小鼠原代骨髓细胞提取及诱导骨髓来源的巨噬细胞分化方法(详细版)

巨噬细胞的培养方法
巨噬细胞的培养方法如下：
1. 获取巨噬细胞：常用的来源包括小鼠、人类等。

可以通过小鼠或者人类的骨髓、外周血或者器官（例如脾脏、肺）中分离巨噬细胞。

2. 细胞培养基的准备：常用的细胞培养基包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）等。

细胞培养基需要加入适量的无菌胎牛血清（FBS）或者人工合成的替代物，例如脂质体。

3. 细胞的分离：将获得的组织样本经过适当的处理，例如组织碎片化、酶消化等，使细胞释放出来。

4. 细胞的培养：将分离得到的巨噬细胞悬浮于细胞培养基中，通过离心将巨噬细胞沉淀在培养皿的底部。

5. 进一步培养：将巨噬细胞培养在37C的恒温培养箱中，提供合适的氧气和二氧化碳浓度，适当转移和补充新鲜的培养基。

6. 细胞的检测和分离：通过显微镜观察巨噬细胞的形态和数量，也可以使用流式细胞仪等方法对细胞进行检测和分析。

这些是常规的巨噬细胞培养方法，具体操作细节可能根据实验目的和细胞来源的不同而有所变化。

一、实验材料准备1. 动物：各个品系的小鼠2-4只。

2. 试剂：RPMI1640培养基(含酚红)，小牛血清，双抗，培养液(10%小牛血清、RPMI1640、双抗)，台盼兰等。

碘酒绵球和酒精绵球。

3. 器械：一次性注射器、手术器械。

二、实验方法如果采用刺激物，则可在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2 mL，获得的巨噬细胞数要多一些。

不采用刺激物，直接开始下面的步骤。

1. 拉颈处死小鼠，在75%酒精浸泡1-2分钟，移入超净台中，仰卧位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮肤，酒精绵球脱碘。

用手术直剪充分剪开腹部皮肤，暴露腹部肌层，再用酒精绵球消毒腹部肌层。

2. 用注射器抽取5 mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1-2 min，然后，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中(个人认为，此法比用注射器抽吸好一些)。

3. 1 000 rpm离心5 min后，用含双抗的RPMI1640培养基洗涤一次，再次离心，重悬细胞于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，如果是作为饲养细胞使用，则选择相应的培养液。

台盼蓝拒染法计数，将细胞稀释到目的浓度后，接种即可。

4. 如果是作为饲养细胞使用，调整浓度至2x105个/mL，接种到96孔板中，每孔100-200 μL；如果作为其它实验使用，可以调整成2x106/mL，加到24孔平底培养板中，1 mL/孔；5% CO2温箱孵育2 h后，换液，并用RPMI1640培养基洗1-2次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为单层的巨噬细胞。

用4度遇冷的1640培养基做，细胞在外面一直放在冰里。

三、结果巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。

巨噬细胞有吞噬的特性，当与细菌混合在一起的时候，在40倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌，因此，巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。

小鼠原代腹腔巨噬细胞提取方法（超详细）
实验前准备：
超净工作台、水平式低速离心机、10ml离心管、2.5mL注射器、细胞吸管、3％肉汤淀粉溶液、无菌眼科剪、无菌眼科镊、75％酒精溶液、无菌PBS溶液、DMEM细胞培养基、胎牛血清、细胞计数版、倒置显微镜等。

实验操作步骤
（1）我们对健康雄性C57BL/6小鼠腹腔注射3％肉汤淀粉溶液1 mL，持续3d，以便刺激腹腔巨噬细胞产生。

注：3％肉汤淀粉溶液提前配制，高温除菌后使用。

（2）小鼠颈椎脱臼处死，用75％酒精溶液对其充分消毒。

（3）固定小鼠，暴露腹腔。

（4）无菌条件下用剪刀沿腹中线剪开皮肤，暴露腹膜，切记勿伤及腹膜壁。

（5）向腹膜腔注射DMEM培养基3mL，并轻柔小鼠腹部片刻。

（6）用吸管反复冲洗腹膜腔并回收灌洗液。

（7）移入无菌的10ml的离心管中，以1000r/min，离心 5min，弃上清液。

（8）加入 5ml DMEM 培养基重悬细胞，上述步骤重复两次。

（9）加入含有10% FBS的DMEM培养液重悬细胞，细胞计数，调整细胞浓度为1×106 个/mL。

（10）将细胞悬液接种于 6 孔培养板中，放于37℃、5％二氧化碳
饱培养箱中培养，待后续实验研究。

小鼠骨髓细胞的提取1、脱臼处死小鼠，投入到装有75%酒精的烧杯中浸泡3-5分钟，把小鼠拿到细胞房。

2、用保鲜袋平铺在安全柜内，并将小鼠放置在保鲜袋上进行实验操作。

3、用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。

4、小心剥离下肢的肌肉，取下胫骨和股骨，并放到装有75%酒精的培养皿中。

5、把小鼠尸体拿出，清理干净安全柜，换上新的手套。

6、拿5ml和20ml的无菌注射器各一支，用20ml的注射器吸取已配好的1640，换装一个5ml注射器的针头。

轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌50ml离心管，将细胞冲出。

7、将骨髓细胞都冲出来后，4300rpm离心5分钟，去上清。

8、加进3-4ml的红细胞裂解液静置3-4min以裂解红细胞，加入30-40ml无菌的PBS（按加入红细胞裂解液与PBS间1:9的比例加入PBS）。

9、将含BM细胞的混合液通过细胞筛过滤到新的50ml离心管中。

10、4300rpm离心5min，弃上清，得到骨髓细胞沉淀。

骨髓细胞的培养1、加入一定量的GEBICO原装的1640，吹匀细胞沉淀，然后用计数板计数BM细胞的总数。

2、按照24孔板每个孔2-2.5million的细胞数来铺孔，算出要铺孔的数目。

3、根据每个孔需要2ml的培养基，可以算出所需培养基的总体积。

4、培养BM细胞的培养基是按照90% GEBICO原装的1640、10%FBS、1%双抗、1‰β-ME和万分之二的GM-CSF来配成。

5、细胞跟培养基充分混匀后，把细胞混合液铺倒24孔板中培养。

注意：1、一定要注意整个过程都要在无菌环境下操作，一切用品都要保证无菌。

2、剥离骨头时一定要保持骨头的完整，小心不要剪断。

3、培养基和PBS一定要各自分装好标清楚，自己用自己的，避免交叉污染。

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小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代之flamerking图文版[精华]很多战友发email或PM向我询问小鼠MSC的培养方法，我零零散散地一个个回复过几次，由于我平时时间不是很多，所以回答地时候有些内容写的不是很详细。

今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。

看来做小鼠MSC的战友越来越多。

一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。

其实我小鼠MSC在我的课题中不是主角，只是起一个control的作用，因此我在这方面的经验可能没有一些专门做小鼠MSC的战友丰富，不过我还是很愿意把我的经验写出来供大家参考，希望能够起到“抛砖引玉”的作用。

欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。

提纲一，简版主要步骤及操作要点。

二，完整版1. 试剂及材料准备2. 动物手术及取材3. 原代细胞培养4. 细胞传代5. 讨论时间关系，今天先给个简版。

我先顶一下,由于我还是新手,故不能说是经验介绍,只好讲让你们指出缺点,谢谢斑竹1. 试剂及材料准备MEM,10%FCS,手术器械,培养瓶,200目滤网,5ml注射器2. 动物手术及取材CR小鼠1只,酒精浸泡5分钟,取股,胫,肱骨,用基培冲出骨髓,滤过,1000转离心,完培重悬,接种于25厘米培养瓶3. 原代细胞培养:,3天后首次换液,自己发现一周贴壁细胞就铺满达90%,自行传代4. 细胞传代:消化下来很少,能下来的增长很慢5. 讨论:没经验欢迎斑竹的继续讲解,希望有经验的老师们能不啬指教羽之无限版主,能有空再讲讲吗这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代真是天天盼着你啊呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。

……呵呵，跑题了。

一、从小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分离巨噬细胞1．取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。

腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或4％淀粉肉汤。

3～4天以后收集腹腔细胞。

2．如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从这一步开始。

放血处死动物，以减少腹腔中的红细胞。

消毒腹部，沿腹中线注入3～4ml（豚鼠20～40ml，家兔50～70ml）冰中预冷的无菌PBS-H（含10U/ml肝素和10％小牛血清的PBS）。

轻轻按摩腹部5分钟。

3．以下均无菌操作。

剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H冲洗腹腔2～3次。

合并渗出液于离心管中，4℃离心250×g 10分钟，去上清液。

4．用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次4℃离心250×g 10分钟，去上清液。

用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力。

二、家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化1．取2～3公斤重的家兔，耳缘静脉注射10ml空气处死动物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉动物。

仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。

以下过程注意无菌操作。

小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。

用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。

2．分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。

向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。

用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。

再用同样方法，用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。

3．分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI-1640培养液的平皿中。

平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。

一、实验目的1. 了解巨噬细胞的生物学特性及其在免疫反应中的作用。

2. 掌握巨噬细胞的诱导方法及实验操作技术。

3. 观察巨噬细胞的吞噬功能，评估其免疫活性。

二、实验原理巨噬细胞是一种具有吞噬功能的免疫细胞，主要来源于骨髓中的单核细胞。

在体外实验中，通过诱导剂如脂多糖（LPS）等刺激单核细胞分化为巨噬细胞。

巨噬细胞在免疫反应中发挥重要作用，如吞噬、活化T细胞、分泌细胞因子等。

本实验旨在通过诱导单核细胞分化为巨噬细胞，观察其吞噬功能，评估其免疫活性。

三、实验材料1. 实验动物：昆明小鼠2. 试剂与耗材：胎牛血清（FBS）、RPMI-1640培养基、LPS、PBS、无菌操作台、超净工作台、显微镜、细胞培养皿、移液器、细胞计数板等。

四、实验方法1. 诱导巨噬细胞：取昆明小鼠，无菌操作下取脾脏，制成单核细胞悬液。

加入RPMI-1640培养基，调整细胞浓度为1×10^6/ml。

将细胞悬液加入培养皿中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24小时。

2. 诱导分化：向培养皿中加入适量LPS，使终浓度为10μg/ml。

继续培养24小时，使单核细胞分化为巨噬细胞。

3. 巨噬细胞培养：将诱导后的细胞悬液转入新的培养皿中，加入FBS至10%，继续培养24小时。

4. 巨噬细胞吞噬实验：取鸡红细胞，用生理盐水洗涤后制成红细胞悬液。

将鸡红细胞悬液与巨噬细胞悬液按一定比例混合，置于37℃、5%CO2培养箱中培养30分钟。

5. 吞噬实验观察：取出培养皿，加入适量的戊二醛固定细胞，用PBS洗涤。

在高倍显微镜下观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的情况，计数吞噬细胞数量。

五、实验结果1. 巨噬细胞形态：诱导后的细胞呈圆形或多边形，细胞质丰富，细胞核明显。

2. 吞噬实验结果：在高倍显微镜下观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象，吞噬细胞数量与对照相比明显增加。

六、实验分析本实验成功诱导了小鼠脾脏单核细胞分化为巨噬细胞，并观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象。

原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，广泛应用于组织工程、再生医学等领域。

原代骨髓间充质干细胞的分离和提取是进行相关研究的基础。

本文将详细介绍原代骨髓间充质干细胞的分离及提取方法。

一、实验材料1.骨髓样本：取自健康志愿者或实验动物（如大鼠、小鼠等）。

2.PBS缓冲液：磷酸盐缓冲液，用于细胞洗涤和分离。

3.胎牛血清：用于细胞培养。

4.抗生素：如青霉素和链霉素，用于细胞培养液中，防止细菌感染。

5.细胞分离液：如Ficoll分离液、Percoll分离液等。

6.细胞培养瓶、离心管、移液器等实验室常用器材。

二、分离方法1.骨髓样本采集：在无菌条件下，从志愿者或实验动物体内抽取骨髓，置于含有抗凝剂的离心管中。

2.骨髓细胞分离：将骨髓样本用PBS缓冲液稀释，然后缓慢加入细胞分离液，进行密度梯度离心。

离心后，收集界面层的细胞，即含有骨髓间充质干细胞的一层。

3.细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的分离液和红细胞。

4.细胞计数：用细胞计数板对洗涤后的细胞进行计数，调整细胞浓度为合适的值。

5.细胞接种：将细胞接种于含有胎牛血清和抗生素的细胞培养液中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。

三、提取方法1.原代培养：将分离得到的骨髓间充质干细胞进行原代培养，待细胞生长至80%-90%汇合时，进行传代。

2.传代培养：将原代细胞用胰蛋白酶消化，然后按照1:2或1:3的比例进行传代。

传代后的细胞继续培养至所需细胞量。

3.细胞冻存：将提取得到的骨髓间充质干细胞进行冻存，以备后续实验使用。

4.细胞复苏：将冻存的细胞在37℃水浴中快速融化，然后用细胞培养液重悬，继续培养。

四、注意事项1.在实验过程中，严格遵循无菌操作原则，防止细胞污染。

2.骨髓样本的采集和处理应在抗凝条件下进行，以保持细胞活性。

3.选择合适的细胞分离液和离心条件，以提高骨髓间充质干细胞的分离纯度。

小鼠骨髓细胞提取及培养小鼠骨髓细胞的提取1、脱臼处死小鼠，投入到装有75%酒精的烧杯中浸泡3-5分钟，把小鼠拿到细胞房。

2、用保鲜袋平铺在安全柜内，并将小鼠放置在保鲜袋上进行实验操作。

3、用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。

4、小心剥离下肢的肌肉，取下胫骨和股骨，并放到装有75%酒精的培养皿中。

5、把小鼠尸体拿出，清理干净安全柜，换上新的手套。

6、拿5ml和20ml的无菌注射器各一支，用20ml的注射器吸取已配好的1640，换装一个5ml注射器的针头。

轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌50ml离心管，将细胞冲出。

7、将骨髓细胞都冲出来后，4300rpm离心5分钟，去上清。

8、加进3-4ml的红细胞裂解液静置3-4min以裂解红细胞，加入30-40ml无菌的PBS（按加入红细胞裂解液与PBS间1:9的比例加入PBS）。

9、将含BM细胞的混合液通过细胞筛过滤到新的50ml离心管中。

10、4300rpm离心5min，弃上清，得到骨髓细胞沉淀。

骨髓细胞的培养1、加入一定量的GEBICO原装的1640，吹匀细胞沉淀，然后用计数板计数BM细胞的总数。

2、按照24孔板每个孔的细胞数来铺孔，算出要铺孔的数目。

3、根据每个孔需要2ml的培养基，可以算出所需培养基的总体积。

4、培养BM细胞的培养基是按照90% GEBICO原装的1640、10%FBS、1%双抗、1‰β-ME和万分之二的GM-CSF来配成。

5、细胞跟培养基充分混匀后，把细胞混合液铺倒24孔板中培养。

注意：1、一定要注意整个过程都要在无菌环境下操作，一切用品都要保证无菌。

2、剥离骨头时一定要保持骨头的完整，小心不要剪断。

3、培养基和PBS一定要各自分装好标清楚，自己用自己的，避免交叉污染。