植酸酶的测定-关松荫

微生物植酸酶在体外条件下活性的测定东北农业大学动物营养研究所 石宝明　单安山 由于添加无机磷导致粪便中磷的排出量增多,污染水源和土壤,同时磷酸氢钙还易导致氟中毒和其他重金属中毒,因此在饲料中添加植酸酶代替直接添加无机磷日益受到重视。

植酸酶的应用效果,关键在于其在消化道中的活性。

自然界有许多不同的植酸酶来源,通过遗传工程技术,利用微生物(黑曲霉—Aspergillus niger)发酵工程技术生产饲用植酸酶,已成功地应用于猪和家禽中。

本试验是应用这种微生物植酸酶,以玉米、豆饼、麦麸为植酸磷载体,模拟畜禽胃肠消化道环境,在体外条件下测定微生物植酸酶的活性。

1　材料与方法111　试验材料　微生物植酸酶,由德国BASF公司提供。

112　试验设计11211　时间与微生物植酸酶的活性　准确称取玉米、豆饼、麦麸各4g,固定温度为40℃,加入pH为515的乙酸溶液10m L和011g植酸酶,振荡混匀,在催化时间分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11h后,加入4m ol/L盐酸3m L中止反应,然后置烘干箱中烘干,烘干后用TC A法测植酸磷含量,计算出植酸磷降解率。

11212　温度与微生物植酸酶的活性　准确称取玉米、豆饼、麦麸各4g,加入pH515的乙酸溶液10m L和011g植酸酶,振荡混匀,在催化温度分别为25、30、35、40、45、50、55、60、65、70℃下,反应4h后加入4m ol/L盐酸3m L中止反应,然后置烘干箱中烘干,烘干后用TC A法测植酸磷含量,计算出植酸磷降解率。

11213　pH与微生物植酸酶的活性　准确称取玉米、豆饼、麦麸各4g,固定温度40℃,加入011g 植酸酶,振荡混匀,然后分别加入pH为210、215、310、315、410、415、510、515、610、615、710的乙酸溶液10m L,反应4h后加入4m ol/L盐酸3m L中止反应,然后置干燥箱中烘干,烘干后用TC A法测植酸磷含量,计算出植酸磷降解率。

饲料原料为底物，植酸酶体外磷释放量的一种快速测定方法目前，植酸酶作为饲料添加剂在饲料工业中的应用已经非常广泛，不仅应用于猪和家禽饲料中，而且在水产饲料中的应用也较为广泛。

在饲料中添加植酸酶是一种提高动物利用饲料原料中植酸磷能力的有效途径。

不论是 3-植酸酶（肌醇六磷酸 3-磷酸水解酶）还是 6-植酸酶（肌醇六磷酸 6-磷酸水解酶），都可以有效地从底物中释放出磷。

通常情况下，植酸酶先按照设计比例添加于动物日粮，再调整磷酸氢钙添加量。

因此，正确评估植酸酶释放无机磷的能力具有十分重要的意义。

目前，国内有多种植酸酶活性测定方法，包括国标（GB/T 18634-2002）和不同企业标准，但均有一个共同特点：以植酸钠纯品（Sigma p-0109或 p-8810）为底物评估酶活。

下面着重介绍以饲料原料为底物，快速测定植酸酶体外释放磷的方法。

1材料与方法1.1 试剂及仪器参照 GB/T 18634-2002。

1.2 底物制备将常用饲料原料底物如豆粕、玉米、菜籽粕、棉粕和麸皮分别粉碎至大约 60 目，按照饲料配方中常用的比例配制两种不同比例（表 1）的配方，将其混和，充分搅拌均匀。

表1底物饲料配方原料底物 1 底物 2玉米 65% 62%豆粕 20% 20%棉粕 2% 6%菜籽粕 1% 3%麸皮 5% 4%植酸磷含量 0.28% 0.22%总重 930g 950g1.3 酶样品来源本试验采用的植酸酶产品来自两种不同厂家的植酸酶产品。

酶活保证值：样品 1 为5 000 U/g；样品 2 为 10 000 U/g。

1.4 标准曲线制备准确称取 0.680 4g 在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾于 100mL 容量瓶中，用乙酸缓冲液（0.25mol/L，pH5.5）溶解，并定容至 100mL，浓度为 50.0mmol/L。

按表 2 的比例稀释成不同浓度，按照表 3 进行操作。

标准空白为 4mL 乙酸缓冲溶液（0.25mol/L，pH 5.5）与 8mL 终止液混合液。

饲用植酸酶活性的测定分光光度法1范围本标准规定了以分光光度法测定饲用植酸酶活性的方法。

本标准适用于作饲料添加剂用的植酸酶产品，也适用于添加有植酸酶的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料。

样品最低检出量为90U／kg。

2 引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。

本标准出版时，所示版本均为有效。

所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准的最新版本的可能性。

GB／T 6682—1992 分析实验室用水规格和试验方法(neq ISO 3696：1987)3 植酸酶活性单位定义样品在植酸钠浓度为5.0 mmol／L、温度37℃、PH值5.00的条件下，每分钟从植酸钠中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。

4 方法原理植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理会生成黄色的[(NH4)3PO4NH4VO3·16MoO3]复合物，在波长415nm 下进行比色测定。

5 试剂和溶液本标准中所用试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GB／T 6682中规定的三级水。

清洗试验用容器不要用含磷清洗剂。

5.1 0.25mol／L 乙酸缓冲液(I)称取34.02g三水乙酸钠于1000mL容量瓶中，加入900mL水溶解，用冰醋酸调节pH至5.00±0.01，并用蒸馏水定容至1000mL，室温下存放2个月有效。

5.2 0.25mol／L乙酸缓冲液(Ⅱ)称取34.02g三水乙酸钠，0.5g TritonX-100,0.5g牛血清白蛋白（BSA）于1000mL容量瓶中，加入900mL水溶解，用冰醋酸调节pH至5.00±0.01，并用蒸馏水定容至1000mL，室温下存放2个月有效。

5.3 7.5mmol/L植酸钠溶液 c(C6H6O24P6Na12)为7.5mmol／L称取0.6929g肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)于100mL。

解读GB/T 18634-2002《饲用植酸酶活性的测定分光光度法》武汉新华扬生物有限公司詹连生摘要：国标GB/T18634-2002《饲用植酸酶活性的测定分光光度法》实施四年多来，为国内植酸酶工业的发展作出了重大贡献，但在实施过程中又受到了国内不少人士和企业的质疑，本文拟从实验室试验结果来探讨其科学性和严谨性，以期使更多的人士和企业能对国标有更进一步的全面认识。

关键词：国标植酸酶定义 pH值科学性严谨性国标“GB/T 18634-2002《饲用植酸酶活性的测定分光光度法》”（以下简称“国标”）是我国第一部关于植酸酶的国家推荐标准，实施四年多来，该标准为我国植酸酶工业的发展作出了重大贡献！但由于该标准的制订是基于早期的巴斯夫（BASF）植酸酶活性测定标准及产品特性基础上，而我国植酸酶工业在此阶段却在迅速的发展，通过植酸酶菌种的优选和基因化工程，使植酸酶产品的特性朝着越来越利于动物营养方向优化，致使现行国标在科学性、严谨性和适用性上出现了明显的缺憾，无法体现植酸酶的特性优势，从而在某种程度上又阻碍了我国植酸酶工业的发展！故找来最新版本的《BASF植酸酶活性测定（KC9505第三修订版）》，结合“武汉新华扬生物有限公司Q/XHY0020-2005《饲用植酸酶》”，对现行国标进行认真地解读，并以实验室真实数据来一一验证。

一、首先，对植酸酶活性单位定义科学性的理解，定义中有三个条件：植酸钠的浓度、反应温度和pH 值。

1、植酸钠的浓度植酸酶活性测定的原理是，植酸酶在一定温度和pH条件下，在一定浓度的植酸钠盐溶液中能够从肌醇六磷酸中释放出无机磷；加入钒钼酸铵反应液可以终止反应，并与释放出来的无机磷反应生成黄色的钒钼酸磷复合物。

用分光光度计在415nm波长处检测复合物的浓度，即可计算出样品中的相应酶活。

在试验中，我们注意到，只要所加入的植酸钠的量能足够保证反应所需即对实验结果毫无影响。

也就是说：植酸钠在一定浓度范围内波动，对植酸酶活性的检测没有影响！2、反应温度一般来说，酶在动物体内的活动环境温度均在37℃左右，因此，结合动物体内最适宜酶激活温度，将植酸酶酶活的表现温度定为37℃是合适的。

国标绝对法测定植酸酶产品活性的关键控制点畜禽饲料中添加使用微生物发酵生产的植酸酶可提高植物性饲料中植酸及其盐的利用率, 减少日粮中磷酸氢钙等磷源的添加量, 降低饲料成本, 目前已经被广泛使用。

为了确保实际生产中植酸酶使用效果, 如何准确测定植酸酶产品的酶活性是养殖场、饲料企业和酶制剂生产、经销商所共同关注的问题。

目前, 国内植酸酶产品酶活性测定大多采用国家标准 GB/T 18643—2002《饲料用植酸酶活性的测定分光光度法》。

该方法标准中, 包括两种方法: 绝对法和相对法。

该测定方法的分析步骤不是很复杂, 所涉及的仪器设备饲料企业的实验室也都有配备, 但要获得准确和重复性好的分析结果也不容易, 需要加强对检测原理和步骤的理解。

该方法是基于样品在植酸钠浓度为 5.0 mmol/l、温度37 ℃、pH 值 5.50 条件下, 每分种从植酸钠中释放 1 μmol 无机磷,即为 1 个植酸酶活性(以 U 表示)的定义基础上测定的。

鉴于绝对法应用比较普遍, 现将我们在开展植酸酶产品活性测定过程中一些经验体会总结如下, 供同行们参考。

1 溶液配制植酸酶活性测定直接所用到的溶液主要有 3 种,即乙酸缓冲溶液、植酸钠底物溶液和显色终止液。

1.1 乙酸缓冲溶液国标方法中, 绝对法测定植酸酶产品酶活性所使用的乙酸缓冲溶液浓度为:c(CH3COONa·H2O)=0.25 mol/l。

缓冲溶液是确保整个酶反应体系的 pH 值在规定范围内的关键因素, 必须准确配制。

1.1.1 配制方法称取 34.02 g 三水乙酸钠,0.1 g 吐温 20 于 1 000 ml容量瓶中, 加入 900 ml 水溶解, 用乙酸调节 pH 值至!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!《饲料工业》·2008 年第 29 卷第 14 期检测技术475.50±0.01, 室温下贮存 2 个月有效。

植酸酶活性测定植酸(Phyticacid).其化学名称为六磷酸肌醇，由1分子肌醇和6分于鳞酸结合而成，分子式是C6H18O24P6,通式为C6H6[OPO(OH)2]6,分子660.8。

植酸及植酸盐中的磷即为植酸磷，植酸广泛存在于谷物籽实和油料作物种子。

植酸酶(phytases)能将磷酸残基从植酸上水解下来，因此破坏了植酸对矿物元素强烈的亲和力，所以说植酸酶能增加矿物元素的营养效价，而且由于释放出的Ca2÷可参加交联或其他反应中去，从而改变了植物性食品的质地。

植酸酶一般只适于在单胃动物中使用。

反刍动物由于瘤胃微生物能合成植酸酶，因此在饲料中一般不需要使用植酸酶。

植物体中的植酸一般不以游离形式存在，而是与钙、镁、钠、钾等结合形成复合盐，植酸盐在多数植物中以植酸钙镁复盐的形式存在，但大麦中主要是植酸钾镁复盐，小麦中主要是植酸铁。

饲料中的无机磷可直接为肠道所吸收，而有机磷则需要先经酶的作用水解为无机磷，然后方能为肠道吸收。

单胃动物消化道中无分解植酸的植酸酶，故对植酸磷的利用率很低。

植酸的抗营养作用不仅表现在植酸磷的低利用率上，还通过整合或络合作用影响其它矿物元素如铁、锌、铜、钙以及蛋白质的可消化性，并抑制淀粉酶、胰蛋白酶、胄蛋白酶的活性。

测定原理植酸酶可以水解植酸钠释放出无机磷，通过加入锐铝酸核显色/终止液使水解反应停止，同时与水解释放出的无机磷产生颜色反应，形成黄色的帆铝磷络合物(NHQPO4NH4VO3-16M O O3;,在415nm波长下测定磷的含量，以标准磷溶液为参照，计算酶活。

植酸酶的含量以酶活性单位表示。

1植酸酶单位定义为:在37℃、pH5.5的条件下，1分钟内从0.005ImOI1的植酸钠溶液中释放出1微摩尔(UmoD无机磷所需要的植酸酶量。

操作步骤样品准备样品粉碎过后过60目筛。

称取2.0g左右粉碎样品，放入4个IOom1烧杯中(每种样品4个重复)。

加入50m1浓度为0.25m1、PH为5.50、在冰箱中冷却的乙酸缓冲液并用磁力搅拌器搅动60分钟，使酶蛋白充分溶出，制成一个悬浮液。