽流感病毒H5亚型、H7亚型、H9亚型HA2靶基因序列片段重组质粒pUC57-AIV-H579，浓度为104copies/μL 。

1.2禽流感病毒核酸样品禽流感病毒H5亚型核酸样品15份、禽流感病毒H7亚型核酸样品15份、禽流感病毒H9亚型核酸样品15份，禽流感病毒阴性核酸样本30份，由扬州大学禽流感病毒专业实验室分离、鉴定、保存和提供。