实验一 感受态制备及转化

感受态的制备与转化，质粒提取（原理和操作步骤）感受态细胞: 理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。

即指细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA并使其基因型和表现型发生相应变化的能力。

如大肠杆菌经CaCl2处理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。

一般来说,感受态细胞的最基本要求是：1、没有质粒2、容易被转进去（一般是G-细菌，细胞壁薄）3、营养条件一般，非苛养菌CaCl2法：操作原理：1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。

2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。

进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。

意义：将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

转化是指质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。

实验材料：E. col i DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA；eppendorf管。

试剂:1.LB固体和液体培养基2.Amp母液(储存浓度50mg/ml)3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。

4.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。

感受态细胞的制备与转化实验报告
一、实验目的
本实验旨在探究感受态细胞的制备和转化过程，以及相关技术操作和注意事项。

二、实验步骤
1. 制备感受态细胞
（1）取出培养皿内的细胞，用PBS洗涤3次；
（2）将洗涤后的细胞加入含有5μM Calcein-AM的PBS中，放置于37℃孵育箱内30分钟；
（3）取出孵育后的细胞，用PBS洗涤3次，即可得到感受态细胞。

2. 转化感受态细胞
（1）将制备好的感受态细胞加入含有荧光素酶底物的培养基中；
（2）放置于37℃孵育箱内15分钟左右；
（3）观察荧光素酶底物是否被转化为荧光素，并记录转化效率。

三、实验结果与分析
经过制备和转化处理后，观察到感受态细胞成功地被转化为荧光素，
并且转化效率较高。

这表明该方法可以有效地制备和转化感受态细胞，并且具有较高的可靠性和重复性。

四、实验注意事项
1. 实验过程中应注意无菌操作，避免细菌和其他杂质的污染；
2. 在制备感受态细胞时，应注意洗涤次数和荧光素酶底物的浓度，以
确保制备的感受态细胞质量和转化效率；
3. 在转化感受态细胞时，应注意荧光素酶底物的加入量和反应时间，
以确保转化效率和荧光素的稳定性。

五、实验结论
本实验通过制备和转化处理，成功地得到了荧光素转化后的感受态细
胞，并且转化效率较高。

这为进一步研究感受态细胞在生物学领域中的应用提供了可靠的技术支持。

大肠杆菌感受态细胞制备与质粒DNA的转化（实验步骤）分组：每组同学分成2个小组，每个小组2-3位同学。

1. 感受态细胞的制备(1) 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期（老师做）。

(2) 将该菌悬液以1:50的比例重新接种于5ml LB液体培养基中（2组），37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。

(3) 将5ml培养液转入3只1.5mL离心管中，冰上放置10分钟，然后于4℃下5000r/min离心5分钟（每组3只）。

(4) 弃去上清，在每个离心管中用预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液1ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15分钟后，4℃下5000r/min离心5分钟。

(5) 弃去上清加入0 2ml预冷的0.1mol/LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，即制成感受态细胞。

将感受态细胞悬液分装成2份，每份100μl（注意悬液密度要均匀）。

冰上放置备用（每组有6份感受态细胞）。

2. 铺平板将配好灭菌的LB固体培养基加热溶化，待冷却至60℃左右，加入卡那霉素储存液，使终浓度为50ug/ml，摇匀后铺板，每皿倒约15 mL，室温放置过夜至冷凝水挥发干净。

3. 感受态细胞的转化(1) 将100μl感受态细胞悬浮液，置冰上5分钟，然后加入5ul pBS质粒DNA溶液，轻轻摇匀，冰上放置30分钟（每组做2份）。

(2) 42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。

(3) 向管中加入400ul LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。

(4) 将上述500ul菌液中取出200ul涂布于1块含卡那霉素的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。

（每组2块平板）(5) 同时做两个对照：对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。

Ⅰ、CaCl2法制备感受态细胞（大肠杆菌）①挑取37℃培养16-20h的单菌落（直径2-3mm）于含有100mlLB或SOB的500或1000ml 的三角瓶中，剧烈振荡培养3h至OD值为0.2-0.4（据文献大肠杆菌DH5α菌株培养物OD 值为0.2-0.4时，约含109个菌/ml；②转移菌体至无菌、一次性冰冷的50ml聚丙烯离心管内。

将离心管内培养物放置于冰上10min，以使其冷却至0℃；③将离心管内培养物4℃，4000rmp，10min以收集菌体；④弃去上清培养基，并颠转离心管放于一叠吸水纸上1min，吸取多余培养基；⑤用30ml冰冷MgCl2-CaCl2溶液（80mM MgCl2和20mM CaCl2）漩涡振荡重悬菌体沉淀，置于冰上10min；⑥将离心管内培养物4℃，4000rmp，10min以收集菌体；/⑦弃去上清培养基，并颠转离心管放于一叠吸水纸上1min，吸取多余培养基；⑧用2ml冰冷0.1MCaCl2溶液（2ml冰冷0.1MCaCl2/50ml原初培养物）漩涡振荡重悬菌体沉淀；⑨放于4℃冰箱14-20h。

获得的感受态细胞即可直接用于转化或添加甘油至终浓度10%（7:3,7是菌液，3是甘油），分装离心管内（150-200μl），存于-70℃。

感受态细胞的冻存制备①每4ml重悬细胞中添加140μlDMSO，轻摇混匀，冰上放置重悬物15min；②另外每管重悬物中再添加140μlDMSO，轻摇混匀，重新放于冰浴中；③迅速将重悬物分装于冷的、无菌小管内，将小管浸入液氮中瞬时冰冻感受态细胞，将小管存于-70℃冰箱。

Ⅱ、大肠杆菌转化①CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞Luria-Bertani（LB）培养基（1L）：胰蛋白胨（10g），酵母提取物（5g），NaCl（10g）pH7.5/NaOH，dH2O至1L，灭菌LB平板：LB培养基（500ml），Agar（7g），灭菌。

冷却55-65℃倒平板。

实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验目的通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。

实验原理将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。

转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。

为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。

DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。

密度过高或不足均会影响转化效率。

2. 质粒的质量和浓度: 1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。

一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。

3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。

4. 防止杂菌和杂DNA的污染。

本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pUC19质粒共保温,实现转化。

由于pUC19质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。

如受体细胞没有转入pUC19，则在含Amp的培养基上不能生长。

能在Amp 培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pUC19。

转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。

一.仪器控温摇床(37℃) 高速冷冻离心机水浴锅冰箱（-20℃,‐70℃）超净工作台培养箱(37℃)752分光光度计灭菌锅二.试剂CaCl2 无菌水,冰胰蛋白胨酵母粉Amp NaCl三.其他用品移液器，枪头1.5ml ,50ml 离心管三角瓶500ml 200ml6cm平皿试剂瓶60ml量筒烧杯琼脂甘油酒精灯三角玻棒酒精棉球火柴［溶液配制］0.1 mol/L CaCl2溶液配置灭菌LB液体培养基氨苄青霉素（Amp），用无菌水配制成50_60 mg/mL溶液，抽虑灭菌置－20℃冰箱中保存。

感受态细胞的制备一、实验原理受体细胞通过一些特殊方法（如电击法，CaCl2，MnCl2，MgCl2等化学试剂法)的处理后，使细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的状态，成为感受态细胞。

本方案介绍的方法为TSS法和KCM转化法。

二、材料及准备工作一）材料准备二)试剂配制1、液体LB培养基（200ml，高压灭菌，4℃保存备用）蛋白胨 2.0g酵母提取物 1.0g氯化钠（NaCl） 2.0g2、固体LB培养基（2×100ml，高压灭菌）蛋白胨2×1.0g酵母提取物2×0.5g氯化钠（NaCl）2×1.0g琼脂粉2×1.5g温度降低到45℃后（不烫手），取其中一瓶加入氨苄至终浓度100μg/ml（100mlLB加100μl 100mg/ml的氨苄）后铺平皿，另一瓶直接铺平皿。

4℃保存备用。

3、TSS液（100ml）（有效期2周）聚乙二醇（PEG8000）10g 终浓度10%DMSO 5ml 终浓度5%MgCl2(1mol/L）5ml 终浓度50mmol/LLB 85ml 终浓度85%去离子水补足100ml，0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用注：聚乙二醇分子量可以为3000-80004、5×KCM液（10ml）（可-20℃长期保存备用）KCl（2mol/L） 2.5mlCaCl2(1mol/L) 1.5mlMgCl2(1mol/L) 2.5ml水补足到10ml, 0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用（不要高压消毒）5、氨苄青霉素（amp）（100mg/ml）取0.5g氨苄青霉素，溶解于5ml去离子水中，0.5ml分装，-20℃保存备用三）仪器设备1、低温大容量离心机2、恒温水浴锅3、超净台4、高压锅5、37℃孵育箱6、恒温摇床7、制冰机8、分光光度计9、微量移液枪10、低温冰箱三、步骤及注意事项一）感受态制备（TSS法）1、取菌种，划LB平皿板（无氨苄）；2、挑取分离良好的独立克隆，接种到5ml LB 中，220rpm ，37℃恒温摇床孵育过夜；3、取1 ml摇好的菌液，接种到100 ml LB 中（500ml锥形烧瓶），220rpm ，37℃孵育2.5-3.0h，菌液OD600达到0.2-0.5（0.36效果较好，不要超过0.6）；4、取出菌液，冰浴20min；然后4℃，3000 rpm离心5 min ，收集细菌；5、用10 ml 冰浴预冷的TSS液重悬细菌，然后4℃，3000 rpm离心5 min；再用冰浴预冷的TSS液重悬细菌，即成感受态；6、用1.5 ml离心管按150μl分装；-80℃长时间保存。

感受态细胞制备与转化的实验报告感受态细胞制备与转化的实验报告一、引言随着生物科学研究的不断深入，对细胞功能和特性的研究变得越来越重要。

而传统上，研究者通常将细胞分类为基因编码的外显性细胞和感受态细胞。

感受态细胞是具有特定功能和响应能力的细胞，这使得它们在医学和生物学领域的应用潜力广阔。

本实验旨在探索感受态细胞的制备和转化方法，并评估其在功能研究中的应用潜力。

二、方法1. 感受态细胞制备a) 实验人员通过文献调研和现有技术，确定适合本次实验的感受态细胞类型和制备方法。

b) 选取合适的细胞系，如神经元细胞系或免疫细胞系，根据文献中的描述，采用合适的制备方法。

c) 在细胞培养基中加入适当的因子或化合物，以诱导细胞进入感受态。

d) 筛选并分离感受态细胞，使用细胞培养技术将其扩增至足够数量。

2. 感受态细胞转化a) 收集适当的转化因子或刺激物，根据研究目的确定转化条件。

b) 使用合适的技术和试剂将感受态细胞转化为所需的细胞类型。

c) 对转化后的细胞进行验证和鉴定，确保其已成功转化。

三、结果与讨论1. 感受态细胞制备经过感受态细胞制备的过程，实验人员成功获得了目标细胞系的感受态细胞。

通过适当的因子或化合物的处理，细胞成功转变为特定的感受态细胞，显示出对特定刺激的响应能力。

这为后续的实验和应用提供了良好的基础。

2. 感受态细胞转化通过合适的转化因子或刺激物处理，实验人员将感受态细胞转化为所需的细胞类型。

转化后的细胞具备了目标细胞的特征和功能，通过验证和鉴定，确保转化的成功率和质量。

这为进一步研究不同细胞类型的功能和应用提供了可能。

感受态细胞的制备和转化是一项重要的技术，在生物医学研究和应用中具有广泛的潜力。

通过实验人员的努力，成功制备和转化了感受态细胞，为相关领域的研究提供了强有力的支持。

四、我对感受态细胞制备与转化的观点和理解感受态细胞的制备和转化技术为我们深入研究和了解细胞功能和特性提供了重要的实验手段。