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人肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，细胞上清及相关液体样本中肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。
用纯化的人肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肿瘤坏死因子α，再与HRP标记的肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的人肿瘤坏死因子α呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人肿瘤坏死因子α（TNF-α）浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：450pg/ml0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
小鼠肿瘤坏死因子α试剂盒的原理和操作方法
实验原理
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
往预先包被肿瘤坏死因子α(TNF-α)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并洗涤。
用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的肿瘤坏死因子α(TNF-α)呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。
操作步骤
1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3. 样本孔中加入待测样本40μL；空白孔不加。
4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
炎症因子TNF-α、IL-6和IL-4在溃疡性结肠炎中的表达及临床意义王少鑫;浦江;刘超群;李超;闫志辉;崔立红【摘要】目的：探讨炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factors-α,TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-4(IL-4)在溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)中的表达水平及临床意义。
方法利用葡聚糖硫酸钠盐(dextran sodium sulfate,DSS)诱导C57BL/6小鼠,构建UC小鼠模型,病理学鉴定结肠炎症组织及正常组织,并采用实时荧光定量PCR( RT-PCR)方法检测不同炎症组织中TNF-α、IL-6和IL-4的mRNA水平。
临床上,采用酶联免疫吸附试验( ELISA)方法检测62例UC患者及26名正常对照者血清中TNF-α、IL-6和IL-4的水平,分析炎症因子与结肠炎病变的相关性。
结果 UC动物模型中,结肠炎症组织TNF-α、IL-6的mRNA表达水平明显高于正常组织(P<0.05),而IL-4 mRNA表达水平明显低于正常组织(P<0.01)。
UC活动期患者血清TNF-α、IL-6水平明显高于正常对照组和UC缓解组(P<0.05),且与结肠炎严重程度呈正相关；而IL-4水平明显低于对照组和UC缓解组(P<0.05),且与UC严重程度呈负相关。
结论促炎因子TNF-α、IL-6和抑炎因子IL-4的表达失衡与UC的病情进展相关,对UC的诊断和临床评估具有重要意义。
%Objective To investigate the clinical significance of cytokines-TNF-α, IL-6 and IL-4 in ulcerative colitis ( UC) . Methods UC mouse model was induced by DSS and identified in pathology. The mRNA expression of TNF-α, IL-6 and IL-4 in colitis and normal tissues were detected by real-time PCR. The serum TNF-α, IL-6 and IL-4 of 62 UC patients and 26 healthy controls were measured by ELISA, and the correlation of cytokines with colitis severity was ana-lyzed. Results In UC model, the mRNA expressionsof TNF-α, IL-6 in colitis tissues were higher than that in normal tissues ( P<0 . 05 ) , while the mRNA expression of cytokine IL-4 in colitis tissues was lower than that in normal tissues (P<0. 01). Moreover, the serum TNF-α and IL-6 in active UC patients were higher than that in healthy controls and remission UC patients (P<0. 05), they were positively related with UC severity. However, the serum IL-4 in active UC patients was lower than that in healthy controls and remission UC patients ( P<0 . 05 ) , it was negatively related with UC severity. Conclusion The imbalance of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines are correlated with colitis se-verity, which is very important for diagnosis and clinical appraisal of UC.【期刊名称】《胃肠病学和肝病学杂志》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】3页(P104-106)【关键词】溃疡性结肠炎;肿瘤坏死因子-α;白介素-6;白介素-4【作者】王少鑫;浦江;刘超群;李超;闫志辉;崔立红【作者单位】海军总医院消化内科，北京100048;海军总医院消化内科，北京100048;海军总医院消化内科，北京100048;海军总医院消化内科，北京100048;海军总医院消化内科，北京100048;海军总医院消化内科，北京100048【正文语种】中文【中图分类】R574.62溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种原因不明的慢性非特异性炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)，据流行病学调查结果表明，发病率在世界范围内呈逐年升高的趋势，目前认为UC 与感染、环境、免疫以及遗传等多种因素有关，但具体机制尚不清楚，有报道免疫调节机制中炎症细胞因子在UC 的发病中可能发挥重要作用［1］。
小鼠酶联免疫检测试剂盒,小鼠粒细胞集落刺激因子（G-CSF）酶联分析检测ELISA试剂盒使用说明书国内权威的科研试剂供应商，乔羽生物专业经营进口分装和原装、国产的Elisa试剂盒，品质保证，技术严格，无效果退款退货。
Elisa kit规格：48孔配置/96孔配置标准品稀释液：1.5ml×1瓶酶标试剂：3 ml×1瓶（48）/6 ml×1瓶（96）本试剂仅供研究使用标本：血清或血浆上海乔羽生物专业供应：使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本组织因子途径抑制物（G-CSF）含量。
试验原理：G-CSF试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知G-CSF浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。
先将G-CSF和生物素标记的抗体同时温育。
洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。
再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。
产生颜色。
颜色的深浅和样品中G-CSF的浓度呈比例关系。
试剂盒内容及其配制试剂盒成份（2-8℃保存）96孔配置48孔配置配制96/48小鼠份酶标板1块板（96T）半块板（48T）即用型塑料膜板盖1块半块即用型标准品：80ng/ml 1瓶（0.6ml）1瓶（0.3ml）按说明书进行稀稀空白对照1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）即用型标准品稀释缓冲液1瓶（5ml）1瓶（2.5ml）即用型生物素标记的抗G-CSF抗体1瓶（6ml）1瓶（3.0ml）即用型亲和链酶素-HRP 1瓶（10ml）1瓶（5.0ml）即用型洗涤缓冲液1瓶（20ml）1瓶（10ml）按说明书进行稀释底物A 1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型底物B 1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型终止液1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型标本稀释液1瓶（12ml）1瓶（6.0ml）即用型自备材料1．蒸馏水。
2．加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
第1篇免疫检测法是一种利用抗原与抗体特异性结合原理，检测生物体内各种抗原和抗体含量的技术。
随着生物技术的发展，免疫检测法在医学、生物工程、食品安全、环境保护等领域得到了广泛应用。
本文将详细介绍免疫检测法的分类及其应用。
一、免疫检测法的基本原理免疫检测法的基本原理是抗原与抗体特异性结合。
当抗原进入生物体后，生物体会产生特异性抗体，抗体与抗原结合形成抗原抗体复合物。
通过检测抗原抗体复合物，可以了解生物体内抗原或抗体的含量。
二、免疫检测法的分类1. 酶联免疫吸附测定（ELISA）ELISA是一种基于抗原抗体特异性结合原理的免疫检测方法。
该方法具有操作简便、灵敏度高、特异性强、检测范围广等优点。
ELISA主要用于检测各种病毒、细菌、寄生虫、肿瘤标志物、自身抗体等。
（1）间接ELISA：以抗原包被固相载体，加入待测抗体，再加入酶标记的第二抗体，最后加入底物显色。
通过检测酶催化底物产生的颜色变化，判断待测抗体含量。
（2）直接ELISA：将酶标记的抗体直接包被在固相载体上，加入待测抗原，再加入底物显色。
通过检测酶催化底物产生的颜色变化，判断待测抗原含量。
（3）竞争性ELISA：待测抗体与酶标记抗体竞争结合抗原，通过检测酶催化底物产生的颜色变化，判断待测抗体含量。
2. 免疫荧光技术（IFA）免疫荧光技术是一种利用荧光物质标记抗体或抗原，检测生物体内抗原或抗体含量的方法。
该方法具有操作简便、灵敏度高、特异性强、可检测多种生物分子等优点。
（1）直接免疫荧光法：荧光标记的抗体直接与抗原结合，通过荧光显微镜观察荧光信号。
（2）间接免疫荧光法：荧光标记的第二抗体与抗原抗体复合物结合，通过荧光显微镜观察荧光信号。
3. 放射免疫测定（RIA）放射免疫测定是一种利用放射性同位素标记抗原或抗体，检测生物体内抗原或抗体含量的方法。
该方法具有灵敏度高、特异性强、可检测多种生物分子等优点。
（1）直接RIA：放射性同位素标记的抗原直接与待测抗体结合，通过放射性计数仪检测放射性信号。
小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫分析（ELISA）
试剂盒使用说明书
本试剂仅供研究使用
目的：本试剂盒用于测小鼠血清，血浆及相关液体样本中肿瘤坏死因子α(TNF-
α)的含量。
实验原理：
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。
用纯化的小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肿瘤坏死因子α(TNF-α)，再与HRP标记的肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的肿瘤坏死因子α(TNF-α)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)浓度。
试剂盒组成：
注意事项：
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。
一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计
算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
操作步骤
1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标
准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。
（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为1800ng/L，1200ng/L ，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样
品孔。
在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此
重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
15分钟.
10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。
测定应在加终止
液后15分钟以内进行。
样本处理及要求：
1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上
清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心
20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程
中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/
分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分
钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
用液氮迅速冷冻保存备
用。
标本融化后仍然保持2-8℃的温度。
加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上
进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
试剂盒性能：
1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.95以上。
2.批内与批见应分别小于9%和11%
计算：
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
检测范围：
100ng/L -2000ng/L
保存条件及有效期：
1.试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6个月。
