同样采用Ni-NTA His结合树脂亲和纯化重组目的蛋白，
1、200mL菌液离心收集大量诱导的菌体，并用1×PBS缓冲液洗涤两次。
2、将保存的菌体沉淀用总体积为20mL的1×Bind Buffer (300mM NaCl，50Mm NaH
2
PO4; 10mM imidazote,pH8.0)重悬，在冰浴中超声波破菌至溶液呈白色澄清。
3、4℃ 12,000 rpm离心30分钟，然后用20mL的包涵体洗涤Buffer (50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.5% Triton x-100，pH8.0)洗涤沉淀两次。
4、加20mL的包涵体溶解Buffer（50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，8mol/L Urea，pH8.0）充分溶解，（旋涡溶解，最好溶解时间长一点，1h左右，也可以用冰盒装放摇床上1h ），4℃10,000 r/min离心30min，收集上清。
2.2.2 亲和层析纯化表达的蛋白
pQE40和pET-32a(+)载体表达的蛋白C﹑N端均融合了6个组氨酸的tag，可用金
属螯和层析纯化，也可用抗6个组氨酸的单克隆抗体检测表达蛋白的正确性。根据表达蛋白的溶解情况分两种方法对蛋白进行纯化。
2.2.3 天然条件下纯化可溶形式的目的蛋白
目的蛋白的表达和收获：用3.2.2.1所述的方法大量表达目的蛋白。4℃下10,000 rpm离心5 min弃上清，向细菌沉淀中加入4℃用冰预冷的1×Ni-NTA结合缓冲液(50
mmol/L NaH
2PO
4
, 300 mmol/L NaCl, 10 mmol/L咪唑, pH8.0)，每100 mL培养液加入4
mL结合缓冲液，重悬菌体。－40℃冷冻，室温溶解，反复冻融三次。再在冰水浴中超声10 min(超声10 s, 间隔10 s)，破碎菌体。4℃下10,000 rpm离心20 min，保留上清液。
Ni-NTA His·Bind resin的准备：将树脂充分重悬，取4 mL悬液(每2mL树脂悬液可吸附5-10 mg蛋白)加到10 mL沉降柱(gravity column)中，树脂自然沉降后，加1×Ni-NTA结合缓冲液洗两次。
目的蛋白的吸附和洗脱：将菌体上清液加到处理好的树脂中，4℃轻柔混匀，结合2h。树脂自然沉降后，打开沉降柱下端的管帽，让缓冲液缓慢流出。液体流完后，加
1×N i-NTA漂洗缓冲液(50 mmol/L NaH
2PO
4
, 300 mmol/L NaCl, 20 mmol/L咪唑，pH8.0)
5mL，轻柔混匀，漂洗两遍。结合、漂洗过程中收集上清100 μL，以备电泳分析。然
后加1×Ni-NTA洗脱缓冲液(50 mmol/L NaH
2PO
4
, 300 mmol/L NaCl, pH8.0，咪唑浓度
分别为100、200、300、500、750和1000 mmol/L)，按照咪唑浓度由低向高洗脱并收集目的蛋白，每0.5 mL收集一管。SDS-PAGE电泳分析各管收集液，合并有目的蛋白的收集液。
2.2.4 变性条件下纯化包涵体形式的目的蛋白
1、包涵体的纯化：收集的菌体按每100 mL培养基所得菌体加入20 mL1×变性结
合缓冲液(0.1 mol/L NaH
2PO
4
，0.01 mol/L Tris-Cl, pH8.0, 不含尿素) 冰浴30 min，
按前述方法进行超声，重悬菌体。5,000×g离心15 min，包涵体和细胞碎片位于沉淀中。移去上清，将沉淀重悬于20 mL 1×变性结合缓冲液，重复上述步骤。移去上清，按每100 mL培养基加5 mL缓冲液的比例，加入含8 mol/L尿素的1×变性结合缓冲液重悬沉淀。冰浴孵育1 h，彻底溶解包涵体。16,000×g离心30 min去除不溶成分。
Ni-NTA His·Bind resin的准备、目的蛋白的吸附和洗脱方法同前。1×变性漂洗
缓冲液(8 mol尿素，0.1 mol/L NaH
2PO
4
, 0.01 mol/L Tris-Cl, pH6.3)漂洗两遍后，
加入pH5.9的1×变性洗脱液(8 mol/L尿素，0.1 mol/L NaH
2PO
4
, 0.01 mol/L Tris-Cl)
0.5mL洗两遍，再用pH4.5的1×变性洗脱液洗脱并收集目的蛋白，每0.5 mL收集一管。结合、漂洗过程中收集上清100 μL，以备电泳分析。SDS-PAGE电泳分析各管收集液，合并有目的蛋白的收集液。
2.2.5 变性条件下目的蛋白的切胶回收
将变性条件下纯化的目的蛋白的收集液进行SDS-PAGE电泳，切胶回收。－20℃保存胶条。所有胶条放于研钵中，加入适量0.7%的生理盐水，研磨成很细的颗粒状，用1mL的针头可以吸入。电泳检测，估计蛋白浓度。
2.2.6 兔和小鼠多克隆抗体的制备
用作免疫的动物为日本大耳兔，体重2 kg左右，由武汉病毒所动物饲养中心提供，按以下免疫程序来免疫。500ug纯化的pQE-40-MT-2和pET32a(+)-MT-2重组融合蛋白多点注射兔腘淋巴结和脚掌，每点注射0.2 mL。第一次注射2周后加强免疫2次，各次剂量为上次剂量的二分之一，每次间隔两周。第二次、第三次蛋白溶液背部皮下、脚
掌多点注射。在第三次免疫2周后，自颈动脉抽取血液。将兔血37℃放置1h后再在4℃放置过夜，1500×g离心30 min，吸取上层的多抗血清，分装后于－70℃冻存。同时还用pET32a(+)-MT-2重组融合蛋白免疫了5只4周龄的昆明雄性小鼠，每只每周一次皮下注射40ug，6周后眼球取血，小鼠抗体血清的处理方法和兔抗体血清的处理方法相同。
2.3免疫印迹检测鳜MT-2在各组织内的分布
实验用鳜，体重为400 g左右，免疫前驯养一周。用于免疫印迹的器官包括鳃、肝脏、心脏、肾脏、肌肉、头肾、脑、脾脏和肠道。将所取的组织分别在MEB缓冲液（100 mmol/L β-磷酸甘油，20 mmol/L HEPES，20 mmol/L EGTA，15 mmol/L MgCl2，pH 7.3，临用前加入1 mmol/L DTT，2 mmol/L PMSF，2.5 μg/mL leupetin，2.5 μg/mL aprotinin）中匀浆，-40 ℃冻存。临用前将组织匀浆液14,000 rpm 4 ℃离心10min取上清，用于免疫印迹检测。
将预染Marker、纯化蛋白样品和含5ug蛋白的组织提取液经16.5% SDS-PAGE胶（Bio-Rad Mini-Protein电泳系统）分离，电泳条件：10mA 1 h，20mA 至电泳结束。将电泳后胶板在转膜缓冲液（25 mmol/L Tris pH8.3，192 mmol/L甘氨酸，30%甲醇）中平衡20 min。按照伯乐半干电泳转移系统（Trans-Blot SD semi-dry electrophoretic transfer cell）操作指南装配转膜系统，室温下以15V（120-180mA）转膜30min，将蛋白转移至甲醇浸润过的0.22 um的聚偏氟乙烯膜（PVDF）膜上。用TBS溶液（10 mmol/L Tris-Cl pH 7.5，150 mmol/L NaCl）轻轻漂洗膜10 min，再用2.5%的戊二醛固定1 h，以防止蛋白在随后的洗膜和孵育中脱落。然后用TBS洗膜10min×3，再用5%脱脂奶粉（溶于TBS中，含 0.05% Tween 20）室温封闭2 h后，用5%脱脂奶粉（溶于TBS中，含 0.05% Tween 20）按1：500稀释一抗，一抗采用两种重组蛋白免疫产生的兔抗MT-2抗体，4 ℃封闭过夜，再用TBST洗膜10min×3。以1：1000的稀释比例加入碱性磷酸酶标记的山羊抗兔二抗室温孵育2h。用TBST溶液洗膜10min×3，每次10 min，再用O洗膜10min。最后用NBT/BCIP浓缩显色试剂盒配置的底物溶液显色1-5min，滤dd H
2
膜置于dd H
O溶液中终止反应。
2
2.4免疫组织化学检测鳜MT-2的在细胞内的分布
实验用鳜，体重为400 g左右，免疫前驯养一周。
2.4.1 石蜡组织包埋与切片
1、取材与固定：迅速取肝脏和肾脏组织剪切成1.0×1.0×0.2厘米的小长条放入4%的多聚甲醛固定液中直接固定24h，4℃冰箱保存。
2、冲洗：固定以后，须在自来水下流水冲洗10分钟。
3、脱水：材料要切成薄片必须以石蜡包埋。为使石蜡能透入材料内部，必须除去其内部的水分。这种除去材料内部水分的操作过程，称为脱水。脱水通常用酒精，必须渐进，不能急骤，否则会引起材料不均匀的收缩。脱水时用70%、80%、90%、95%、100%各级酒精。每级10-30分钟。
4、透明：此时材料内部浸满酒精，石蜡仍难渗入，必须用既能与酒精混合又能溶解石蜡的媒浸剂浸渍，本试验采用二甲苯。每次20-30分钟，进行2次，时间不能长，久浸会使材料变脆，造成切片困难。
5、浸蜡：指石蜡浸入材料内部的操作过程。将溶解的石蜡倒入浸蜡杯内，将透明好的组织放入，中间换二次蜡，每次20-30分钟，将温箱温度调到与石蜡熔点相同，如温度过高，包埋物变得硬脆，坚实不易切片。
6、包埋：将材料包埋在石蜡中以便于切片。将熔化的石蜡倒入包埋器中，用热镊子把材料迅速移入包埋器中，并摆好位置，观察面向下摆放。之后，将包埋器放置于水面，缓慢浸入水中。等石蜡完全凝结以后，从水中取出，并注明包埋物的编号和日期等。
7、切片：将材料连同周围的石蜡用解剖刀切修成梯形，四周距离材料1-2毫米，前端离材料宜近。用少许石蜡将蜡块固定在木块上。将有蜡块的木块固定在切片机上，并调节切片刀的固定器或材料固定器，使切片刀与蜡块靠近。调节切片厚度为4微米，进行切片，并将切片用毛笔移在铺有黑纸的盘中。每节蜡带不超过盖玻片的长度。
8、展片与贴片：将切好的蜡带，放入温度为40-50℃的水浴锅内，根据蜡溶与水面的张力，展平组织，取一小滴蛋白甘油涂在载玻片上，用小拇指外侧把它涂成薄层，涂抹面积要超过蜡片所用的面积，涂抹得越薄越均匀越好。用解剖针把蜡片段拖于载玻片上, 玻片45-50℃烘干。
9、脱腊：把玻片放入盛有二甲苯的染缸中，熔去石蜡（3分钟），再经第二缸（3分钟）。
10、水化：经70%--80%--90%--95%各级酒精入水。
2.4.2 柠檬酸缓冲液煮沸抗原修复
1、石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（pH=7.4）冲洗3次，每次3分钟（3×3’）。
2、将组织切片浸泡于蒸馏水中待用。
3、取一定量的pH=6.0柠檬酸缓冲液于烧杯中，放在电炉上加热至沸腾。
4、将脱蜡水化后的组织切片至于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，煮20分钟。
5、烧杯离开火源冷却至室温，才能从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗2次，然后用PBS（pH=7.4）冲洗2次，每次3分钟。
2.4.3 免疫织化学染色
1、每张切片加50ul过氧化酶阻断溶液（试剂A），以阻断内源性过氧化物酶活性，室温下孵育10分钟。
2、PBS冲洗3次，每次3分钟。
3、甩去PBS液，每张片加50ul的非免疫性动物血清（试剂B），室温下孵育10分钟。
4、甩去血清，每张切片加50ul的稀释好的小鼠MT抗体（抗体的稀释比为1：500），用非免疫血清代替一抗作为阴性对照，放入4℃冰箱过夜。
5、PBS冲洗3次，每次3分钟。
6、甩去PBS液，每张切片加50ul的生物素标记的第二抗体，室温下孵育10分钟。
7、PBS冲洗3次，每次3分钟。
8、甩去PBS液，每加50ul链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液（试剂D），在室温下孵育10分钟。
9、PBS冲洗3次，每次3分钟。
10、甩去PBS液，每张切片加100ul新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3-10分钟，阳性显色为棕色。
11、自来水冲洗，苏木素复染。
12、0.1%HCl分化, PBS冲洗返蓝。
13、DAB显色后，切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，滴加中性树胶后盖上盖玻片封固。
14、实验观察与拍照：切片完成后，可在显微镜下观察到正常肝、肾组织的染色情况并进行拍照。
柱纯化蛋白：
一、柱平衡：
5、加到用平衡缓冲液平衡好的Ni-NTA His Bind Resin柱子内(Ni-NTA His Bind Resin柱子平衡按说明书)，混匀，收集流穿液；用含50mmol /L咪唑的洗脱Buffer（50mM咪唑,50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，8mol/L Urea，pH8.0）洗脱杂蛋白，最后用含250mmol /L咪唑的洗脱Buffer（250mM咪唑,50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，8mol/L Urea，pH8.0）洗脱目的蛋白。
将纯化的重组蛋白采取逐步降低尿素浓度的方法，透析除去蛋白溶液中的尿素，使变性的蛋白在此过程中自然复性。先用含6mol/L尿素的PBS缓冲液4℃透析过夜，然后分别用4.0、3.0、2.0、1.0、0.5mol/L的梯度透析各4h以上，最后用PBS缓冲液再透析4h以上。透析结束后，将蛋白溶液在4℃于12,000r/min 离心10min，上清即为可溶的复性蛋白，聚乙二醇8000浓缩，2ml离心管分装保存于-80℃冰箱。
Protein minipreps under denaturing conditions
Materials
? Microcentrifuge tubes
? Ni-NTA His?Bind Resin
? Buffers A–C, E (see page 27)
1. Transfer 1 ml bacterial culture to a microcentrifuge tube.
The amount of culture used depends on the protein expression level. One ml is sufficient if the protein is expressed at high rates (see Table 1, page 4). If lower expression rates are expected, larger volumes may be necessary.
If a time course of expression is being performed, take 1 ml samples of a larger culture at 30 min intervals after induction, collect the cell pellets and store them at –20°C until all the samples are ready for processing.
2. Harvest the cells by centrifugation for 1 min at 15,000 ×g and discard supernatants.
If larger culture volumes are required, refill microcentrifuge tube and centrifuge. Repeat this step until all cells are harvested.
3. Resuspend cells in 200 μl buffer B. Lyse cells by gently vortexing, taking care to avoid frothing.
The solution should become translucent when lysis is complete. Most proteins are soluble in buffer B. If the solution does not become translucent, lyse cells with buffer A.
4. Centrifuge the lysate for 10 min at 15,000 ×g to remove the cellular debris, and transfer the supernatant to a fresh tube.
5. Add 50 μl of a 50% slurry of Ni-NTA His?Bind Resin (25 μl resin has a capacity for 125-250 μg His?Tag fusion protein) to each tube, and mix gently for 30 min at room temperature.
6. Centrifuge 10 sec at 15,000 ×g to pellet the resin, transfer 10 μl of the supernatant to a fresh tube, and discard the remaining supernatant. Store the supernatant samples on ice. The supernatant samples will contain any proteins which have not bound to the resin.
7. Wash the resin with 2 ×250 μl of buffer C.
Centrifuge for 10 sec at 15,000 × g between each wash step and carefully remove the supernatant.
8. Elute the protein with 3 ×25 μl buffer E.
Centrifuge for 10 sec at 15,000 ×g between each elution step and carefully remove the supernatant to a fresh tube.
9. Analyze the fractions by SDS-PAGE.
If Buffer A was used to lyse the cells, refer to “Preparation of guanidine containing samples for SDS-PAGE”, on page 27.
Hieff TransTM 脂质体核酸转染试剂 产品描述 Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂是一种多用途的脂质体转染试剂，适用于DNA 、RNA 和寡核苷酸的转染，对大多数真核细胞具有很高的转染效率。其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，这样可以减少去除血清对细胞的损伤。转染后不需要除去核酸-Hieff Trans TM 复合物或更换新鲜培养基，也可在4～6小时后除去。 Hieff Trans TM 以无菌的液体形式提供。通常情况下对于 24 孔板转染，每次用1.5μl 左右，则1ml Hieff Trans TM 约可做660次转染；对于6孔板，每次用6μl 左右，则1ml Hieff Trans TM 约可做160 次转染； 运输与保存方法 冰袋（wet ice ）运输。产品4oC 保存，一年有效。不可冷冻！ 注意事项 1）Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响；如果你研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密度要求较低的转染试剂，不适合用脂质体核酸转染试剂。 2）Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基。但是，制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA 和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。另外，要检测所用的无血清培养基与脂质体核酸转染试剂的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 就不相容。 3）转染的时候培养基中不能添加抗生素。 4）使用高纯度的DNA 或RNA 有助于获得较高的转染效率，质粒中的内毒素是转染的大敌。 5）阳离子脂质体应该在4度保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。 6）初次使用应优化DNA 浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。DNA 和转染试剂的比例，通常推荐是1:2-1:3，比如24孔板内接种0.5-2×105个细胞，使用0.5 μg DNA 和1-1.5 μl 转染试剂。通过调整DNA/Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂比例优化转染效率，保证细胞密度大于90%，DNA （μg ）: Hieff Trans TM （μl ）比值在1：0.5-1：5。 操作流程（以24孔板为例，其他培养板加样体积请参考表一） 【注】：转染试剂使用量受细胞类型及其他实验条件影响，建议初次使用时设置梯度进行优化最佳使用量。 贴壁细胞：转染前一天（20-24小时），胰酶消化细胞并计数，细胞铺板（不含抗生素），使其在转染时密度为90-95%（0.5-2 × 105 cells/well for a 24-well plate ）。 c c l 整 理
湖北省麻城市集美学校初中体育《坐位体前屈练习方法》教案 坐位体前屈的动作方法：慢慢练平坐在地上，伸直双腿，脚板崩直，然后，弯曲腰部，双手放在头的两侧，尽力向前伸慢慢用力，不要晃。 一、立位练习法： 1、双脚开立体前屈练习法 动作方法：双脚开立同肩宽，膝关节伸直，腰部、背部放松，双手自然下垂，加振动做体 前屈练习。 2、单脚支撑练习法 动作方法：(有左脚为例)左脚向左前方迈一小步，脚跟着地成支撑，脚尖勾回，膝关节伸直，身体中心落在右腿上，右腿膝关节弯曲；左手压在左脚膝关节上，加振动用右手摸(抓) 左脚脚尖； 3、双脚并拢体前屈练习法 动作方法：双脚并拢，膝关节伸直，腰部、背部放松，双手自然下垂，加振动做体前屈练习。 二、坐位练习法： 1、单脚练习法 动作方法：(有左脚为例)左脚膝关节伸直，脚尖勾回，身体前扑，加振动用右手抓左脚脚尖或前脚掌； 2、双脚分开练习法 动作方法：双脚分开同肩宽，膝关节伸直，脚尖勾回，身体前扑，加振动用双手去抓双脚脚 尖或者双脚前脚掌； 3、双脚并拢练习法 动作方法：双脚并拢，膝关节伸直，脚尖勾回，身体前扑，加振动用双手去抓双脚脚尖或者双脚前脚掌； 三、利用台阶练习法 动作方法：学生站在上一级台阶上，成立位体前屈姿势，加振动，用手指指尖或手掌去触 摸下一级台阶的台面。 根据学生的实际情况可以有针对性的进行训练，手段如下： ⑴坐压腿：双腿分开坐在地面上，一条腿屈膝，脚跟接触伸展腿的内侧。呼气，上体前倾 贴近伸展腿大腿的上部。伸展腿膝部保持伸直，动作幅度尽量大。 (2)压腿：在高台前站立，一条腿伸直放在台上，另一条腿支撑地面。呼气，双腿膝关节伸 直，髋关节正对台子。上体前倾，贴近台上大腿上部，双手扶踝关节前部。伸展腿膝部和背部保持伸直。动作幅度尽量大。此文转自斐?斐课件?园https://www.doczj.com/doc/3f11897232.html, (3)站立拉伸：背贴墙站立，呼气，直膝抬起一条腿。同伴用双手抓住踝关节上部，帮助腿 上举。同伴帮助上举腿时练习者呼气，动作幅度尽量大。 2?拉伸大腿内侧 (1)直膝分腿坐压腿：双腿尽量左右分开，坐在地面上，双手体前扶地。呼气，转体，上体前倾贴在一条腿上，双手扶在身体前倾一侧腿的踝关节前部。充分伸展双腿和腰部。 ⑵弓箭步拉伸：弓箭步站立，双脚间距离约60厘米，后脚左转90度，双手叉腰。呼气，前脚继续前移，髋部下压后面腿，换腿重复练习。动作幅度尽量大。 3?腰腹部 (1)跪立背弓：在垫上跪立，脚尖向后。双手扶在背上部，上体后仰，背部肌肉收缩送髋。 呼气，加大动作幅度，逐渐把双手滑向脚跟。动作幅度尽量大。拉伸25秒，3至5组。 (2)体前屈蹲起：双脚并拢俯身下蹲，逐渐下降双手放在脚两侧，手指向前。躯干贴在大腿上部。伸膝至最大限度。动作幅度尽量大，手不能离地。 ⑶跨栏坐：双腿尽量左右分开，坐在地面上，成跨栏坐姿势，呼气，转体，上体前倾贴在一条腿上，
脂质体转染的实验原理与操作步骤大全 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n， n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1：1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2~24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。 细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 一、脂质体(liposome)转染方法原理 脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体((Iiposome)作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进人细胞。使用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性。 中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 二、脂质体转染操作步骤 1、操作步骤[方法一]： (1)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。 (3)转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。
坐位体前屈训练方法与技巧 坐位体前屈测试方法：这一项目的场地是在室内，使用电动测试仪进行测试。考试时，考生直角坐，两腿伸直，两脚脱鞋平蹬测试纵板坐在平地上，两脚分开约10—15 厘米，上体前屈，两臂伸直向前，用两手中指尖逐渐向前推动游标，直到不能前推为止。测试计的脚蹬纵板内沿平面为0 点，向内为负值，向前为正值。记录以厘米为单位，保留一位小数。 注意事项及技巧： 1、考试前，考生要进行体前屈准备活动练习，让腿部韧带拉开，然后, 身体前屈，两臂向前 推游标时两腿不能弯曲; 受试者应匀速向前推动游标，不得突然发力; 向前推动游标时，中途不可停顿，一旦停止，电动测试仪就记录下成绩。 2、将腹部慢慢靠近大腿（不要拱背）。 3、在屈之前把腰挺直，尽量收腹，拉伸腰，然后双腿挺直的情况下身体前倾同时伸展手臂。 坐位体前屈的训练方法 一、立位练习法： 1、双脚开立体前屈练习法动作方法：双脚开立同肩宽，膝关节伸直，腰部、背部放松，双手自然下垂，加振动做体前屈练习。 2、单脚支撑练习法动作方法：（有左脚为例）左脚向左前方迈一小步，脚跟着地成支撑，脚尖勾回，膝关节伸直，身体中心落在右腿上，右腿膝关节弯曲；左手压在左脚膝关节上，加振动用右手摸（抓）左脚脚尖； 3、双脚并拢体前屈练习法动作方法：双脚并拢，膝关节伸直，腰部、背部放松，双手自 然下垂，加振动做体前屈 练习。二、坐位练习法： 1、单脚练习法动作方法：（有左脚为例）左脚膝关节伸直，脚尖勾回，身体前扑，加振 动用右手抓左脚 脚尖或前脚掌； 2、双脚分开练习法动作方法：双脚分开同肩宽，膝关节伸直，脚尖勾回，身体前扑，加振动用双手去抓双脚脚尖或者双脚前脚掌； 3、双脚并拢练习法动作方法：双脚并拢，膝关节伸直，脚尖勾回，身体前扑，加振动用 双手去抓双脚脚尖 或者双脚前脚掌； 三、利用台阶练习法动作方法：学生站在上一级台阶上，成立位体前屈姿势，加振动，用手指指尖或手掌去触摸下一级台阶的台面。 二、坐位练习法：1、先坐在地上，双腿并拢伸直，两臂向前用力伸。可以有节奏的进行，目的就是静力练习前的拉伸准备和热身活动。也可 2 、同伴或教练员可利用用手反复按压练习者肩背部的办法，助其用力，达到伸拉的目的。这里有个关键，就是练习者的肩部和后背易上弓的位置是重点施力部位。并且，用力方向不宜往正下方，以前下方为最佳。按压时间长度 1 2 两分钟。 以上1、2 也可这样：一人坐垫上，双脚并拢，帮助的人站在练习者身后，有节奏的推压练习者的双肩，做 4 个8 拍，推压由轻到重，练习者配合主动向前身体前屈下压， 4 个
坐位体前屈的动作方法：慢慢练平坐在地上，伸直双腿，脚板崩直，然后，弯曲腰部，双手放在头的两侧，尽力向前伸慢慢用力，不要晃。 一、立位练习法： 1、双脚开立体前屈练习法 动作方法：双脚开立同肩宽，膝关节伸直，腰部、背部放松，双手自然下垂，加振动做体前屈练习。 2、单脚支撑练习法 动作方法：（有左脚为例）左脚向左前方迈一小步，脚跟着地成支撑，脚尖勾回，膝关节伸直，身体中心落在右腿上，右腿膝关节弯曲；左手压在左脚膝关节上，加振动用右手摸（抓）左脚脚尖； 3、双脚并拢体前屈练习法 动作方法：双脚并拢，膝关节伸直，腰部、背部放松，双手自然下垂，加振动做体前屈练习。 二、坐位练习法： 1、单脚练习法 动作方法：（有左脚为例）左脚膝关节伸直，脚尖勾回，身体前扑，加振动用右手抓左脚脚尖或前脚掌； 2、双脚分开练习法 动作方法：双脚分开同肩宽，膝关节伸直，脚尖勾回，身体前扑，加振动用双手去抓双脚脚尖或者双脚前脚掌； 3、双脚并拢练习法 动作方法：双脚并拢，膝关节伸直，脚尖勾回，身体前扑，加振动用双手去抓双脚脚尖或者双脚前脚掌； 三、利用台阶练习法 动作方法：学生站在上一级台阶上，成立位体前屈姿势，加振动，用手指指尖或手掌去触摸下一级台阶的台面。 根据学生的实际情况可以有针对性的进行训练，手段如下： (1)坐压腿：双腿分开坐在地面上，一条腿屈膝，脚跟接触伸展腿的内侧。呼气，上体前倾贴近伸展腿大腿的上部。伸展腿膝部保持伸直，动作幅度尽量大。 (2)压腿：在高台前站立，一条腿伸直放在台上，另一条腿支撑地面。呼气，双腿膝关节伸直，髋关节正对台子。上体前倾，贴近台上大腿上部，双手扶踝关节前部。伸展腿膝部和背部保持伸直。动作幅度尽量大。此文转自斐.斐课件.园https://www.doczj.com/doc/3f11897232.html, (3) 站立拉伸：背贴墙站立，呼气，直膝抬起一条腿。同伴用双手抓住踝关节上部，帮助腿上举。同伴帮助上举腿时练习者呼气，动作幅度尽量大。 2．拉伸大腿内侧 (1)直膝分腿坐压腿：双腿尽量左右分开，坐在地面上，双手体前扶地。呼气，转体，上体前倾贴在一条腿上，双手扶在身体前倾一侧腿的踝关节前部。充分伸展双腿和腰部。(2)弓箭步拉伸：弓箭步站立，双脚间距离约60厘米，后脚左转90度，双手叉腰。呼气，前脚继续前移，髋部下压后面腿，换腿重复练习。动作幅度尽量大。 3．腰腹部 (1)跪立背弓：在垫上跪立，脚尖向后。双手扶在背上部，上体后仰，背部肌肉收缩送髋。呼气，加大动作幅度，逐渐把双手滑向脚跟。动作幅度尽量大。拉伸25秒，3至5组。(2)体前屈蹲起：双脚并拢俯身下蹲，逐渐下降双手放在脚两侧，手指向前。躯干贴在大腿上部。伸膝至最大限度。动作幅度尽量大，手不能离地。 (3)跨栏坐：双腿尽量左右分开，坐在地面上，成跨栏坐姿势，呼气，转体，上体前倾贴
转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血
微脂体(又称脂质体)及其制备方法一二 微脂体(又称脂质体) 微脂体起源于1960 年代中期，Bangham博士等人首先提出，在磷酸脂薄膜上加入含盐分的水溶液后，再加以摇晃，会使脂质形成具有通透性的小球；196 8年，Sessa 和Weissmann 等人正式将此小球状的物体命名为微脂体（liposo me）并做出明确的定义: 指出微脂体是由一到数层脂质双层膜(lipid bilayer) 所组成的微小的囊泡，有自行密合（self-closing）的特性。微脂体由脂双层膜包裹水溶液形成，由于构造的特性，可同时作为厌水性（hydrophobic）及亲水性（hydrophilic）药品的载体，厌水性药品可以嵌入脂双层中，而亲水性药品则可包覆在微脂体内的水溶液层中。如同细胞膜，微脂体的脂质膜为脂双层构造，由同时具有亲水性端及厌水性端的脂质所构成，脂双层由厌水性端相对向内而亲水性端面向水溶液构成，组成中的两性物质以磷酸脂质最为常见。微脂体的形成是两性物质在水溶液中，依照热力学原理，趋向最稳定的排列方式而自动形成。微脂体的性质深受组成脂质影响，脂质在水溶液的电性，决定微脂体是中性或带有负电荷、正电荷。此外，磷酸脂碳链部分的长短，不饱和键数目，会决定微脂体的临界温度(transition temperature, Tc)，影响膜的紧密度。一般来说，碳链长度越长临界温度越高，双键数越多则临界温度越低，常见的DPPC(dipalmitoylp hosphatidylcholine)与DSPC(distearoylphosphatidylcholine)的临界温度分别是42℃与56℃，而Egg PC(egg phosphatidylcholine)与POPC(palmitoyl oleoyl phosphatidylcholine)的Tc 则低于0℃。临界温度影响微脂体包裹及结合药物的紧密度，当外界温度高于Tc时，对膜有通透性的药物，较容易通过膜；此外，当外界温度处于临界温度时，微脂体脂质双层膜中的脂质，会因为流动性不一致而使微脂体表面产生裂缝，造成内部药物的释出。在磷脂质内加入胆固醇，会对微脂体性质产生下列影响：增加微脂体在血液中的安定性，较不易发生破裂；减少水溶性分子对微脂体脂膜的通透性；增加微脂体的安定性，使其在血液循环中存在的时间较长。 微脂体可依脂双层的层数或是粒子大小，加以命名或分类： (1) Multilamellar vesicle（MLV）是具有多层脂双层之微脂体，粒子大小介于100-1000 nm，特色是粒子内具多层脂质膜，一般而言，干燥后的脂质薄膜，
体育中考---坐位体前屈训练方法与技巧 坐位体前屈测试方法： 这一项目的场地是在室内，使用电动测试仪进行测试。考试时，考生直角坐，两腿伸直，两脚脱鞋平蹬测试纵板坐在平地上，两脚分开约10—15厘米，上体前屈，两臂伸直向前，用两手中指尖逐渐向前推动游标，直到不能前推为止。测试计的脚蹬纵板内沿平面为0点，向内为负值，向前为正值。记录以厘米为单位，保留一位小数。 注意事项及技巧： 1、考试前，考生要进行体前屈准备活动练习，让腿部韧带拉开，然后,身体前屈，两臂向前推游标时两腿不能弯曲;受试者应匀速向前推动游标，不得突然发力;向前推动游标时，中途不可停顿，一旦停止，电动测试仪就记录下成绩。 2、将腹部慢慢靠近大腿（不要拱背）。 3、在屈之前把腰挺直，尽量收腹，拉伸腰，然后双腿挺直的情况下身体前倾同时伸展手臂。 坐位体前屈的训练方法 一、立位练习法： 1、双脚开立体前屈练习法 动作方法：双脚开立同肩宽，膝关节伸直，腰部、背部放松，双手自然下垂，加振动做体前屈练习。 2、单脚支撑练习法 动作方法：（有左脚为例）左脚向左前方迈一小步，脚跟着地成支撑，脚尖勾回，膝关节伸直，身体中心落在右腿上，右腿膝关节弯曲；左手压在左脚膝关节上，加振动用右手摸（抓）左脚脚尖； 3、双脚并拢体前屈练习法 动作方法：双脚并拢，膝关节伸直，腰部、背部放松，双手自然下垂，加振动做体前屈练习。二、坐位练习法： 1、单脚练习法 动作方法：（有左脚为例）左脚膝关节伸直，脚尖勾回，身体前扑，加振动用右手抓左脚脚尖或前脚掌； 2、双脚分开练习法 动作方法：双脚分开同肩宽，膝关节伸直，脚尖勾回，身体前扑，加振动用双手去抓双脚脚尖或者双脚前脚掌； 3、双脚并拢练习法 动作方法：双脚并拢，膝关节伸直，脚尖勾回，身体前扑，加振动用双手去抓双脚脚尖或者双脚前脚掌； 三、利用台阶练习法 动作方法：学生站在上一级台阶上，成立位体前屈姿势，加振动，用手指指尖或手掌去触摸下一级台阶的台面。 二、坐位练习法： 1、先坐在地上，双腿并拢伸直，两臂向前用力伸。可以有节奏的进行，目的就是静力练习前的拉伸准备和热身活动。也可
慢慢练平坐在地上，伸直双腿， 脚板崩直， 然后，弯曲腰部， 双手放在头的两侧，尽力向前伸 慢慢用力，不要晃。 还有一种，立位体前屈 平时练习的话，这个比较合适，方便。 站直，双腿并拢，崩直， （注意弯下去的时候，膝盖一定不要弯曲） 弯腰，用手去触地， 如果手指可以触得到，那么，试着用手掌去接触地面。 如果你可以手掌接触地面，而保持膝盖不弯曲的话，那你就很厉害了！ 当然，还有更高的要求， 手掌触地面，不够难度？ 那就试下，站在一级台阶上， 用手掌去触台阶下面的地面。 我上初二现在可以做后一种了！ 可能女生会好一点！！ 座位体前屈拉的是腿后面的韧带，将一条腿放在栏杆上，做正压腿就可以了，幅度自己掌握，有点疼就行，每条腿练十几分钟。 腰部柔韧性的练习方法 （1）前俯腰：主要用来练习腰部向前运动的能力和柔韧性具体方法：并步站立两腿挺膝夹紧两手十指交叉两臀伸直上举手心向上。然后上体亢腰前俯两手心尽量向下贴紧地面两膝挺直，髋关节屈紧，腰背部充分伸展。两手松引用双手从脚两侧屈肘抱紧脚后跟，使胸部贴紧双腿，充分伸展腰背部。持续一定时间后再放松起立。还可以在双手触地时向左右侧转腰，用两手心触及两脚外侧的地面，增大腰部伸展时左右转动的柔韧性。 动作要点：两腿挺膝直立，挺胸塌腰，充分伸展腰背部，胸部与双腿贴紧。 (2)后甩腰：主要用来练习腰部向后运动的柔韧性。具体方法：并步站立，练习时一腿支撑，另一腿向后上直腿 摆动，同时，两臂伸直，随l体向后屈做向后的摆振动作，使腰背部被充分压紧，腰椎前面充分伸展： 动作要点：后摆腿和上体后屈振摆同时进行；支撑腿，膝伸直．头部和双臂体后屈做协调性后摆助力动作， (3)腰旋转:主要用来练习腰部的左右旋转幅度。具体打法；两脚左右开立略宽于肩，两臂自然垂于休侧以髋关节为 轴体前俯，然后以腰为轴，使上体自前向右、向上再向左，回到的做顺时针或逆时针旋转；同时，双臂随上体做顺 时针或逆时针的环绕动作，以增加腰部旋转的幅度和力度、 动作要点：尽量增大绕环幅度，速度由慢到快，使腰椎关节完全得到活动、伸展。 -------------------------------------------------------------------------- 3．被动形式的训练方法 (1)腿部和髋部的主要练习方法多采用各种形式的搬腿同伴握紧自己的脚，做正搬、侧搬、后搬等助力拉伸动作, 也可采 用各种形式的按和踩的方法。如进行横叉或竖叉练习时，同伴或教练员可利用脚踩或手按练习者肩背部的办法，助其用力，达到伸拉的目的。 (2)腰部的被动练习法主要是利用压桥法。同伴或教练用自己的双脚顶住或踩住练习者的双脚，用双手拉住练习者双臂 或双肩，用力使练习者的双肩后部尽量靠近两脚跟，使练习者的腰椎关节得到完全伸展和收缩，增强腰部的柔韧性。 熟能生巧！坚持就是胜利！ 平坐在地上，伸直双腿， 脚板崩直， 然后，弯曲腰部， 双手放在头的两侧，尽力向前伸
Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂说明书 产品描述 Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂是一种多用途的脂质体转染试剂，适用于DNA、RNA 和寡核苷酸的转染，对大多数真核细胞具有很高的转染效率。其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，这样可以减少去除血清对细胞的损伤。转染后不需要除去核酸-Hieff Trans TM复合物或更换新鲜培养基，也可在4～6小时后除去。 Hieff Trans TM以无菌的液体形式提供。通常情况下对于 24 孔板转染，每次用1.5μl左右，则1ml Hieff Trans TM约可做660次转染；对于6孔板，每次用6μl左右，则1ml Hieff Trans TM约可做160 次转染； 运输与保存方法 冰袋（wet ice）运输。产品4oC保存，一年有效。不可冷冻！ 注意事项 1）Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响；如果你研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密度要求较低的转染试剂，不适合用脂质体核酸转染试剂。 2）Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基。但是，制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。另外，要检测所用的无血清培养基与脂质体核酸转染试剂的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 就不相容。 3）转染的时候培养基中不能添加抗生素。 4）使用高纯度的DNA或RNA有助于获得较高的转染效率，质粒中的内毒素是转染的大敌。 5）阳离子脂质体应该在4度保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。 6）初次使用应优化DNA浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。DNA 和转染试剂的比例，通常推荐是1:2-1:3，比如24孔板内接种0.5-2×105个细胞，使用0.5 μg DNA 和1-1.5 μl 转染试剂。通过调整DNA/Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂比例优化转染效率，保证细胞密度大于90%，DNA（μg）: Hieff Trans TM（μl）比值在1：0.5-1：5。
脂质体转染的实验原理与操作步骤大全 日期：2012-06-25 来源：互联网作者：青岚点击：3644次 摘要： 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 找产品，上生物帮>> >> 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n，n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1：1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2~24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。 细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 一、脂质体(liposome)转染方法原理 脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体((Iiposome)作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进人细胞。使用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性。 中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 二、脂质体转染操作步骤 1、操作步骤[方法一]：
细胞转染的操作步骤 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。
二、脂质体转染操作步骤1、操作步骤[方法一]： (1)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。 (3)转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。 (4)转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6~24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 (5)其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。 2、快速脂质体转染法操作步骤如下[方法二]： (1)以5×105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时，使其达到50~60%板底面积。 (2)在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下：①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo 质粒DNA或供体DNA。②旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。③室温下放置5~10分钟，使DNA结合在脂质体上。 (3) (3)弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物，37℃培养3~5小时。 (4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，继续培养14~24小时， (5)吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培养24~48小时。 (6)用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。 (7) 3、稳定的脂质体转染方法如下：(1)接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)、(3)步骤。(3)在每孔中加入1mL、20%FCS 的DMEM，37℃培养48小时。(4)吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞克隆筛选法 细菌粘附侵入实验 1、将细胞按1.0×10? cells/ml的量接种于24孔板中，每孔1ml，置于37°的培养箱中培养3天直至细胞均勾铺满孔底，长满单层的细胞显微镜下可见细胞之间接触紧密，形成该细胞所特有的紧密连接。 2、实验前一天取E.coli菌株接种于含有相应抗生素的BHI培养基中，于37°培养箱中静置培养过夜。 3、取长满单层的HBMEC细胞，用预热的WXM培养基轻柔地将细胞洗3遍，以去除培养基中的双抗。 4、然后每孔中加入400μL培养基，于37°温箱中 5、静置期间取过夜培养的细菌，3000r/min离心5min收集菌体。弃去培养基，将菌体沉淀重悬于1mlXM培养基中。并用培养基调整菌液的OD???至0.2约为1.0×10? CFU/ml。 6、分别向24孔板中每孔细胞加入100μL细菌悬液（10?CFU,MOI约为100，使总体积达到500μL。轻轻晃动24孔板使细菌均勾分散。（若为侵入实验，则将24孔板于水平离心机中,1000r/min离心5min促使细菌与细胞的接触；若为粘附实验，则该步离心省略。
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/3f11897232.html, 坐位体前屈练习易犯错误及解决方法 作者：顾德开 来源：《中国学校体育》2017年第02期 易犯错误1：低头过早 现象：在坐位体前屈练习中，学生对于何时抬头把握不准，许多学生在练习初就低头，导致躯干紧张、收腹不紧、呼吸不通畅等情况发生。 原因：低头时机把握不准。 改进方法：低头夹棒：2名学生一组，1名学生练习，另1名学生将体操棒放在练习者颈部前中间位置，在开始练习时，要求练习者下颌前伸，不能碰棒，当躯干前倾、腹部收紧靠近大腿时，提醒练习者迅速低头，用下颌夹紧棒。 易犯错误2：躯干前倾不够 现象：在练习坐位体前屈时，学生背部拮抗肌紧张，身体“弓”得太厉害，躯干难以前倾，部分学生甚至在同伴的帮助下也难以完成下压动作。 原因：背部肌肉紧张；低头过早。 改进方法：站位体前屈：两脚左右分开略比肩宽，上体前屈，塌腰，两手掌触地，呈“n”型停留10秒，练习3组；俯撑后仰：俯卧在垫子上，髋、腿贴住垫子，手臂撑直并撑起上体，头后仰，停10秒，练习3组。 易犯错误3：卷腹不充分 现象：一些肥胖学生，尤其是腹部脂肪比较多的学生，他们的坐位体前屈成绩一般不甚理想，究其原因是采用坐姿练习，腹部脂肪不放松，容易堆积，使身体难以向大腿贴紧，再加上腹肌收缩能力差，导致动作难以完成。 原因：腹部肌肉和股直肌收缩能力差。 改进方法：仰卧举腿夹棒：仰卧在垫子上，向后举腿，脚尖绷直，身体与腿成90°，停留15秒；也可1名学生仰卧，两腿并拢，做体前屈动作，另1名学生扶其膝关节，帮助其腿下压。或采用腹部夹体操棒练习，在练习过程中提醒学生膝关节伸直；肋木悬垂举腿：背对肋木站立，两手分开抓住肋木，身体与腿成90°，脚尖绷直，做慢下快起练习。 易犯错误4：不重视跟腱拉伸
一、实验材料 1、宿主细胞CHO（贴壁细胞） 2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000（invitrogen公司） 3、6孔细胞培养版 4、无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO） 5、转染级质粒 二、实验步骤 invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔……板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧！ 1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。（我的接种密度是 3~4*105/ml.）转染时，细胞要达到90~95%的融合。 2、溶液1：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积250 ul）（温育5min） 3、溶液2：X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well（总体积250 ul） 4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。 5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。 6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％的CO2中保温5~6小时。 7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO2中48~72h检测转染水平。 8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例（根据细胞的生长情况）接种到新的培养基。 三、个人经验： 我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。转染率很高。以下是个人经验，与大家分享。 1.细胞的状态。这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。有文献说传代不要超过17代。我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。
中考体育之坐位体前 屈训练技巧 Revised on November 25, 2020
中考体育之坐位体前屈训练技巧 串丝中学:魏强我们都知道,坐位体前屈,是近几年中考的测试项目,坐位体前屈主要测量学生在静止状态下的躯干、腰、髋等关节可能达到的活动幅度,主要反映这些部位的关节、韧带和肌肉的伸展性和弹性及学生身体柔韧素质的发展水平。坐位体前屈动作的练习,对全身的关节、韧带、肌肉的灵活性,柔韧性,协调性。以及培养顽强的意志品质等方面都有良好的促进作用。坐位体前屈成绩的提高既是考试的需要,也是对中学生身体素质的检测。所以应加强对坐位体前屈动作的教学和锻炼。 初始练习柔韧时,有些学生会很害怕,因为练习柔韧性会有疼痛感。为了加强学生对坐位体前屈学习的兴趣,经过近几年来的教学探索,我在教学中寻找到一些方法和技巧。下面就提高学生的练习兴趣和发展学生的全身柔韧性谈谈方法和技巧: 坐位体前屈练习时,必须做好准备活动,并在教学中采用形式多样的教学方法和练习方法去吸引学生,提高学生的学习兴趣,使他们在热烈的氛围和情景中感到快乐,积极主动地投入到练习中,由原来的“要我学”变为现在的“我要学”。 1、游戏法教学 游戏是学生最喜爱的运动形式,学生有了兴趣,才会有克服困难、积极主动认真学习的热情,将坐位体前屈动作的练习,从单个的手臂练习、腰部练习、腿部练习、全身各个关节、肌肉、韧带的练习,编成游戏的形式。例如:通过玩“高人、矮人、超人游戏”可练习学生的四肢及腰部;通过玩“跟我学游戏”可练习学生的全身各个关节、肌肉、韧带的练习。 2、竞赛法教学
根据生理学发展规律,中学生正处于青春发育的高峰期,有着活泼、好动、好胜的天性。针对此情况,在教学中适时地将坐位体前屈动作的练习,采用竞赛的形式予以激励练习。例如:看谁最高,让学生前脚掌着地支撑,双臂上举,充分伸展四肢;看谁伸得最远,让学生十指交叉,双脚左右分开略比肩宽,用交叉的手臂分别往前后左右四个方向远伸;看谁最勇敢,让学生并步站立两腿挺膝夹紧两手十指交叉两臀伸直上举手心向上,然后上体亢腰前俯两手心尽量向下贴紧地面两膝挺直,髋关节屈紧,腰背部充分伸展,两手松引用双手从脚两侧屈肘抱紧脚后跟,使胸部贴紧双腿,充分伸展腰背部,持续一定时间后再放松起立;看谁能达桥以及看谁劈叉最直等等。 3、音乐法教学 坐位体前屈练习是比较枯燥无味的练习,在各种柔韧练习中,播放一些舒畅、柔和、缓慢、动听的轻音乐,让学生在练习中心情放松、忘记疼痛、忘记疲劳。 总之,在练习坐位体前屈时,一定要由易到难,由简到繁,有的放矢,循序渐进,切忌操之过急!伤害学生! 简单的训练方法！ 先坐在地上，双腿并拢伸直，两臂向前用力伸。 同伴或教练员可利用用手反复按练习者肩背部的办法，助其用力，达到伸拉的目的。 腰部柔韧性的练习方法 （1）前俯腰：主要用来练习腰部向前运动的能力和柔韧性具体方法：并步站立两腿挺膝夹紧两手十指交叉两臀伸直上举手心向上。然后上体亢腰前俯两手心尽量向下贴紧地面两膝挺直，髋关节屈紧，腰背部充分伸展。两手松引用双手