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质粒转染原理
质粒转染是将外源质粒DNA导入到目标细胞中的一种常用实
验技术。
其原理是利用电穿孔、钙磷共沉淀、脂质体包裹等方法，使质粒DNA通过细胞膜进入细胞质，进而被细胞核摄取
并表达。
在电穿孔方法中，利用高压电脉冲刺激细胞，破坏细胞膜的完整性，形成瞬时的孔道，使质粒DNA得以进入细胞质。
钙磷
共沉淀方法则是在质粒DNA和钙离子的存在下，通过静电相
互吸引，形成复合物，再通过与细胞表面的糖类结合，被细胞摄取。
脂质体包裹法则是将质粒DNA与脂质体混合，形成质
粒与脂质体的复合体，通过脂质体与细胞膜的融合，将质粒DNA引入细胞。
质粒DNA一旦进入细胞质，可以通过胞浆中的酶降解，也可
能被转运至细胞核。
如果质粒DNA能够成功摄取到细胞核内，并与细胞核中的转录因子结合，就可以开始转录和翻译，从而实现外源基因的表达。
质粒转染技术广泛应用于基因工程与生物学研究中，例如进行基因敲除、基因突变、基因过表达等实验，以及靶向基因治疗等领域。
通过质粒转染，可以使目标细胞表达所需的外源基因，从而研究其功能、检测其表达产物，并进一步探究相关生物学问题。
gfp-lc3质粒转染细胞步骤
一、实验步骤:
实验步骤分为四个环节,依次是:接种细胞，准备gfp-lc3 DNA，脂质体复合物，共培养，检测转染效率。
1、接种细胞:
（1 )细胞悬液浓度调整为1-2 x 105备用,取六孔板置于超净台面上,每孔接种细胞悬液2ml ,培养过夜。
（2 )观察细胞状态:细胞形态均一, 边界清晰,密度达到80%左右的汇合度为最适转染状态。
（3 )将细胞培养板放回培养箱待用。
2、准备gfp-lc3复合物;
1 参照脂质体使用说明书: 6孔板选择转染体系为每孔加入4ugDNA和10ul转染脂质体，分别溶解在250ul体系当中。
然后分别加入12ul质粒DNA和30ul脂质体,做好标记。
2 2min后,待溶液均一,将脂质体溶液全部吸出,滴加到质粒DNA溶液中，吹打混匀。
静置,室温下孵育20min ,以待gfp-lc3复合物的形成。
3、gfp-lc3 复合物与细胞共培养:（1 )取出细胞培养板,吸弃培养孔内培养液。
（2 )吸取制备好的DNA-lipid混合液,每孔加入500ul转染体系。
（3)轻轻摇晃混匀，然后补充1mlopti-MEM,盖好盖子放入培养箱培养。
4、检测转染效率。
（1 ) CO2培养箱里取出培养板,进行荧光显微镜观察,观察细胞状态。
（2 )切换到激光光源观察绿色荧光,拍照。
一、实验目的1. 掌握真核细胞转染的基本原理和操作方法。
2. 学习通过转染技术将外源基因导入真核细胞，并观察基因表达情况。
3. 了解转染效果的评价方法。
二、实验原理真核细胞转染是指将外源DNA或RNA分子导入真核细胞的过程。
根据转染方法的不同，可以分为物理转染、化学转染和电穿孔转染等。
本实验采用化学转染方法，利用脂质体介导外源基因进入细胞。
三、实验材料1. 真核细胞：HEK293细胞2. 外源基因：绿色荧光蛋白（GFP）表达质粒3. 脂质体：Lipofectamine 20004. 实验试剂：磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、二甲基亚砜（DMSO）、Trizol试剂、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、激光共聚焦显微镜等。
四、实验方法1. 细胞培养：将HEK293细胞接种于6孔板中，培养至细胞密度达到80%左右。
2. 外源基因质粒制备：将GFP表达质粒用DMSO溶解，配制成浓度为10μg/μl的储备液。
3. 转染：取2孔细胞，分别加入100μl含有10μg GFP表达质粒的DMSO溶液和100μl Lipofectamine 2000溶液，混匀后室温放置5分钟。
将混合液加入细胞中，轻柔混匀，37℃、5%CO2培养箱中培养6小时。
4. 实时荧光定量PCR检测：转染后24小时，提取细胞总RNA，进行反转录得到cDNA。
以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR检测GFP基因的表达水平。
5. 激光共聚焦显微镜观察：转染后48小时，观察细胞中GFP的表达情况。
五、实验结果1. 实时荧光定量PCR结果：转染组GFP基因的表达水平明显高于未转染组，表明外源基因已成功导入细胞。
2. 激光共聚焦显微镜观察：转染组细胞中GFP表达明亮，荧光信号明显；未转染组细胞中GFP表达较弱，荧光信号不明显。
六、实验讨论1. 脂质体转染方法具有操作简便、效率较高、对细胞损伤较小等优点，适用于多种真核细胞的转染。
2. 转染效果受多种因素影响，如转染试剂、转染时间、细胞密度等。
lipo2000转染原理Lipo2000转染原理。
Lipo2000是一种常用的转染试剂，广泛应用于细胞生物学和分子生物学研究中。
它能够有效地将外源核酸（如DNA、RNA）导入到细胞内，为基因编辑、基因表达调控等实验提供了重要的工具。
那么，Lipo2000是如何实现这一转染功能的呢？接下来，我们将从分子水平上解析Lipo2000的转染原理。
Lipo2000转染的基本原理是利用脂质体的特性，将外源核酸包裹在脂质体内，通过与细胞膜的融合，将核酸导入到细胞内。
脂质体是由两层疏水性脂质分子构成的囊泡结构，内部是亲水性的核酸包裹区域。
而细胞膜也是由疏水性脂质分子构成的，因此脂质体与细胞膜有着一定的亲和性。
在转染过程中，Lipo2000首先与外源核酸形成复合物。
这一步骤是非常关键的，因为脂质体必须能够有效地包裹核酸，形成稳定的复合物。
Lipo2000作为阳离子脂质体，其阳离子性质使其能够与DNA或RNA的负电荷相互作用，形成复合物。
这种相互作用不仅有助于稳定复合物的结构，还能够促进复合物与细胞膜的结合。
接下来，Lipo2000与细胞膜发生相互作用。
细胞膜上的磷脂分子与脂质体上的磷脂分子之间会发生相互作用，从而促进脂质体与细胞膜的结合。
这种结合并非简单的物理吸附，而是通过一系列的化学作用，使脂质体能够与细胞膜融合，释放内部的核酸包裹区域。
最后，核酸被导入到细胞内。
脂质体与细胞膜融合后，核酸包裹区域内的核酸会被释放到细胞质中。
这一过程并不是简单的扩散，而是通过细胞自身的内吞作用，将核酸包裹区域内的核酸引入到细胞内。
一旦核酸进入细胞内，就可以发挥其功能，如表达特定的蛋白质、调控基因的表达等。
总的来说，Lipo2000的转染原理是利用脂质体与细胞膜的相互作用，将外源核酸导入到细胞内。
这一过程涉及到复合物的形成、脂质体与细胞膜的结合以及核酸的内吞等多个步骤。
了解Lipo2000的转染原理，有助于我们更好地应用这一试剂，进行相关的细胞实验和研究工作。
4. 哺乳动物细胞siRNA转染4.1 转染方法：将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：磷酸钙共沉淀；电穿孔法；DEAE-葡聚糖和polybrene；机械法；阳离子脂质体试剂。
目前用的最多的是阳离子脂质体法。
4.1.1 磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
4.1.2 电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。
将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
4.1.3 DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。
通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。
两种试剂都已成功用于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
4.1.4 机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。
显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。
基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
4.1.5 阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。
这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。
生产脂质体转染试剂工艺流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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DNA转染步骤1 转染前一天接种细胞于6孔板，0.5-2×105每孔，2ml无抗生素培养基每孔，第二天转染时细胞达到90-95%每孔。
2 转染前半小时换Opti-MEM无血清培养基1.5ml。
3 A液：DNA 5ug 加入245ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀。
4 B液：脂质体使用前轻轻混匀，脂质体10ul 加入245ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀，室温静止5min。
5 B液加入A液，用枪轻轻混匀，室温静止20min。
6 将混合液均匀分散慢慢滴加到6孔板细胞中，边滴加变前后左右十字交叉摇晃。
7 孵箱37℃培养48h（转染时间待定）。
8 第二天看细胞状态来决定是否换液。
9 同时设立细胞对照组，空白转染组。
siRNA转染步骤1 转染前一天接种细胞于6孔板，2ml无抗生素培养基每孔，第二天转染时细胞达到30-50%每孔。
2 转染前半小时换Opti-MEM无血清培养基1.5ml。
3 A液：siRNA 5ul（共100pmol）加入245ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀。
（siRNA按照说明书稀释）4 B液：脂质体使用前轻轻混匀，脂质体10ul 加入245ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀，室温静止5min。
5 B液加入A液，用枪轻轻混匀，室温静止20min。
6 将混合液均匀分散慢慢滴加到6孔板细胞中，边滴加变前后左右十字交叉摇晃。
7 孵箱37℃培养48h（转染时间待定）。
8 第二天看细胞状态来决定是否换液。
9 同时设立细胞对照组，空白转染组。
实验室通常用细胞培养瓶与孔板实验室通常用细胞培养瓶与孔板。
脂质体介导的真核细胞转染技术的基本原理
你们有没有想过，科学家们就像神奇的魔法师一样，能把一些特别的东西送到细
胞里面去，让细胞发生神奇的变化？今天，我们就来了解一种很厉害的技术，叫做脂
质体介导的真核细胞转染技术。这名字听起来有点长，有点复杂，不过没关系，我给
你们讲个小故事，你们就明白。
想象一下，细胞就像是一个个小小的房子，每个房子都有自己的大门和围墙，保
护着里面的东西。而科学家们，想把一些新的“宝贝”，比如说一些特殊的基因或者
药物，送到这些小房子里面去。但是，细胞的大门可不会随便打开，这可怎么办？
这时候，脂质体就像一个个小小的“快递员”登场！脂质体是什么？它，就像是
一个小小的泡泡，这个泡泡是由一些特殊的脂肪类物质组成的。我们可以把它想象成
一个装着礼物的小包裹。
比如说，科学家们想要把一个能让细胞发光的基因送到细胞里面去。他们就会先
把这个基因小心翼翼地包在脂质体这个小包裹里。就好像我们给礼物包上漂亮的包装
纸一样。然后，这些包着基因的脂质体就会靠近细胞。
细胞的表面，就像一个热闹的集市，有很多来来往往的东西。脂质体这个小“快
递员”很聪明，它会找到细胞表面一些特殊的“通道”或者“小路”，然后顺着这些
“通道”或者“小路”，慢慢地靠近细胞。
当脂质体靠近细胞后，它就会和细胞的膜融合在一起。这就好像两个泡泡碰到一
起，慢慢地合二为一。这样一来，脂质体里面包着的基因就顺利地进入到细胞里面去
了，就像快递员把礼物送到了收件人的家里一样。
一旦基因进入到细胞里面，它就会开始发挥作用。就像那个能让细胞发光的基
因，细胞有了这个基因后，就会像夜空中的星星一样，发出美丽的光芒。
lip2000转染说明书4. 哺乳动物细胞siRNA转染4.1 转染⽅法：将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转导⾄真核细胞中的⽅法主要有以下⼏种：磷酸钙共沉淀；电穿孔法；DEAE-葡聚糖和polybrene；机械法；阳离⼦脂质体试剂。
⽬前⽤的最多的是阳离⼦脂质体法。
4.1.1 磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极⼩的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进⼊⽬的细胞的细胞质。
沉淀物的⼤⼩和质量对于磷酸钙转染的成功⾄关重要。
在实验中使⽤的每种试剂都必须⼩⼼校准，保证质量，因为甚⾄偏离最优条件⼗分之⼀个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
4.1.2 电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的⾼场强电脉冲中转导分⼦。
将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染⾮常重要，因为过⾼的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜⽽裂解细胞。
⼀般，成功的电穿孔过程都伴随⾼⽔平（50%或更⾼）的毒性。
4.1.3 DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分⼦使得DNA 可以结合在细胞表⾯。
通过使⽤DMSO或⽢油获得的渗透休克将DNA复合体导⼊。
两种试剂都已成功⽤于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
4.1.4 机械法转染技术也包括使⽤机械的⽅法，⽐如显微注射和基因枪（biolistic particle）。
显微注射使⽤⼀根细针头将DNA，RNA或蛋⽩直接转⼊细胞质或细胞核。
基因枪使⽤⾼压microprojectile将⼤分⼦导⼊细胞。
4.1.5 阳离⼦脂质体试剂在优化条件下将阳离⼦脂质体试剂加⼊⽔中时，其可以形成微⼩的（平均⼤⼩约100-400nm）单层脂质体。
这些脂质体带正电，可以靠静电作⽤结合到DNA的磷酸⾻架上以及带负电的细胞膜表⾯。
脂质体转染的实验原理与操作步骤大全
日期：2012-06-25 来源：互联网 作者：青岚 点击：3644次
摘要：
细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、
脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法
是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法
-脂质体转染的原理和操作步骤等。
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细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体
转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、
对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤
等。
脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy， Propyl]-n，
n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混
合物[1：1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的
转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各
种细胞。
用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的
用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物
与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应
LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2~24小时)。因
LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。
细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细
胞。
一、脂质体(liposome)转染方法原理
脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体((Iiposome)作为体内和体外输送载体的工具，
已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进人细胞。使
用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复
性。
中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳
离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电 的DNA自动结合到带正电的
脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被
导入细胞。
二、脂质体转染操作步骤
1
、操作步骤[方法一]：
(1)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1~2×105个
细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。
(2) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：
用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，
终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍
转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。
(3)转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。
(4)转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6~24小时，吸除无血
清转染液，换入正常培养液继续培养。
(5)其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。
注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。
2
、快速脂质体转染法操作步骤如下[方法二]：
(1)以5×105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时，使其达到50~60%板
底面积。
(2)在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下：
①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。
②旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。
③室温下放置5~10分钟，使DNA结合在脂质体上。
(3)弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入
1mL DNA/脂质体复合物，37℃培养3~5小时。
(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，继续培养14~24小时，
(5)吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培养
24~48小时。
(6)用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。
3
、稳定的脂质体转染方法如下：
(1)接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。
(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)、(3)步骤。
(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37℃培养48小时。
(4)吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，
方法参照细胞克隆筛选法进行。
三、个人经验：
本人用的是Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板转染单层贴壁细胞。(别
的方法可以参考生产商提供的protocol)
1、转染前1天将0.5～2×10
5
细胞接种于24孔培养板，并加入500ul不含抗生素的完
全培养基，以保证转染时细胞汇合达90～95%。
2、准备复合物
(1) 将0.8ug DNA稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中轻轻浑匀。
(2) 将2ul Lipofectamine2000稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中，轻轻浑匀，室
温孵育5分。注意：必须在25分内进行。
(3) 5分后将它们混合，并轻轻浑匀，室温孵育20分。
3、吸去培养板的培养基，用PBS或无血清培养基(最好)清洗细胞2次。
4、将复合物(总体积100ul)加入培养孔，前后摇动培养板使其分布均匀。
5、将细胞放入培养箱孵育4～6h后，可以更换含血清培养液去除复合物(也可不用)。
6、24～48h后可以观察转入基因表达情况。
7、稳定转染：换含血清培养基24h后将细胞以1：10(或更高比例)传代，1天后更换
筛选培养基筛选。
8、优化：要保证细胞汇合率达90～95%(比较高);DNA/ Lipofectamine2000比率1：
0.5～1：5，一般细胞1：2～3.
脂质体转染法的主要优点是可用将DNA转染至悬浮或者铁壁细胞培养、转染效率相对
较高、对基因片段大小的限制较小等，但是
阳离子脂质体对细胞的毒性相对较高，为了防止其毒性，要摸索好如下实验条件：脂
质体与质粒的比例、细胞转染时间等。
