小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的培养

树突状细胞培养方法树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）是一类免疫细胞，主要负责识别和激活T细胞，发挥着重要的免疫调节和抗肿瘤等作用。

为了进行树突状细胞的研究，科研人员需要对其进行体外培养。

本文将介绍常用的树突状细胞培养方法。

1.制备树突状细胞前驱细胞：树突状细胞前驱细胞主要存在于外周血和骨髓中。

首先，采集外周血或骨髓，并将其进行红细胞裂解。

然后，用PBS洗涤样品，离心沉淀细胞。

最后，将细胞进行培养。

2.培养基的选择：培养树突状细胞需要选择适宜的培养基。

目前常用的培养基有RPMI1640、DMEM等。

添加10-20%的胎牛血清（FBS）可以提供必要的生长因子和营养物质。

3.添加生长因子：在培养树突状细胞的过程中，可能需要添加一些生长因子来促进细胞的分化和增殖。

常见的生长因子包括GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）和IL-4（白细胞介素4）。

可以将这些生长因子添加到培养基中，以达到最佳生长条件。

4.细胞培养条件的控制：树突状细胞对培养条件非常敏感。

因此，需要对温度、湿度、CO2浓度等参数进行严格控制。

一般来说，将细胞培养在37摄氏度、5%CO2的培养箱中。

5.细胞的分离和传代：在树突状细胞培养过程中，细胞会不断增殖。

为了保证细胞的活力和稳定性，需要定期分离和传代细胞。

可以使用胰酶等消化酶将细胞从培养瓶中剥离，然后进行细胞计数并按照一定比例进行传代。

6.细胞质量的评估：在培养树突状细胞的过程中，需要对细胞质量进行评估。

可以通过使用流式细胞仪等设备来检测细胞表面标记物的表达情况，以及细胞活力、树突状突起的形态等指标来评估细胞的质量。

7.树突状细胞的激活：树突状细胞的主要功能是激活T细胞。

为了使树突状细胞具备充分的抗原递呈能力，可以使用多种促进细胞激活的方法，如脂多糖、TNF-α等。

总结：树突状细胞培养方法包括制备前驱细胞、培养基选择、生长因子添加、细胞培养条件控制、细胞分离和传代、细胞质量评估以及细胞的激活等步骤。

小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养1、取骨髓，对倍稀释2、用滴管沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液(45度角倾斜，尽量产生气泡，起到缓冲作用)3、2000转，离心30分钟4、吸取白膜层，（沿管壁）交替多次吸取，加入5倍体积以上的PBS液5、1500转，离心15分钟（洗掉血小板）6、弃掉上清，留少许回流液，轻弹管壁，加入PBS液至50ml7、800转，离心10分钟，（洗掉红细胞）8、重复两至三次9、加入PBS液至50ml，计数:？个细胞离心后铺板，1X1076孔板培养液，共铺20板。

无血清1640+DNA酶12h后轻晃培养液，洗板后加入完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) 10、第三天每孔补加等体积的完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) ，这时细胞部分悬浮11、第五天为imDC，+1LPS(1ug/ml),诱导至第七天，为mDC。

参考Inaba等人的方法，并根据本实验室的经验稍作改进。

即：1. 颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠，无菌状态下取股骨和胫骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。

2. 用1ml注射器吸取RPMI-1640培养液，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复4～6遍，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，离心，1500 rpm×10min。

3. 弃去上清，加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次离心，1500 rpm×5min，弃上清。

4. 用RPMI-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基悬浮，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完全培养基至4 ml，再加入rmGM-CSF至终浓度10 ng/ml，IL-4终浓度10ng/ml。

5. 将细胞培养板放入37℃，含5% CO2的孵箱中培养48小时。

6. 轻轻吹打细胞后，连同培养液一起吸去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞。

bmdc培养方法BMDC培养方法是一种常用的小鼠树突状细胞(Dendritic Cell, DC)培养方法，主要用于研究DC的功能和调控机制。

以下是关于BMDC 培养方法的详细介绍：1. 实验材料准备：小鼠骨髓细胞RPMI-1640培养基小鼠GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)和IL-4(白细胞介素-4)无菌培养箱、离心机、显微镜等实验设备2. BMDC的获取：从小鼠的股骨和胫骨中提取骨髓细胞，用RPMI-1640培养基洗涤并悬浮。

将骨髓细胞以1×10^6/mL的密度接种到无菌的培养瓶中，加入GM-CSF和IL-4，使其终浓度分别为50ng/mL和20ng/mL。

将培养瓶置于37℃，5%CO2的培养箱中，每两天更换一次培养基。

3. BMDC的成熟：在BMDC培养的第5天，用GM-CSF和IL-4继续诱导BMDC的成熟。

此时，GM-CSF的浓度可以降低至25ng/mL，而IL-4的浓度可以维持在20ng/mL。

在BMDC培养的第7天，观察BMDC的形态变化，成熟的BMDC 呈树突状，表面有丰富的毛刺状突起。

此时，可以收集成熟的BMDC 进行后续实验。

4. BMDC的功能检测：将成熟的BMDC与抗原提呈细胞(如B细胞、T细胞等)共培养，观察BMDC对抗原提呈细胞的激活作用。

将成熟的BMDC与特异性抗体结合，观察BMDC对抗原的识别和摄取能力。

将成熟的BMDC与免疫细胞(如T细胞、NK细胞等)共培养，观察BMDC对免疫细胞的调节作用。

5. BMDC的应用：用于研究DC的功能和调控机制，如DC的抗原提呈、共刺激信号传导、凋亡抑制等。

用于制备疫苗，通过激活T细胞和B细胞，提高机体对病原体的免疫力。

用于研究免疫耐受、自身免疫性疾病等疾病模型。

总之，BMDC培养方法是一种常用的小鼠树突状细胞培养方法，通过诱导骨髓细胞分化为成熟的树突状细胞，可以用于研究DC的功能和调控机制，以及制备疫苗等应用。

小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）培养小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养1、取骨髓，对倍稀释2、用滴管沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液(45度角倾斜，尽量产生气泡，起到缓冲作用)3、2000转，离心30分钟4、吸取白膜层，（沿管壁）交替多次吸取，加入5倍体积以上的PBS液5、1500转，离心15分钟（洗掉血小板）6、弃掉上清，留少许回流液，轻弹管壁，加入PBS液至50ml7、800转，离心10分钟，（洗掉红细胞）8、重复两至三次9、加入PBS液至50ml，计数:？个细胞离心后铺板，1X1076孔板培养液，共铺20板。

无血清1640+DNA酶12h后轻晃培养液，洗板后加入完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) 10、第三天每孔补加等体积的完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) ，这时细胞部分悬浮11、第五天为imDC，+1LPS(1ug/ml),诱导至第七天，为mDC。

参考Inaba等人的方法，并根据本实验室的经验稍作改进。

即：1. 颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠，无菌状态下取股骨和胫骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。

2. 用1ml注射器吸取RPMI-1640培养液，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复4～6遍，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，离心，1500 rpm×10min。

3. 弃去上清，加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次离心，1500 rpm×5min，弃上清。

4. 用RPMI-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基悬浮，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完全培养基至4 ml，再加入rmGM-CSF 至终浓度10 ng/ml，IL-4终浓度10ng/ml。

5. 将细胞培养板放入37℃，含5% CO2的孵箱中培养48小时。

小鼠骨髓源树突状细胞体外诱导培养及初步鉴定刘铮;代继宏;符州;冯琳琳【摘要】To establish a method of cultivation and purification of dendritic cells ( DC) from mouse bone marrow in vitro and observe their morphology, recombinant mouse granulocyte and macrophage colony stimulus factor( GM-CSF) and interleukin-4( IL4) induction were used to induce mouse bone marrow cells to form dendritic cells in vitro. After 9 days , the percentage of the cultured DCs was more than 80％ with typical morphology of DCs under light microscope. The mature cells had clear marker on their surface. This meant that these used substances could stimulate allogenic mixed lymphocyte proliferation.%用重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组小鼠白细胞介素4(rmIL-4)体外诱导小鼠骨髓细胞分化为树突状细胞,进行形态学变化观察,分析细胞表面分子,刺激T细胞增殖,探讨小鼠骨髓源树突状细胞(BMDC)体外诱导培养并进行初步鉴定.体外培养9d后BMDC可达80%以上m,光镜下可见典型的树突状细胞形态.清楚表达成熟期主要表面标志物,可显著刺激同种异体混合淋巴细胞增殖.获得了较高纯度的BMDC,避免了使用传统磁珠分离方法所带来的成本高,操作复杂,产出率低的弊端,为研究BMDC功能以及运用开展下游实验提供材料.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2011(028)002【总页数】4页(P25-27,31)【关键词】树突状细胞;体外诱导培养;初步鉴定【作者】刘铮;代继宏;符州;冯琳琳【作者单位】儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室重庆市(儿童发育重大疾病诊治与预防)国防科技合作基地;重庆医科大学附属儿童医院呼吸中心,重庆,400014;重庆医科大学附属儿童医院呼吸中心,重庆,400014;儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室重庆市(儿童发育重大疾病诊治与预防)国防科技合作基地【正文语种】中文【中图分类】Q813.5Abstract:To establish a method of cultivation and purification of dendritic cells(DC)from mouse bone marrow in vitro and observe theirmorphology,recombinantmouse granulocyte and macrophage colony stimulus factor(G M-CSF)and interleukin-4(I L4)induction were used to inducemouse bonemarrow cells to for m dendritic cells in vitro.After9 days,the percentage of the culturedDCswasmore than 80%with typicalmorphology ofDCs under lightmicroscope.The mature cells had clearmarker on their surface.Thismeant that these used substances could stimulate allogenic mixed lymphocyte proliferation.Keywords:dendritic cells;culture in vitro;initial appraisal树突状细胞(dendritic cell,DC)是一种专职性抗原提呈细胞,在肿瘤、抗感染免疫、移植排斥等方面起着关键的引导和调节作用,并能显著激活初始型 T淋巴细胞并诱导其增殖,处于免疫应答过程的中心环节。

2.2.4 小鼠骨髓源性树突状细胞的培养1）颈椎脱位法处死健康雄性4到6周龄的BABLIc小鼠，75％乙醇浸泡10分钟。

2）无菌条件下取双侧股骨、胫骨，剥离附着的肌肉软组织后浸泡在75%乙醇中2分钟。

RPMI1640冲洗，剪开骨的两端，1 ml 注射器抽取RPMI1640，分别从骨两端插入骨髓腔反复冲洗直至变白，RPMI1640清洗骨髓细胞后重悬。

3）在离心管中预先加入小鼠脾淋巴细胞分离液，将相同体积的骨髓细胞悬液小心加入淋巴细胞分离液上层，不打乱两层液体界面。

4）4℃，1500rpm离心7min后吸取中间白膜层，PBS清洗所获的单个核细胞。

5）BMDC完全培养液重悬后，以2×106每孔的浓度分种至6孔培养板中，每孔4ml完全培养基。

6）将细胞培养板放入37℃，含5%CO2的培养箱中培养6小时。

7）弯头滴管轻轻吹打，连同培养液一起弃去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞；加入新鲜完全培养基和500 U/ml的rmGM-CSF及rmIL-4继续培养。

8）隔日半量换液，补加相同浓度细胞因子，尽量保留悬浮细胞。

9）培养至第6天，轻轻吹打收集所有悬浮细胞，即为未成熟的BMDC。

10）诱导培养过程中每天观察细胞集落及形态变化并拍照。

11）流式检测所诱导的未成熟BMDC表面分子CD11c的表达以评估BMDC 的纯度。

收集培养至第6天的BMDC，PBS洗2次，1×106个细胞用冷的Buffer （PH7.2的PBS+150mMNacl+ 0.09%NaN3+0.2%BSA）100µL悬浮。

加入3µL FITC-CD11c，对照管加入PBS，4℃冰箱避光反应45min。

Buffer洗2次，弃上清，500µL 1%多聚甲醛固定。

送第四军医大学流式细胞室上机检测。

试验研究 | Experimental research0 引言1973年Steinman和Cohn首次分离出一类同巨噬细胞、粒细胞和淋巴细胞形态与功能不同的细胞，命名为树突状细胞(DCs)。

其主要来源是骨髓CD34+多能造血干细胞，是体内唯一能直接激活初始T细胞的抗原提呈细胞(APC)[1]，是机体免疫的始动者及固有免疫和适应性免疫的桥梁。

髓系树突状细胞通过血液与淋巴液从骨髓移动并分布到皮肤，后趋向淋巴组织启动免疫反应。

淋巴系树突状细胞是T细胞集聚区的固定哨兵，分布主要局限在胸腺髓质及淋巴结T细胞区，具有免疫调节和免疫耐受作用。

当抗原性物质侵入机体时，宿主体内的免疫系统会启动一系列免疫防卫机制识别并清除病原体，特异性免疫应答启动前，需要APC摄取、加工、处理抗原并将抗原信息提呈给免疫应答的淋巴细胞。

主要组织相容性复合物（MHC）是一段基因密度高的染色体区段，是一种复杂且多态性高的遗传系统。

主要存在2个途径即溶酶体途径（MHC-Ⅱ类途径）和胞质溶胶途径（MHC-Ⅰ类途径）。

另外，还存在MHC非依赖性的抗原提呈途径，称为CD1分子提呈途径。

DCs的成熟经历前体期、幼稚期及成熟期3个时期。

开始由骨髓进入血液循环，随后到达靶组织或器官，停留在潜在抗原物质出现位置，主要有MHC-I型和MHC-II型2种抗原提呈途径。

成熟DCs生物学特征有：能有效活化初始T细胞，有效摄取和处理抗原，CD80和CD11c可作为成熟DCs的标志，成熟DCs能启动免疫应答、释放干扰素等细胞因子等。

DCs 能摄取抗原并将其加工处理成能够被T细胞识别的多肽段。

T细胞受体特异性识别抗原肽-MHC分子复合物，刺激T细胞活化，进而启动胞内信号转导，诱导细胞增殖和分化有关基因的表达。

成熟T细胞主要包括CD4+T细胞（辅助T细胞）和CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）2个亚群。

免疫应答中，辅助T细胞最先激活，并释放细胞因子，激活巨噬细胞，诱导CTL成熟，促进细胞免疫应答，辅助B细胞产生抗体等。