脂质体转染的实验原理与操作步骤大全

转染详细步骤大攻略范例----真核重组表达质粒pDsRed-N1-NS1在A549细胞中表达按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，测得质粒浓度为410.32ng/µl。

将培养的A549细胞铺板，待细胞密度长到90%左右时，按lipo2000说明书转染A549细胞，36h后于荧光显微镜下观察DsRed-NS1融合蛋白的表达情况。

具体操作步骤如下：1）质粒准备按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，具体步骤如下：(1) 取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1 min,尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

(2) 向留有菌体沉淀的离心管中加入200µl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA）,使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

（注：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低）(3)向离心管中加入200µl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

（注：混匀一定要温和，以免污染基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏）(4)向离心管中加入250µl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。

12000rpm 离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。

（注：溶液P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。

如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清）(5)加入1/5体积冰预冷的去内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊，冰浴2min 至溶液变清亮。

(6)37℃水浴5 min，不时振荡，溶液又变浑浊。

12000rpm室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油状相含内毒素。

(7)将质粒DNA上层水相转移至新管，弃下层油状相，注意不要吸入油状相，重复抽提三次，即重复步骤5-7三次。

脂质体转染mrna细胞原理
脂质体转染mRNA细胞的原理是利用脂质体作为载体，将目的mRNA包裹在其内部，然后通过与细胞膜融合让mRNA进入细胞质，最终达到将目的mRNA表达出来的目的。

脂质体是由磷脂和胆固醇等组成的微小囊泡结构，与细胞膜结构相似。

其内部的疏水层可以容纳水溶性的物质，包括mRNA分子。

脂质体转染mRNA的步骤如下：
1. 准备目的mRNA：目的mRNA是指需要转染到细胞内进行表达的mRNA，可以是外源的mRNA，也可以是经过In vitro 转录合成的人工合成mRNA。

这些mRNA一般会在实验室中事先准备好。

2. 制备脂质体：将脂质体粉末或液体悬浮液溶解在适当的缓冲液中，形成脂质体溶液。

脂质体通过磷脂的双层结构来包裹mRNA，形成稳定的脂质体-mRNA复合物。

3. 混合脂质体与mRNA：将目的mRNA与脂质体溶液混合，并进行充分的混合和搅拌。

这样就可以使mRNA和脂质体发生相互作用，形成脂质体-mRNA复合物。

4. 转染细胞：将脂质体-mRNA复合物加入到需要转染的细胞培养液中，使其与细胞接触。

脂质体复合物会与细胞膜融合，从而使脂质体内的mRNA进入细胞质。

5. mRAN转录和表达：在细胞质中，脂质体释放的mRNA会
被细胞的核糖体识别，进而进行mRNA转录和翻译，最终使
该mRNA编码的蛋白质在细胞内得到表达。

脂质体作为转染载体具有一定的优势，如制备简单、生物相容性好等。

但是，脂质体转染也存在一些问题，如转染效率较低、引起细胞毒性等。

因此，在实际应用中需对转染条件进行优化，以提高转染效率和减少毒性。

阳离子脂质体基因转染脂质体（lipofectinregeant，LR）试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n，n，n-Trimethylammonium Chloride（DOTMA）和Dioleoylphotidye-thanolamine（DOPE）的混合物[1：1（w/w）]。

它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。

转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。

用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间（2~24小时）。

因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。

细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。

1、操作步骤[方法一]：（1）细胞培养：取6孔培养板（或用35mm培养皿），向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时（汇合过分，转染后不利筛选细胞）。

（2）转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液（为转染每一个孔细胞所用的量）A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染（如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量）。

（3）转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。

（4）转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6~24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。

脂质体转染的实验原理与操作步骤大全日期:2012-06-25 来源:互联网作者:青岚点击:3644次摘要:细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等, 本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。

找产品,上生物帮 >> >>细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等,本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。

脂质体 (lipofectin regeant, LR 试剂是阳离子脂质体 N-[1-2, 3-Dioleyoxy , Propyl]-n, n , n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA和 Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE的混合物 [1:1(w/w]。

它适用于把 DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中 ,是目前条件下最方便的转染方法之一。

转染率高,优于磷酸钙法,比它高5~100倍,能把 DNA 和 RNA 转染到各种细胞。

用 LR 进行转染时, 首先需优化转染条件, 应找出该批 LR 对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批 LR 都要做:第一,先要固定一个 DNA 的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间, DNA 可从1~5μg和孵育时间 6小时开始,按这两个参数绘出相应 LR 需用量的曲线,再选用 LR 和 DNA 两者最佳的剂量,确定出转染时间 (2~24小时。

因 LR 对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过 24小时为宜。

细胞种类:COS-7、 BHK 、 NIH3T3、 Hela 和 Jurkat 等任何一种细胞均可作为受体细胞。

脂质体转染原理及操作步骤脂质体转染是一种常用的基因传递技术，用于将外源的核酸（例如DNA、RNA）转入细胞内。

脂质体是由人工合成的类似于细胞膜的双层脂质膜组成，具有较好的生物相容性和可降解性，因此可以用来包裹并传递外源核酸进入目标细胞内。

本文将详细介绍脂质体转染的原理和操作步骤。

脂质体由两个疏水性脂质尾部和一个亲水性脂质头部组成，形成类似生物细胞膜的双层结构。

这种双层结构使得脂质体可以包裹水溶性的外源核酸，并形成脂质体-核酸复合物。

当复合物与细胞膜接触时，由于脂质体的类似性，这些复合物可以与细胞膜融合，并释放外源核酸进入细胞。

然而，简单地将脂质体-核酸复合物添加到细胞培养基中并不能有效地将外源核酸转入细胞内。

为了提高转染效率，常常需要使用电穿孔或钙磷共沉淀等方法，以增加细胞膜的通透性。

操作步骤：1.准备工作：-完整的脂质体转染试剂盒。

-DNA或RNA溶液。

-靶细胞。

-无菌操作条件下的实验室。

2.重组脂质体的合成：-按照试剂盒说明将脂质体复合物合成。

-使用无菌的工具和试剂。

3.核酸引物的制备：-将外源DNA或RNA与引物混合，使其形成核酸复合物。

4.细胞处理：-将培养皿中的细胞进行冲洗，去除培养基。

-将适量的细胞培养基添加到培养皿中，以保证细胞的正常生长。

5.导入核酸：-将所制备的核酸复合物滴加到细胞培养基中。

-将细胞培养皿置于无菌环境中，以便细胞吸收和利用核酸。

6.细胞培养：-按照细胞类型和所使用的培养基，将细胞置于恰当的培养条件下，并进行培养。

-根据需求添加所需要的生长因子和抗生素。

7.观察和分析：-在一定的培养时间后，观察细胞是否发生了显著的变化。

- 使用适当的实验方法（如PCR、Western blot等）检测外源基因的表达。

-观察并记录实验结果。

以上是脂质体转染的原理和操作步骤。

脂质体转染是目前常用的基因传递技术之一，可以用于研究基因功能、疾病治疗等领域。

随着技术的不断发展，转染效率和特异性将逐渐提高，为研究和治疗带来更多的机会和挑战。

脂质体转染操作步骤进行实验之前，请先规划好实验，一般细胞转染需要24h-72h，所以要充分了解细胞生长速度，计算所需脂质体和DNA的储备量，并确认准备好所需试剂：Opti-MEM无血清培养基，Lipofectamine转染试剂，以及DNA，这个一定要确认好。

1、细胞铺板（1）一般会选择复苏细胞传代3-4次（汇合率达到90%之前对细胞进行传代，不要长到100%），从解冻过程中恢复过来可以稳定生长的细胞进行细胞转染，传代次数高(>30-40)时，细胞的生长速度和形态会改变。

（2）如果提总蛋白，一般选择六孔板进行转染，因为转染的细胞提取蛋白的总量能达到200ug，一般够做并且需要的DNA和Lipofectamine又相对比较少。

（3）传代条件取决于所用的细胞系。

对于快速生长的细胞，倍增时间为16小时(如HEK293)。

对于生长缓慢的细胞，倍增时间为36小时(如原代细胞)。

（4）转染当天，将细胞铺板。

如果在转染前一天或更早时间铺板，转染效率可能下降，如果是简单细胞系的转染，可以直接在前一天晚上铺板，第二天来转染。

转染时，细胞密度会影响转染效率，细胞密度保持在汇合率为70-90%（这个前提是转染24h，如果转染48h则需要汇合率为50-70%），细胞的铺板和转染也可同时进行。

2、细胞转染吸去培养皿中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。

更换无血清培养基。

准备转染制备液，用灭菌后的EP管制备。

以六孔板为例，A液：用200μl Opti-MEM稀释4μg质粒；B液:用200μl Opti-MEM稀释10μl lipo2000，分别将A液、B液轻轻混匀，静置5min，吸取B液加入至A液中，轻轻混匀，室温静置20min。

加入转染试剂到每个孔的培养基中，6h后，更换成完全培养基，继续培养到24-48小时（不同的质粒和脂质体最佳搭配比例不同，转染前，应该摸一个最佳配比。

质粒：脂质体=1：1，1：1.5，1：2，1：2.5，1：3，1：3.5的梯度比例来检测最佳转染比例，一般质粒有带荧光，可以通过观察每组荧光强弱来判断转染效率）。

脂质体转染原理及操作步骤
脂质体转染是一种常用的基因传递方法，通过将目标基因以及负载该基因的脂质体添加到细胞培养物中，使其与细胞膜融合，并将基因导入到细胞内。

脂质体转染的操作步骤如下：
1. 提取脂质体：首先，从脱脂牛奶或其它来源中提取脂质体。

可以通过超声处理、离心等方法将脂质体分离出来。

2. 混合目标基因与脂质体：将目标基因与脂质体混合，目标基因可以是质粒DNA、RNA等。

将基因加入脂质体溶液中，进
行充分混合。

3. 孵育：将脂质体-基因混合物在室温下孵育一段时间，通常
为15-30分钟。

这一步主要是让脂质体与基因充分结合。

4. 加入细胞：将孵育好的脂质体-基因混合物加入需要转染的
细胞培养物中。

细胞种类可以是哺乳动物细胞、脊椎动物细胞、细菌等。

5. 孵育细胞：将细胞培养物保持在适宜的培养条件下，孵育一定时间，让细胞充分吸收脂质体-基因复合物。

6. 收获转染细胞：经过一定时间的孵育后，可从培养物中收获转染细胞。

可以根据实验需要进行后续分析。

需要注意的是，脂质体转染的效率与脂质体组分、浓度、孵育时间、细胞类型等因素密切相关，需要进行参数优化才能达到较高的转染效果。

脂质体转染原理
脂质体转染是一种常用的基因传递工具，可以将外源DNA有效地引导进入目标细胞。

其原理基于脂质体的特殊结构和细胞膜的特性。

脂质体是由疏水性和亲水性分子组成的结构，可以形成类似细胞膜的双层结构。

在细胞培养条件下，脂质体会与目标DNA 结合，形成脂质体/DNA复合物。

当脂质体/DNA复合物与目标细胞接触时，由于脂质体与细胞膜的亲和性，复合物可以通过与细胞膜融合的方式进入细胞。

一旦脂质体/DNA复合物进入细胞，复合物会被内吞作用包裹成内吞体，内吞体随后与溶酶体融合形成溶酶体内嘌呤体。

在溶酶体内，复合物会被酸性环境和溶酶体内含的酶分解，释放出DNA分子。

最后，释放出的DNA会进入到细胞核中，并与细胞核中的染色体相结合，启动目标基因的表达。

脂质体转染的原理可以归纳为三个步骤：脂质体与DNA结合形成复合物，复合物与细胞膜融合进入细胞，复合物在细胞内释放DNA并进入细胞核。

这个过程提供了一种可靠的手段，用于将外源DNA引导进入目标细胞，实现基因传递和表达。

细胞的脂质体转染法和电穿孔转染法（一）脂质体转染一、实验试剂及器材Lipofectamine® 3000 Transfection Reagent，质粒DNA(0.5-5 μg/μL储液)，Opti-MEM®减血清培养基，培养板，酒精灯，离心机，微量移液器，离心管等。

二、实验步骤1. 接种细胞至70－90%汇合度时转染；2. 使用Opti-MEM®减血清培养基稀释Lipofectamine® 3000试剂（2管），充分混匀（6孔板Opti-MEM®培养基为125 μL× 2，Lipofectamine® 3000为3.75和7.5 μL）；3. 在每管已稀释的Lipofectamine® 3000试剂中加入稀释的DNA（用P3000TM试剂稀释）（1:1比例）；4. 室温孵育5分钟；5. 加入DNA－脂质体复合物至细胞中；6. 37°C(PK-15在39°C下培养)孵育细胞2–4天，然后分析转染细胞。

三、注意事项1. 在无血清培养基（如Opti-MEM®减血清培养基）中制备DNA－Lipofectamine® 3000脂质体复合物，直接将其加入含细胞培养基的细胞中（在血清／抗生素存在或不存在时均可）；2. 转染后无需去除转染复合物或者更换／添加培养基；3. Lipofectamine® 3000试剂用量各有不同，测试推荐的两种浓度的Lipofectamine® 3000试剂，以确定最佳用量，开始新的转染；4. Lipofectamine® 3000试剂应放在4℃储存（切勿冷冻）。

附上Lipofectamine 3000 REagent Protocol：（二）电穿孔转染法一、实验试剂及器材BTX ECM2001®2001细胞电融合仪，细胞，胰蛋白酶，电转液，DMEM，培养板，离心机等。

细胞转染实验方法步骤详解实验方法原理上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。

外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。

电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。

但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。

利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。

上图是本次实验采用的脂质体中阳离子组分的结构的示意图。

本次实验采用的脂质体是promega公司的TransFast脂质体试剂，它是一种阳离子脂质体和中性脂质体的混合物，是对于本次实验中采用的293T细胞优化的转染试剂。

实验材料293T细胞MyoD表达质粒EGFP表达质粒试剂、试剂盒DMEM培养基青霉素FCSPBSEDTA转染试剂链霉素小牛血清仪器、耗材微量移液器Tip头涡旋振荡器恒温水浴箱台式离心机培养皿转染管离心管观察用倒置显微镜荧光显微镜CCD实验步骤一、细胞传代1. 试验准备：200 ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。

2. 弃掉培养皿中的培养基，用1 ml的PBS溶液洗涤两次。

3. 用Tip头加入 1 ml Trypsin液，消化1分钟（37℃，5%CO2）。

用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。

4. 加入1 ml的含血清培养基终止反应。

5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。