RuBisCo

§４补充2-光呼吸§４补充2-光呼吸基本知识概念：植物细胞在光照和高O2低CO2情况下发生的吸收O2和释放CO2的过程。

产生的原因：Rubisco是一种兼性酶，其催化方向取决于CO2和O2的分压。

当CO2分压高而O2分压低时,RuBP（C5）与CO2经此酶催化生成2分子的PGA(C3)，进行光合作用；反之,则RuBP 与O2在此酶催化下生成1分子PGA和1分子磷酸乙醇酸(C2化合物),后者在磷酸乙醇酸酯酶的作用下变成乙醇酸，是光呼吸的底物，进入C2途径。

光呼吸与光合作用是密切联系的。

光呼吸在叶绿体与过氧化体中吸收氧气，在线粒体中放出CO2。

光呼吸是一个氧化过程，被氧化的底物是乙醇酸。

场所：叶绿体、细胞质基质、线粒体意义：1、消耗掉光反应产生的过多的H]和ATP，防止强光对细胞结构的破坏。

2、光呼吸产生的CO2可以作为暗反应阶段的原料光呼吸与细胞呼吸（暗呼吸）的区别于联系联系：都是消耗O2产生CO2的过程区别条件：光呼吸需要光，与光合作用同时进行；细胞呼吸有光无光都可进行能量：光呼吸消耗能量；细胞呼吸释放能量场所：光呼吸在叶绿体、细胞质基质和线粒体；细胞呼吸在细胞质基质和线粒体巩固练习1、光呼吸是进行光合作用的细胞在光照和O2/CO2值异常时发生的一种生理过程（如下图所示），该过程是细胞在Rubisco酶的催化下，消耗O2，生成CO2，借助叶绿体、线粒体等多种细胞器共同完成的消耗能量的反应。

虽然光呼吸大约抵消了30%的光合作用储备能量，但其对细胞有着很重要的保护作用。

（1）据图可知，光呼吸与光合作用都利用了______________为原料，但光合作用在______阶段实现了该物质的再生，而光呼吸最终将该物质彻底氧化分解并产生______。

（2）Rubisco酶的存在场所为__________，这种酶既能催化物质“C-C-C-C-C”和O2反应，也能催化物质“C-C-C-C-C”和CO2反应，其两面性与酶的_______（特性）相矛盾，推测O2/CO2值______（高、低）时，有利于光呼吸而不利于光合作用。

RuBP羧化酶是一种双功能酶，即可催化RuBP的羧化反应，又可催化加氧反应，故齐全名为RuBP羧化酶/加氧酶（RuBP carboxylase/oxygenase,简称Rubisco）。

Rubisco 普遍存在于自养生物中，在C3植物中含量较为丰富，占叶可溶性蛋白质的50%以上，是自然界最丰富的一种蛋白质。

在叶绿素间质中浓度可达300mg/ml。

同时，Rubisco 也是高等植物中有机氮的重要贮藏形式。

通过本实验进一步掌握光合作用中的关键酶Rubisco的性质，用分光光度法测定Rubisco的羧化活性。

【实验原理】Rubisco催化RuBP与一份子CO2结合，产生两分子PGA，PGA在3-磷酸甘油酸激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下，产生3-磷酸甘油醛，并使还原型辅酶I（NADH）氧化，反应如下：RuBP+CO2+H2O----2PGA3-PGA+ATP------1,3-二磷酸甘油酸+ADP1,3-二磷酸甘酸+NADP+H+ -------3-磷酸甘油醛+NAD+通过上述偶联反应，可讲3-PGA的变化转变为NADP的变化来测定，因此可用紫外分光光度计在340nm处测定NADP的减少量来计算酶活力。

【实验材料】植物叶片【仪器设备及用品】紫外分光光度计，冷冻离心机，匀浆器或研钵，移液管等【试剂药品】1.RuBPCase提取介质：40mmol/L(PH7.6)Tris-HCl缓冲液，内含10mmol/LMgCl2、0.25mmol/LEDTA和5.0mmol/L谷胱甘肽。

2.反应介质：0.1mmol/LTris-HCl缓冲液（PH7.8），内含12mmol/LMgCl2和0.4mmol/LEDTA.3.50mmol/LATP溶液4.50mmol/L磷酸肌酸（Cr~P）溶液5.0.2mmol/LNaHCO3溶液6．160U/L磷酸肌酸激酶溶液7．25mmol/LRuBP溶液8．160U/L3-磷酸甘油醛脱氢酶溶液9．160U/L3-磷酸甘油酸激酶溶液10. 5mmol/LNADH溶液附注：U/L表示每升酶制剂含有多少酶活力单位。

Rubisco活化酶与植物抗逆性蒋德安，王盾，杨万军，金松恒，何漪，冯旭萍(浙江大学生命科学学院杭州余杭塘路388号 310058)高光强、干旱和高温胁迫是限制植物生长，降低光合速率的主要逆境因子。

Rubisco 活化酶(RCA)最先作为体内催化Rubisco活化而得名。

然而，人们在逆境条件下发现RCA可能参与一些植物的抗逆性。

本研究以反义RCA水稻为材料，研究了光强、干旱和高温胁迫对植物光合作用的影响。

结果表明：(1)当RCA含量降低到正常的1/3时，反义rca水稻的线性电子流(ETR)和最大光合电子传递速率(J max)大大低于野生型水稻，其ETR的光饱和点也大大低于野生型，PSII反应中心激发能捕获效率(F v′/F m′)和光化学猝灭(qP)明显下降。

在ETR达到光饱和后，反义rca水稻的非光化学猝灭(NPQ)和高能态猝灭(qE)都还在随光强持续上升。

在饱和光强下，反义rca水稻的NPQ 和qE与野生型水稻相差不大，但在中等光强下，NPQ和qE则大大高于野生型。

反义rca水稻的作用光关闭后荧光瞬时上升的幅度显著地提高，而且P700+在暗中还原速率也明显快于野生型水稻，这些都表明RCA含量减少促进了PSI的环式电子流，和类囊体腔的酸化和能量的耗散，以缓解碳同化下降导致激发能过剩。

(2)当RCA含量恢复到正常的2/3时，水分充足条件下，光合作用各参数恢复到正常水平，但反义rca水稻对干旱胁迫的反应比野生型敏感，主要表现为叶片易卷曲，光合迅速下降。

当土壤含水量降到田间最大持水量的60%时，野生型的光合下降了11%，而反义水稻下降了40%。

野生型的气孔导度降低了30%，而反义水稻下降了60%。

此外，反义rca水稻的蒸腾速率，内部CO2浓度和Rubisco初始活力的降低也比野生型明显，但Rubisco大小亚基的含量变化很少。

RCA含量表现出干旱上调趋势，尤其是RCAI(大亚基)含量。

在上述条件下，干旱除降低PSII 的线性电子流外，对其他叶绿素荧光参数，叶片叶绿素含量和含水量均无显著影响。

藻类固定co2的机制藻类的二氧化碳固定机制藻类是一种光合生物群，它们利用光能将无机碳(如二氧化碳)转化为有机化合物。

二氧化碳固定是藻类代谢的关键步骤，它不仅为自身的生长提供碳源，也是地球碳循环的重要组成部分。

碳酸酐酶催化的二氧化碳水合大多数藻类利用碳酸酐酶(CA)催化的方式来固定二氧化碳。

CA 是一种金属酶，可将二氧化碳水合为碳酸(H₂CO₃)。

碳酸是一种不稳定的化合物，可以迅速分解为氢离子(H⁺)和碳酸氢根离子(HCO₃⁻)。

鲁比斯科催化的卡尔文循环碳酸氢根离子(HCO₃⁻)随后被核糖二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)固定。

Rubisco是一种关键的酶，它催化二氧化碳与核糖二磷酸(RuBP)之间的反应，形成两个分子3-磷酸甘油酸(3-PGA)。

3-PGA是卡尔文循环中的第一个稳定中间产物。

卡尔文循环卡尔文循环是一个循环反应系列，将3-PGA还原为甘油醛-3-磷酸(G3P)，即一种基本的糖类。

该循环包括一系列酶促反应，利用光合作用产生的能量(ATP)和电子传递体(NADPH)将二氧化碳还原。

G3P的利用G3P可被用来合成多种生物分子，包括葡萄糖、淀粉、脂肪和蛋白质。

葡萄糖是藻类的主要能量来源，而淀粉则是储存的碳源。

脂肪是重要的能量储备，蛋白质对于细胞结构和功能至关重要。

其他二氧化碳固定机制除了碳酸酐酶和Rubisco之外，一些藻类还进化出了其他二氧化碳固定机制。

例如，某些蓝藻和红藻使用丙酮酸羧化酶(PEP羧化酶)途径，将二氧化碳固定为丙酮酸。

生理和环境因素对二氧化碳固定的影响藻类的二氧化碳固定受到多种生理和环境因素的影响。

例如，光照强度、温度、营养状况和pH值的变化都会影响酶的活性，从而影响二氧化碳固定的速率。

全球碳循环中的作用藻类二氧化碳固定是全球碳循环的重要组成部分。

通过固定大气中的二氧化碳，藻类有助于调节地球的碳平衡。

它们吸收的碳被转化为有机物质，最终被储存为沉积物或通过食物链传递。

潜在的应用藻类的二氧化碳固定能力引起了研究人员和产业的极大兴趣。

核酮糖1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)检测试剂盒(RuBP比色法)简介：植物光合作用的中，C3途径是所有植物共有的光合碳同化途径，核酮糖1,5-二磷酸羧化酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase，Rubisco或RuBPCo或RuBPCase)是一种酶(EC 4.1.1.39)，又称1,5-二磷酸核酮糖羧化酶，分子量约为53kD，由8个大亚基和8个小亚基组成，是光合作用中决定碳同化速率的关键酶，该酶活力的大小反应了植物光合能力的强弱，RUBP羧化酶是光合作用碳代谢中的重要的调节酶，主要存在于叶绿体的可溶部分，总量占叶绿体可溶蛋白50-60%。

在植物叶片发育过程中，此酶活性呈规律性的变化。

Leagene核酮糖1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)检测试剂盒(RuBP比色法)检测原理是在Rubisco催化核酮糖1,5-二磷酸(RuBP)，1分子后者与1分子的CO2结合，产生2分子的3-磷酸甘油酸(PGA)，后者通过3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛-1,3-二磷酸，并使NADH氧化。

因此1分子CO2被固定，伴随2分子NADH氧化，由NADH氧化的量就可计算Rubisco的活性，通过分光光度比色法(分光光度计)测定340处吸光度的变化，计算出NADH的消耗速率进一步推算出核酮糖1,5-二磷酸羧化酶活性水平。

该试剂盒主要用于检测植物样本、血清等中核酮糖1,5-二磷酸羧化酶活性，25T规格的试剂盒可检测23-24个样本。

组成：编号名称TE044925TStorage试剂(A): Rubisco Lysis buffer 250ml 4℃试剂(B): Rubisco Assay buffer15ml 4℃试剂(C): ATP Solution 3ml -20℃试剂(D): CP Solution 1.5ml -20℃试剂(E): CPK Solution 1ml -20℃试剂(F): PGK Solution 1ml -20℃试剂(G): GAPD Solution 1ml -20℃试剂(H): NADH 1支-20℃试剂(I): 碱性基液3ml RT 使用说明书1份自备材料：1、研钵或匀浆器2、离心管3、低温离心机4、恒温箱或水浴锅5、比色杯6、分光光度计操作步骤(仅供参考)：1、准备样品：①植物样品：取植物组织清洗干净，切碎，按植物组织：Rubisco Lysis buffer按一定比例，加入预冷的Rubisco Lysis buffer，冰浴情况下充分匀浆或研磨。

RuBP羧化酶是一种双功能酶，即可催化RuBP的羧化反应，又可催化加氧反应，故齐全名为RuBP羧化酶/加氧酶（RuBP c arboxy l ase/oxy genas e,简称Rubisco）。

Rubisco 普遍存在于自养生物中，在C3植物中含量较为丰富，占叶可溶性蛋白质的50%以上，是自然界最丰富的一种蛋白质。

在叶绿素间质中浓度可达300mg/ml。

同时，Rubisco 也是高等植物中有机氮的重要贮藏形式。

通过本实验进一步掌握光合作用中的关键酶Rubisco的性质，用分光光度法测定Rubisco的羧化活性。

【实验原理】Rubisco催化RuBP与一份子CO2结合，产生两分子PGA，PGA在3-磷酸甘油酸激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下，产生3-磷酸甘油醛，并使还原型辅酶I（NADH）氧化，反应如下：RuBP+CO2+H2O----2PGA3-PGA+ATP------1,3-二磷酸甘油酸+ADP1,3-二磷酸甘酸+NADP+H+ -------3-磷酸甘油醛+NAD+通过上述偶联反应，可讲3-PGA的变化转变为NADP的变化来测定，因此可用紫外分光光度计在340nm处测定NADP的减少量来计算酶活力。

【实验材料】植物叶片【仪器设备及用品】紫外分光光度计，冷冻离心机，匀浆器或研钵，移液管等【试剂药品】1.RuBPCase提取介质：40mmol/L(PH7.6)Tris-HCl缓冲液，内含10mmol/LMgCl2、0.25mmol/LEDTA和5.0mmol/L谷胱甘肽。

2.反应介质：0.1mmol/LTris-HCl缓冲液（PH7.8），内含12mmol/LMgCl2和0.4mmol/LEDTA.3.50mmol/LATP溶液4.50mmol/L磷酸肌酸（Cr~P）溶液5.0.2mmol/LNaHCO3溶液6．160U/L磷酸肌酸激酶溶液7．25mmol/LRuBP溶液8．160U/L3-磷酸甘油醛脱氢酶溶液9．160U/L3-磷酸甘油酸激酶溶液10. 5mmol/LNADH溶液附注：U/L表示每升酶制剂含有多少酶活力单位。

C 3和C 4植物叶细胞中Rubisco 和RCA的免疫金标记定位洪　健,何黎平,王卫兵,胡东维(浙江大学分析测试中心,浙江杭州310029) 基金项目:国家自然科学基金资助项目(N o.39970067). Rubisco (1,52二磷酸核酮糖羧化酶Π加氧酶)是植物进行光合碳同化的关键酶,它参与了光合作用碳固定和光呼吸碳氧化过程,调节两者之间的相对比例,其含量和活性与光合速率密切相关。

RC A(Rubisco 活化酶)是近年发现的一种可以调节Rubisco 活性的酶,能使Rubisco 在植株体内条件下达到最大活化程度。

有关这两个酶的性质、结构及生理功能已有不少研究,但细胞学定位的报道十分有限,尤其是RC A 的细胞定位无论是在低等植物还是高等植物中都很少见。

我们运用免疫金标记电镜技术,对几种C 3和C 4植物进行了Rubisco 和RC A 细胞学定位研究,明确了C 3和C 4植物中两种酶在叶绿体内的分布。

1　材料与方法实验植物叶片切成1mm ×3mm 小片,3%多聚甲醛21%戊二醛4℃下固定2h ,在-20℃冰箱中乙醇梯度脱水至100%,用Lowicryl K 4M 低温包埋剂在-20℃下逐级渗透、包埋,在-20℃冰箱中用长波长紫外线照射72h ,再室温照射24h ,使样品完全聚合,超薄切片捞在镍网上。

免疫金标记时先用ddH 2O 湿润切片5min ,然后在BL 液上封闭处理30min ;分别用水稻Rubisco 和RC A 多抗血清适当稀释后孵育60min ,再次漂洗和封闭后用15nm 胶体金A 蛋白探针标记60min ,经漂洗后用醋酸铀和柠檬酸铅各染色15min ,在日本J E O L 的J E M 21200EX 透射电镜下观察。

对照样品在标记时省却一抗孵育步骤。

2　结果与讨论经免疫金标记的切片在透射电镜下观察,属于C 3植物的水稻、大麦、青菜、蚕豆等Rubisco 金标记颗粒密集地分布在叶肉细胞的叶绿体基质区域,在基粒片层和基质片层上很少,在表皮气孔的保卫细胞、韧皮部细胞叶绿体中也有分布。

1,5-二磷酸羧化酶／加氧酶（Rubisco）植物生理学通讯第43卷第2期,2007年4月363核酮糖.1,5.二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)梅杨,李海蓝,谢晋,罗红艺华中师范大学生命科学学院,武汉430079Ribulose-I,5-bisphosphateCarboxylase/oxygenase(Rubisco)MEIY ang,LIHai—Lan,XIEJin,LUOHong—YiCollegeofLifeSciences,CentralChinaNormaliVPl魄Wuhan430079,China提要:文章就核酮糖一1,5.二磷酸羧化酶,加氧酶(Rubisco)的分布,结构,性质,分类与功能的研究进展作了介绍.关键词:核酮糖一1,5一二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco);Rubisco类似蛋白(RLP);羧化/氧化值;热稳定性;分类核酮糖一1,5一二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose一1,5一bisphosphatecarboxylase/oxygenase,Rubisco)是植物光合作用过程中固定CO,的关键酶,同时也参与植物的光呼吸代谢途径,消耗植物光合作用合成的有机物,由此造成的净光合效率损失高达50%(Lundqvist和Schneider1991;熊晓然等2003;Ashida等2005).因此,研究Rubisco对提高植物的光合作用效率有重要意义.自从1953年Calvin等在研究光合碳循环过程中证实其存在至今,有关Rubisco的一系列问题不断得到阐明,人们对其性质,结构,类型和功能等诸多方面有了更深入的了解,这方面的研究己取得了较大进展,本文就此作介绍.1Rubisco的分布与定位Rubisco广泛分布于具光合功能的细胞器中.它是一个含量很丰富的酶,据估计全世界Rubisco 的量约有4×10吨.Rubisco在C植物中主要定位于叶肉细胞叶绿体问质中,在基粒片层上也有少量分布;在C植物中则定位于维管束鞘细胞中的叶绿体问质内.低等藻类的Rubisco主要定位在淀粉核上.许多化能自养细菌和蓝藻中存在多角形细胞内含物,其中含有大量的羧化酶,称之为羧基化小体.羧基化小体最初是从氧化硫细菌中分离出来的,并且含有大量的Rubisco.有研究表明,羧基化小体是原核生物体内储存Rubisco的重要场所,能够协助Rubisco在低浓度的CO,条件下完成羧化.那不勒斯硫杆菌(Thi0baci,,U neapolitanus)的Rubisco缺陷菌株无羧基化小体的形成,且必须在高浓度的CO,下才能生长(Baker等1998).海洋氢弧菌(Hydrogenovibriomarinus)MH一110在CO,浓度低于0.15%时就会形成羧基化小体(Y oshizawa等2004).2Rubisco的结构采用x射线晶体衍射技术,人们解析了不同来源的Rubisco的晶体结构,包括烟草(Nicotiana tabacum),菠菜(Spinaciaoleracea),深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum),莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii),蓝藻聚球藻(y,zcDcDcc"PCC 6301),喜温红藻(Galdieriapartite),绿色硫细菌(chlorobiumtepidum),超耐热原始菌(菌, ThermococcuskodakaraensisKOD1)等(Kitano等2001;Parry等2003;Li等2005).Rubisco一般由多个大亚基(LSU)和小亚基(ssu)组成,其中大亚基的分子量为50～55kDa,小亚基为1218kDa(Ashida等2005).大亚基具有催化功能,小亚基仅具有调节作用.迄今的研究认为,Rubisco的大亚基由N,C两个结构域组成.N结构域从N末端开始,包括137个氨基酸,其中含有5股D折叠.C结构域中含有丰富的0c螺旋,其中以0c/D桶状结构域(al Dbarreldomain)最引人注目.它包括8个0c螺旋和8个D折叠,彼此连接成8个环.一个大亚基收稿2006.11—20修定2007—03一l2资助华中师范大学精品课程建设项目.通讯作者(E—mail:******************.ca:Tel:************).364植物生理学通讯第43卷第2期,2007年4月的羧基末端为另一个大亚基氨基末端部分覆盖,形成漏滴状的活性中心,Mg参与其中.Mg与亚基中的3个氨基酸残基所含有的氧原子发生作用,它们分别是氨甲酰化的Lys,侧链Asp3和Glulq4(Lundqvist和Schneider1991).C端结构域同时含有一个特征性的突环(Lo0p6).Loop6影响酶与气体分子(包括CO和O)的亲和性,一系列发生在环内的突变均能影响酶的羧化/氧化值(Q 值);在形成烯醇化中间产物的过程中,Loop6也起关键性的作用(Parry等2003).Loop6同时还影响酶活性状态的形成与维持.活性中心的模拟分析表明,Rubisco是否处于活性状态与活性中心(Lysl75,Lys201)和Loop6(Lys334)的3个Lys残基密切相关(熊晓然等2003).小亚基远离活性中心,其含有4个反向平行的p折叠和2个0c螺旋,p折叠和0c螺旋的核心含有疏水的氨基酸残基及与大小亚基相互作用有关的保守氨基酸残基.小亚基能促进CO,与Mg对酶的活化,维持和稳定酶的活化构象.Spreitzer (2003)认为,小亚基可能在进化过程中扮演聚集大亚基活性位点的角色,小亚基可能有更多特异性功能.3Rubisco的类型根据Rubisco大亚基氨基酸序列同源性及空间结构的相似性,可以将其分为4类,即I,II,III,IV型(表1).I型主宴存在于能够进行光合作用的有机体内,如高等植物,真核藻类,蓝藻,光能及化能自养细菌及其它一些原核生物,它由8个大亚基和8个小亚基组成,呈LS的结构.Tabita(1995)分析不同的I型Rubisco结构后,又将其分为"Green—like"和"Red—like"2类,并进一步将其划分为A,B,C及D4个亚类.II型Rubisco由2罐个大亚基组成,呈L的结构,其分子量为110-450kDa,主要存在于一些光能及化能合成细菌,海产甲藻如共生甲藻(SymbiodiniumSpp.),膝钩藻(Gonyaulaxpolyedra)等中(Rowan等1996;Nassoury等2001).尽管I型与II型Rubisco在活性位点上的氨基酸残基高度保守,但II型与I型的大亚基的同源性仍很低,仅为28%(Kitano等2001;Liao等2004).III型也仅由大亚基组成,呈L结构,存在于某些嗜热古生菌如菌,詹氏甲烷球菌等中(Klenk等1997;Watson和Tabita1999;Kitano等2001).有人研究Tk-Rubisco的结果表明,它是由大亚基组表1不同来源的Rubisco及其羧化/氧化值,结构和功能代表植物;一表示暂无相关数据.好热性硫磺细菌含有2类Rubisco:rbcL—l和rbcL.2(Karlin和Mrazek2000):超耐热原始菌先前报道称为PyrococcuskodakaraensisKODI(Kitano等2001).植物生理学通讯第43卷第2期,2007年4月365成的(L)的十聚体,与菠菜中的I型Rubisco有36%的同源性,与深红红螺菌中的Ⅱ型Rubisco有30%的同源性(Kitano等2001);分析詹氏甲烷球菌Rubisco的序列表明,它与蓝藻中的聚球藻I型Rubisco有41%的同源性,与深红红螺菌中的II型Rubisco有33%的同源性(Watson和Tabita1999).尽管以上三类Rubisco相互之间的同源性较低,但已知的Rubisco参与羧化或氧化核酮糖一1,5一二磷酸(ribulose一1,5一bisphosphate,RuBP)过程的所有保守氨基酸残基在I,II和III型中都存在,除了Ⅲ型中Phe.∞被其它氨基酸所取代(Ashida等2005).IV型又称为Rubisco类似蛋白(rubisco—like—protein,RLP),存在于非光合细菌,部分不依赖卡尔文循环的光合细菌和古生菌如绿色硫细菌,好热性硫磺细菌rbcL.,泥生绿菌,枯草芽孢杆菌等中(Klenk等1997;Watson和Tabita1999;Hanson和Tabita2001,2003Ashida等2003).它与I,II,III相比,许多活性位点保守氨基酸残基缺失,同源性甚低.如泥生绿菌,好热性硫磺细菌cL.,枯草芽孢杆菌中分别有11,5,9个活性位点的保守氨基酸残基被其它氨基酸所取代;枯草芽孢杆菌RLP与I,II,III型仅有23%,23%,30%的序列同源性(Ashida等2005).实际上,在许多细菌中同时存在编码I型和Ⅱ型Rubisco的结构基因,但在正常情况下两者并不同时表达(English等1992;Karlin和Mrazek 2000).那不勒斯硫杆菌在rbcL,突变的情况下, rbcL,,可表达生成II型Rubisco,但菌体必须在高浓度的CO,下才能生长良好(Baker等1998).海洋氢弧菌MH一110含有3个拷贝的Rubisco基因(CbbLS—和CbbLS-2属于I型,CbbM属于II型).Y oshizawa等(2004)研究证实海洋氢弧菌MH一110在不同浓度的CO,条件下,三者以不同的组合形式进行表达.脱氮硫杆菌在厌氧条件下以硝酸盐作为电子受体能同时表达生成I,II2种类型Rubisco.最近,Carr~一Mlouka等(2006)报道,在世界范围内广泛引起水华的铜绿微囊藻PCC7806 (MicrocystisaeruginosaPCC7806)细胞内同时存在I,IV型Rubisco.沼泽红假单胞菌(Rhodopseudo. monaspalustris)除了含有I,II型Rubisco,还同时存在2类不同的RLP(Larimer等2004).这些发现导致不同类型Rubisco的共存问题变得更加复杂,这对研究Rubisco的进化可能有意义.4Rubisco的性质与一般的酶相比,Rubisco具有2个显着的特征.一是非专一性,即Rubisco既能催化羧化反应,也能催化加氧反应,具有双功能性;二是低效性,即Rubisco的催化效率较一般酶低,是由于Rubisco酶转换数低(真核生物的Rubiscok约为3~5S～,来源于不同生长温度的植物Rubiscok略有不同),催化效率有限(Watson和Tabita1999;Sage2002~Ashida等2005).4.1热稳定性Rubisco有一定的热稳定性,但不同来源的Rubisco的热稳定性存在较大差异.水稻Rubisco在50℃保温7min达到最大活力,随后迅速下降,30min后酶活性下降至40%;烟草Rubisco在50℃保温20min达最大活力,30min后活力还维持在98%左右;菠菜Rubisco氨甲酰化后经60℃的10mmo1.LDTr处理1h活力还维持50%(陈为钧等1999).在嗜热古生菌如菌中,Rubisco的热稳定性极高.Tk.Rubisco在30—110℃范围内均能有效完成十聚体结构的组装(Maeda等2002);在40～100℃范围内能够保持有效的羧化酶活性,且活性随温度(40-90℃)的升高而上升;在80℃保温15h活力仍维持50%(Ezaki等1999).Maeda等(2002)采用定点突变(E63S,R66S,D69S)的方法,进一步研究证实Tk—RubiSCO耐热性依赖于特殊的五角形晶体结构(pentagonalstructure),此种结构的特点是二聚体相互接触紧密,接触面上的氨基酸残基之间存在离子间的相互作用,并形成8对离子键.同时,低聚状态对耐热性的维持也有影响.Tk.Rubisco的十聚体结构提高了蛋白质的变性温度,从而进一步提高了Tk菌适应高温的能力.4.2酶促反应动力学参数一般而言,C植物及景天科酸代谢植物Rubisco的Kin(CO)在12～26 ~tmol?L～,C4植物Rubisco的Kin(CO2)为28～63 ∞1.L-(Chen等2002).但不同类型植物Rubisco Kin(CO2)仍存在差异,如水稻RubiscoKin(CO2)一般为12lxmo1.L～,而喜温红藻(Galdieriapartita)的K(co2)仅为6.6~tmol?L一,这种喜温红藻366植物生理学通讯第43卷第2期,2007年4月RubiscoK~(CO)值在当时被认为是所有Rubisco中最小的(Uemura等1997).Ezaki等(1999)研究菌的结果表明,Tk—RubiSCO具有更强的羧化能力,在CO,饱和,90℃高温条件下,Tk.Rubisco同化CO,的速率可达19.8x10.nmo1.mg(酶蛋白)? min～.Rubisco羧化与氧化反应的活力比按/V o=()/(V oKc)([CO:】/【O2】)计算.其中,,分别表示羧化和氧化反应的最大反应速率;&,K. 分别代表羧化和氧化反应的米氏常数;【CO】和【O】为气体浓度;(c.)/(.c)称特性因子(specificityfactor),即羧化/氧化值(Q值)(Uemura等1997;Parry等2003).一定种类Rubisco的Q值为一常数,但不同来源的RubiscoQ值有较大差异(表1).绿色高等植物Rubisco的Q值一般在90～95之间;蓝藻的Q值也有35～40;细菌的Q值一般在9～45之间.从喜温红藻中发现的I型RubiscoQ值高达238(25℃),是高等植物Q值的2.5倍,说明其具有极强的固定CO:的能力(Uemura等1997).更为重要的是喜温红藻本身就属于植物,这对从亚基水平上改变Rubisco动力学性质及Q值,提高植物光合效率有重大意义. Tk—Rubisco存在更高的Q值且随温度的升高而上升,在50℃时为70,70℃时上升至250,90℃时则达到最大值310(Ezaki等1999).与此相反,喜温红藻的RubiscoQ值随着温度的升高反而降低(Uemura等1997).Watson和Tabita(1999)测定詹氏甲烷球菌Q值的结果表明,其羧化能力极差,Q值只有0.5,是所有Rubisco中Q值最低的.5Rubisco的功能已经证实,O是羧化酶反应的竞争性抑制剂;同样CO是加氧酶反应的竞争性抑制剂.因此,Rubisco处于光合碳还原(光合作用)和光合碳氧化(光呼吸)2个方向相反但又相互连锁的循环反应的交叉点上.当co#o:的浓度比值较高时,促进Rubisco催化的羧化反应.羧化反应一般分为烯醇化,羧化,水合,C—C键断裂,质子化5个阶段(Lundqvist和Schneider1991;Li等2005). Rubisco催化游离的CO,共价结合到底物RuBP上,进而生成两分子的3一磷酸甘油酸(3一phosphoglyc—ericacid,PGA),推动C3-PCR循环.当CO2/O2的浓度比值较低时,促进Rubisco催化的加氧反应,RuBP即裂解产生一分子的磷酸乙醇酸和一分子的PGA,前者进一步分解成乙醇酸和磷酸,参与绿色植物的光呼吸循环.研究初期,人们认为Rubisco的功能主要集中在光合碳同化及光呼吸过程中.然而随着各种不同类型RubiSCO的陆续发现和研究的深入, Rubisco的功能呈现出多样化(表1).詹氏甲烷球菌及其它产甲烷古生菌中的III型RubiSCO参与PRPP—RuBP—PGA途径(Ashida等称之为RuPP通路) (Finn和Tabita2004;Ashida等2005).在这一途径中RuBP的合成前体是1一焦磷酸.5一磷酸.核糖(5一phospho—D—ribose一1一pyrophosphate,PRPP),脱磷酸后经NAD氧化生成RuBP,接着在Rubisco的催化下与CO,结合生成PGA.RLP一般无羧化酶活性,但它能催化2,3一二酮基一5一甲硫戊基.1一磷酸(2,3一diketo一5一methythio—pentyl一1一phosphate,DK—MTP.1一P)的烯醇化反应,与硫代谢密切相关(Ashida等2003;Li等2005;Carr6一Mlouka等2006).枯草芽孢杆菌RLP在腺苷蛋氨酸补救合成途径中作为DK—MTP一1一P烯醇化酶发挥作用(Ashida等2003,2005).在其r/p突变株中导入深红红螺菌的II型Rubisco后,该菌株竟然可恢复生长,说明光合类型的Rubisco可能仍然保持着作为一腺苷蛋氨酸补救合成途径中DK—MTP.1一P烯醇化酶的功能.也有人认为是由于RubiSCO对底物存在一定范围的适应(Li等2005).绿色硫细菌RLP与硫代谢和氧化应激(oxidativestress)有关(Hanson和Tabita2001).铜绿微囊藻PCC7806RLP在硫代谢过程中也起一定作用.半定量RT—PCR的结果显示,在硫缺乏的情况下,吐Ⅳ的转录是正常状况(硫充足)下的22倍(Carte—Mlouka等2006).Rubisco作为植物叶中的主要含氮有机物之一,必然与植物对氮的吸收,利用及循环有关.研究不同种类C植物氮利用的情况表明,较高的Rubisco,是NADP苹果酸酶类型比NAD苹果酸酶类型具有更高的氮利用率的主要原因(Ghannoum等2005).Rubisco与植物雄性不育也有一定的联系.刘祚昌等(1983)研究玉米,高粱,水稻,小植物生理学通讯第43卷第2期,2007年4月367 麦和烟草等作物的细胞质雄性不育系Rubisco的结果表明,其活性均高于相应的保持系.水稻光周期敏感核不育农垦58S经长光照及红光间断暗周期处理表现为雄性不育,其Rubisco的活性明显低于可育状态(夏凯等1989).Schwender等(2004)最新发现甘蓝型油菜(Brassicanapus)中Rubisco参与植物中碳转化为油的代谢通道,此通道可导致碳作为油贮存的效率达到最大.6结语有人曾将红藻中高效率Rubisco酶的小亚基基因转入植物叶绿体中并得到表达,但表达出的小亚基却不能与植物本身的大亚基组装成全酶(Whitney和Andrews2001).这可能是由于小亚基存在特异性的修饰,或者协助组装的分子伴侣无法识别异源亚基.要解决上述问题尚待深入研究Rubisco的组装机制.众多的研究表明,低等藻类和古生菌体内存在不同类型Rubisco.Lonsdale等(1983)从玉米(Zeamays)线粒体中分离到一个与Rubisco大亚基同源的基因,此基因在大肠杆菌中表达合成的分子量为2lkDa的蛋白能与小麦的Rubisco抗体反应.如何科学地解释Rubisco的共存现象,共存现象与Rubisco的分子进化是否存在某种内在联系,植物体内是否也存在多拷贝的Rubisco基因,均待进一步研究.微生物Rubisco的研究大大扩展了人们对Rubisco类型及功能的认识.序列同源性比较分析的结果显示,III型和Ⅳ型Rubisco比I型及II型更原始;枯草芽孢杆菌及铜绿微囊藻PCC7806RLP功能及突变株的研究结果表明,m型与Ⅳ型Rubisco中可能存在Rubisco的原始形式,或者说它们与Rubisco的原始形式在结构及功能上有更多的相似性.根据研究枯草芽孢杆菌RLP的结果,Ashida等(2003,2005)提出一条Rubisco可能的进化路线,认为光合类型Rubisco正是由枯草芽孢杆菌RLP演变而来的.以上研究和发现并未完全解决Rubisco的分子进化问题,但却为人们指明了方向,即通过研究和分析微生物Rubisco的结构和功能有可能部分或完全揭示Rubisco的分子进化历程.参考文献陈为钧,赵贵文,顾月华(1999).RubisCO的研究进展.生物化学与生物物理进展,26(5):433-.-436刘祚昌,李继耕,罗会馨,陈福太(1983).二磷酸核酮糖羧化酶与细胞质雄性不育性的研究.遗传,10(1):362吕红,周集体,王竞,安利佳(2003).原核生物Rubisco的研究进展.微生物学通报,30(2):82—85夏凯,肖翊华,刘文芳(1989).湖北光敏感核不育水稻光敏感期叶片中ATP含量与RuBPcase活力的分析.杂交水稻,(4): 412.30熊晓然,陈蔚梅,冯胜彦,郭明雄,艾建宇,吴斌(2003).植物Rubisco 活性中心的模拟分析.中国生物化学与分子生物,19(4):493--498AshidaH,DanchinA,Y okotaA(2005).Wasphotosynthetic RuBisCOrecruitedbyacquisitiveevolutionfromRuBisCO—likeproteinsinvolvedinsulfurmetabolism?ResMicrobiol,l56:6lll8AshidaH,SaitoY,KojimaC,KobayashiK,OgasawaraN,Y okotaA(2003).AfunctionallinkbetweenRuBisCO—likeproton ofBacillusandphot0syntheticRuBisCo.Science,302:286~290BakerSH,JinS,AldrichHC,HowardGT,ShivelyJM(1998). 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rubisco大小亚基表达量
植物中的rubisco是一种由大亚基（大约55 kDa）和小亚基
（大约15 kDa）组成的复合物。

大亚基负责催化光合作用中
二氧化碳的固定，而小亚基则起调控和稳定复合物的作用。

rubisco的大小亚基在植物中的表达量可以受到多种因素的影响，包括植物的生长状态、环境因素（如光照、温度、二氧化碳浓度等）以及营养状况等。

一般来说，rubisco的表达量与植物对光合作用的需求有关。

在光合作用强烈进行时，rubisco的表达量通常会增加，以满
足植物对二氧化碳固定的需求。

然而，在光合作用受到限制的条件下，如光照不足或二氧化碳浓度低等情况下，rubisco的
表达量可能会减少。

此外，植物对不同环境因素的适应能力也会影响rubisco的表
达量。

例如，在高温环境下，一些植物可能会调节rubisco表
达量以减轻热伤害，并提高对高温的耐受性。

总的来说，rubisco大小亚基的表达量是一个复杂的调控过程，受到多种因素的影响。

研究表明，对rubisco的调控和优化在
提高植物光合作用效率和抗逆能力方面具有重要意义。