感受态制作注意事项

感受态的制备
1.铺无抗性的LB平板。

为避免意外，一般铺两块无抗性LB平板。

2.用1ml的枪戳几下菌库中的菌种,使得枪头上带有少量冰渣。

这个过程要迅速，避免菌种发生冻融或污染。

3.将冰渣溶于1ml 37℃预热的LB中,充分混匀后,用枪吸取20ul转移至另一只装有1ml 37℃预热的LB的 EP中,混匀后取100ul涂板。

37℃孵育14个小时。

观察菌落数量和相关理化特征，用封口膜密封4℃冻存。

4.用牙签挑取单克隆至4～6ml无抗性LB小管中260rpm 12小时(活化)。

这一步可以多挑几个克隆，以防其长不出来和有明显的污染。

5.取500ul菌液到100ml无抗生素的LB锥形瓶中300rpm 3小时。

注意观察，控制菌的浓度在OD600时不要超过0.6。

6.把100ml菌液分装在两只50ml离心管（已灭过菌）中，冰浴10分钟。

7.5000rpm、4℃离心10分钟，弃上清。

离心机需要4℃预冷。

8.用0.1mol/l的氯化钙10ml重悬浮。

徒手将50ml离心管反覆戳于冰上从而使细菌重悬浮。

因为感受态细胞比较脆弱易破损，故重悬浮时不宜使用震荡仪。

悬浮要充分！
9. 5000rpm、4℃离心10分钟，弃上清。

10.用0.1mol/L的氯化钙加15%的甘油2ml重悬浮。

注意事项同8。

11.以200ul每管分装，分装后冻存于-80℃。

注明制备日期和菌名。

宬槮感受态制备感受态制备实验操作1．电击感受态制备（1）实验准备①玻璃制品泡酸：合适且体积相对较大的锥形瓶、装吸水纸的培养皿、装去离子水和15%甘油的锥形瓶。

②塑料制品：200ul黄色枪尖剪去枪尖，1000ml蓝色枪尖，50mL离心管。

③溶液：LB培养基（活化和扩培），去离子水，15%甘油的水。

④以上物品都需要灭菌处理（121℃20-30min），离心管、枪头、ep管都需要烘干后低温放置。

（制备感受态的试剂都需要提前预冷）（2）实验操作①将存放在-80℃的菌种取出，在超净台内用枪尖沾取一下，分别加入相对应1mL LB液体培养基中，在37℃恒温摇床中220rpm过夜培养（根据菌种特性设定）；②次日以1:100的比例将上一步培养的菌液添加入LB液体扩培培养基中，37℃220rpm摇晃培养至OD600为0.4左右；③将培养得到的菌液至于冰上静置20-30min,然后在超净台内分装到事先灭菌预冷的50mL的离心管中，4℃，4000rpm，离心10min；④在超净台内去除上清，用吸水纸吸去多余的上清，加入事先预冷的ddH2O 10mL 左右，在冰上摩擦使菌体悬起，再加入适量的ddH2O混匀（根据实际情况）4℃，4000rpm，离心10min；（此步骤目的是洗去多余的杂质，此过程一定要轻柔，且保证离心管盖严，以免染菌。

）⑤从离心机里缓慢取出，防止震动使菌体悬起（菌体松散沉积）。

在超净台内去除上清，用吸水纸吸去多余的上清，加入事先预冷的15%甘油10mL，在冰上摩擦使菌体悬起，再加入适量的15%甘油混匀（根据实际情况）4℃，4000rpm，离心10min；1/ 3宬槮感受态制备⑥重复步骤（5）⑦从离心机里缓慢取出，在超净台内倒出上清，尽量避免倒出沉淀。

最后用1ml 左右15%甘油悬起，100uL每支分装到事先插冰上预冷的1.5mL EP管中。

（此过程一定要保证无菌和低温）⑧需要转化的感受态可以防冰上待用；多余的转移到液氮中快速冷冻，放入-80℃保存。

大肠杆菌体验态细胞的造备战变化本理及注意事项之阳早格格创做1、体验态细胞的观念沉组DNA分子体中建立完毕后必须导进特定的宿主（受体细胞）使之无性繁殖并下效表白中源基果大概曲交改变其遗传性状，那个导进历程及支配统称为沉组DNA分子的变化.正在本核死物中，变化是一个较一致的局里，正在细胞间变化是可爆收，一圆里与决于供体菌与受体菌二者正在进化历程中的亲缘关系，另一圆里还与受体菌是可处于一种体验状态有着很大的关系. 所谓的体验态：即指受体大概者宿主最易交受中源DNA片段并真止其变化的一种死理状态，是由受体菌的遗传性状所决断的共时也受菌龄、中界环境果子的效用.cAMP不妨使体验态火仄普及一万倍，而Ca2+也可大大促进变化的效用.细胞的体验态普遍出当前对付数死少久新陈幼老的细胞是造备体验态细胞战举止乐成变化的关键.造备出的体验态细胞姑且没有必时可加进占总体积15%的无菌苦油大概-70℃保存灵验期6个月.2、变化的观念及本理正在基果克隆技能中，变化特指将量粒DNA大概以其为载体建立的沉组DNA导进细菌体内使之赢得新的遗传个性的一种要收.它是微死物遗传、分子遗传、基果工程等钻研范畴的基础真验技能之一.受体细胞通过一些特殊要收，如电打法、CaCl2等化教试剂法处理后，使细胞膜的通透性爆收变更，成为能容许中源DNA分子通过的体验态细胞.加进细胞的DNA分子通过复造、表白真止遗传疑息的变化，使受体细胞出现新的遗传性状.大肠杆菌的变化时常使用化教法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年创造的.其本理是细菌处于0℃CaCl2的矮渗溶液中，菌细胞伸展成球形，变化混同物中的DNA产死抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲打处理，督促细胞吸支DNA 复合物，正在歉富培植基上死少数小时后，球状细胞复本并团结删值，被变化的细菌中沉组子中基果得到表白，正在采用性培植基仄板上可选出所需的变化子.Ca2+处理的体验态细胞其变化率普遍能达到5×106~2×107变化子/ug量粒DNA 不妨谦脚普遍的基果克隆考查.如正在Ca2+的前提上共同其余的二价金属离子如Mn2+、Co2+、DMSO大概还本剂等物量处理细菌，则可使变化率普及100~1000倍.化教法简朴、赶快、宁静、沉复性好，菌株适用范畴广，体验态细菌不妨正在-70℃保存，果此被广大用于中源基果的变化.除化教法变化细菌中，另有电打变化法，电打法没有需要预先诱导细菌的体验态，依赖短促的电打，督促DNA加进细菌，变化率最下能达到109~1010变化子/ug关环DNA.果支配烦琐愈去愈为人们所交受.3、体验态细胞造备及变化中的效用果素⑴、细胞的死少状态战稀度最佳从-70℃大概-20℃苦油保存的菌种中曲交转交用于造备体验态细胞的菌液.没有要用已通过多次转交及贮存留4℃的培植菌液.细胞死少稀度以每毫降培植液中的细胞数正在5×107个安排为好.即应用对付数期大概对付数死少前期的细菌,可通过测定培植液的OD600统造.对付TG1菌株OD600为0.5时,细胞稀度正在5×107个/ml安排.应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的分歧而分歧.稀度过下大概缺累均会使变化率下落.别的受体细胞普遍应是节造-建饰系统缺陷的突变株，即没有含节造性内切酶战甲基化酶的突变株.而且受体细胞还应与所变化的载体本量相匹配.⑵、量粒DNA的品量战浓度用于变化的量粒DNA应主假如超螺旋态的变化率与中源DNA的浓度正在一定范畴内成正比但是当加进的中源DNA 的量过多大概体积过大时则会使变化率下落.普遍天，DNA 溶液的体积没有该超出体验态细胞体积的5%1ng的cccDNA 即可使50ul的体验态细胞达到鼓战.对付于以量粒为载体的沉组分子而止，分子量大的变化效用矮，真验说明大于30kb 的沉组量粒将很易举止变化.别的沉组DNA分子的构型与变化效用也稀切相关，环状沉组量粒的变化率较分子量相共的线性沉组量粒下10~100倍，果此沉组DNA多数形成环状单螺旋分子.⑶、试剂的品量所用的CaCl2等试剂均需是最下杂度的，并用最杂洁的火配造，最佳分拆保存于4℃.⑷、预防杂菌战杂DNA的传染所有支配历程均应正在无菌条件下举止，所用器皿，如离心管、移液枪头等最佳是新的，并经下压灭菌处理.所有的试剂皆要灭菌，且注意预防被其余试剂、DNA酶大概杂DNA所传染可则均会效用变化效用大概杂DNA的转进.⑸、所有支配均需正在冰上举止没有克没有及离启冰浴可则细胞变化率将会落矮.。

年夜肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项之答禄夫天创作时间：二O二一年七月二十九日1、感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后必需导入特定的宿主（受体细胞）使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及把持统称为重组DNA分子的转化.在原核生物中,转化是一个较普遍的现象,在细胞间转化是否发生,一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系,另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很年夜的关系. 所谓的感受态：即指受体或者宿主最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态,是由受体菌的遗传性状所决定的同时也受菌龄、外界环境因子的影响.cAMP可以使感受态水平提高一万倍,而Ca2+也可年夜年夜增进转化的作用.细胞的感受态一般呈现在对数生长期新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行胜利转化的关键.制备出的感受态细胞暂时不用时可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保管有效期6个月.2、转化的概念及原理在基因克隆技术中,转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性的一种方法.它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一.受体细胞经过一些特殊方法,如电击法、CaCl2等化学试剂法处置后,使细胞膜的通透性发生变动,成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞.进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞呈现新的遗传性状.年夜肠杆菌的转化经常使用化学法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年发现的.其原理是细菌处于0℃CaCl2的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA 形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞概况,经42℃短时间热冲击处置,促使细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增值,被转化的细菌中重组子中基因获得表达,在选择性培养基平板上可选出所需的转化子.Ca2+处置的感受态细胞其转化率一般能到达5×106~2×107转化子/ug质粒DNA可以满足一般的基因克隆试验.如在Ca2+的基础上联合其它的二价金属离子如Mn2+、Co2+、DMSO或还原剂等物质处置细菌,则可使转化率提高100~1000倍.化学法简单、快速、稳定、重复性好,菌株适用范围广,感受态细菌可以在-70℃保管,因此被广泛用于外源基因的转化.除化学法转化细菌外,还有电击转化法,电击法不需要预先诱导细菌的感受态,依靠长久的电击,促使DNA进入细菌,转化率最高能到达109~1010转化子/ug闭环DNA.因把持简便愈来愈为人们所接受.3、感受态细胞制备及转化中的影响因素⑴、细胞的生长状态和密度最好从-70℃或-20℃甘油保管的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液.不要用已经过屡次转接及贮存在4℃的培养菌液.细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳.即应用对数期或对数生长前期的细菌,可通过测定培养液的OD600控制.对TG1菌株OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右.应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的分歧而分歧.密渡过高或缺乏均会使转化率下降.另外受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株.而且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配.⑵、质粒DNA的质量和浓度用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比但当加入的外源DNA的量过多或体积过年夜时则会使转化率下降.一般地,DNA溶液的体积不应超越感受态细胞体积的5%1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞到达饱和.对以质粒为载体的重组分子而言,分子量年夜的转化效率低,实验证明年夜于30kb的重组质粒将很难进行转化.另外重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关,环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍,因此重组DNA年夜都构成环状双螺旋分子.⑶、试剂的质量所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的,并用最纯洁的水配制,最好分装保管于4℃.⑷、防止杂菌和杂DNA的污染整个把持过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管、移液枪头等最好是新的,并经高压灭菌处置.所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染否则均会影响转化效率或杂DNA的转入.⑸、整个把持均需在冰上进行不能离开冰浴否则细胞转化率将会降低.时间：二O二一年七月二十九日。

大肠杆菌感受态的制备注意事项一、前言大肠杆菌是一种常见的细菌，广泛存在于自然界中。

其感受态的制备是研究大肠杆菌生长和代谢机制的重要手段之一。

本文将从实验室条件、培养基、细胞处理等方面详细介绍大肠杆菌感受态的制备注意事项。

二、实验室条件1. 实验室应保持干净整洁，避免灰尘和异味影响实验结果。

2. 实验室应保持适宜的温度和湿度，避免过高或过低的环境温度对实验产生影响。

3. 实验室应定期消毒，确保操作台面、仪器设备等无菌。

三、培养基1. 选择合适的培养基是制备大肠杆菌感受态的关键。

常用的培养基有Luria-Bertani（LB）培养基、M9盐基培养基等。

根据实验需要选择适当的培养基。

2. 培养基应在使用前进行严格无菌处理，避免污染影响实验结果。

3. 培养基pH值应控制在合适的范围内，一般为7.0-7.5。

4. 培养基中添加的各种营养物质应按照实验要求精确称量，避免误差对实验结果产生影响。

四、细胞处理1. 大肠杆菌应在对数生长期进行处理，通常为OD600=0.6-0.8。

2. 细胞应在无菌条件下进行采集和洗涤，避免污染影响实验结果。

3. 细胞应在适当的温度下进行处理，一般为37℃。

4. 细胞处理过程中应注意避光，避免光照对实验结果产生影响。

五、感受态制备1. 感受态制备前应将培养基和细胞等物品预先冷藏或冰冻，以保证制备过程中温度控制的准确性。

2. 制备感受态前应先将培养基预热至37℃，并加入相应浓度的感受态诱导剂（如IPTG）。

3. 加入诱导剂后，将细胞转移到含有诱导剂的培养基中，并在适当温度下孵育一定时间（通常为2-4小时）。

4. 制备过程中应注意避光，避免光照对实验结果产生影响。

5. 制备完成后应及时取样，避免长时间放置影响实验结果。

六、结论以上是大肠杆菌感受态制备的注意事项。

在实验过程中，我们应该严格按照要求进行操作，保证实验结果的准确性和可靠性。

同时，在实验室管理方面也要加强管理，保证实验室环境的卫生和安全。

感受态细胞的制备与转化实验报告
一、实验目的
本实验旨在探究感受态细胞的制备和转化过程，以及相关技术操作和注意事项。

二、实验步骤
1. 制备感受态细胞
（1）取出培养皿内的细胞，用PBS洗涤3次；
（2）将洗涤后的细胞加入含有5μM Calcein-AM的PBS中，放置于37℃孵育箱内30分钟；
（3）取出孵育后的细胞，用PBS洗涤3次，即可得到感受态细胞。

2. 转化感受态细胞
（1）将制备好的感受态细胞加入含有荧光素酶底物的培养基中；
（2）放置于37℃孵育箱内15分钟左右；
（3）观察荧光素酶底物是否被转化为荧光素，并记录转化效率。

三、实验结果与分析
经过制备和转化处理后，观察到感受态细胞成功地被转化为荧光素，
并且转化效率较高。

这表明该方法可以有效地制备和转化感受态细胞，并且具有较高的可靠性和重复性。

四、实验注意事项
1. 实验过程中应注意无菌操作，避免细菌和其他杂质的污染；
2. 在制备感受态细胞时，应注意洗涤次数和荧光素酶底物的浓度，以
确保制备的感受态细胞质量和转化效率；
3. 在转化感受态细胞时，应注意荧光素酶底物的加入量和反应时间，
以确保转化效率和荧光素的稳定性。

五、实验结论
本实验通过制备和转化处理，成功地得到了荧光素转化后的感受态细
胞，并且转化效率较高。

这为进一步研究感受态细胞在生物学领域中的应用提供了可靠的技术支持。

1>细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的OD600 来控制。

DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107个/mL左右，这时比较合适。

密度过高或不足均会影响转化效率。

2>所有操作均应在无菌条件和冰上进行；实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。

3>经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）4>化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或 Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）5>所使用的器皿必须干净。

少量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率; 首要问题就是操作是防止污染，因为这个是最容易影响感受态制作的因素。

其次，就是悬浮沉淀的过程，一定要轻轻悬浮，最好轻摇悬浮，如果用移液器，把枪头前面剪掉一部分，然后再吹，这样吹的比较柔和感受态制备及转化的方法很多，效率最高的是电转化，可达到10次方，普通的化学转化只能达到8次方，一般自己做也就是6-7次方，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管即开始转化，但效率也最低，只能满足环形质粒的转化（某些公司也有现成试剂盒）要想又简单，又能有较高的转化效率，最好的莫过于1990年《Gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受态的制备与转化方法。

以下是一些制备感受态的注意事项：1、所用器具的洁净程度。

这一点非常重要，是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的，毋庸置疑。

2、培养基的装量。

培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。

dh5a感受态细胞的制备DH5α感受态细胞的制备引言：大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，也是生物学实验中最常用的模式生物之一。

在分子生物学和基因工程领域，大肠杆菌被广泛用于蛋白质表达、基因克隆、DNA测序等实验中。

其中，DH5α感受态细胞是最常用的一种。

本文将介绍DH5α感受态细胞的制备方法。

一、实验前准备1.1 菌种选取首先需要选择适合自己实验需求的大肠杆菌质粒转化菌株。

DH5α感受态细胞是含有F-质粒（Fertility factor）的E. coli K12株系，具有高度敏感性和高转化效率，广泛应用于基因克隆、DNA测序等领域。

1.2 质粒DNA提取在进行质粒转化前，需要提取所需质粒DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳等方法进行检测和纯化。

质粒DNA的提取方法有多种，如碱裂解法、酚/氯仿法等。

1.3 化学试剂准备进行DH5α感受态细胞制备的实验中，需要准备一些常用的化学试剂，如CaCl2、MgCl2、LB培养基等。

二、DH5α感受态细胞的制备方法2.1 菌株处理将DH5α感受态细胞从-80℃冰箱中取出，用无菌吸管取出适量菌液接种到含有LB培养基的50mL离心管中。

在37℃恒温振荡培养器中进行预培养，转速为200rpm，时间为8小时左右。

2.2 转化体系制备将质粒DNA加入到含有CaCl2和MgCl2的转化缓冲液中，并在室温下静置15分钟。

其中转化缓冲液的配方为：10mM Tris-HCl（pH 7.4）、100mM CaCl2、50mM MnCl2、100mM MgCl2。

2.3 转化处理将预培养后的DH5α感受态细胞进行离心处理，去掉上清液。

然后加入转化体系，并在室温下静置30分钟。

之后将样品加热至42℃水浴中进行热激处理，时间为45秒左右。

然后将样品放入冰水中进行冷激处理，时间为2分钟左右。

2.4 恢复处理将转化后的细胞加入到含有LB培养基的离心管中，并在37℃恒温振荡培养器中进行恢复处理，转速为200rpm，时间为1小时左右。

大肠杆菌感受态细胞制备和转化原理及注意事项1、感受态细胞概念重组DNA分子体外构建完成后必需导入特定宿主（受体细胞）使之无性繁殖并高效表示外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子转化。

在原核生物中，转化是一个较普遍现象，在细胞间转化是否发生，首先取决于供体菌和受体菌二者在进化过程中亲缘关系，其次还和受体菌是否处于一个感受状态有着很大关系。

所谓感受态：即指受体或宿主最易接收外源DNA片段并实现其转化一个生理状态，是由受体菌遗传性状所决定同时也受菌龄、外界环境因子影响。

cAMP能够使感受态水平提升一万倍，而Ca2+也可大大促进转化作用。

细胞感受态通常出现在对数生长久新鲜幼嫩细胞是制备感受态细胞和进行成功转化关键。

制备出感受态细胞临时不用时可加入占总体积15%无菌甘油或-70℃保留使用期6个月。

2、转化概念及原理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建重组DNA导入细菌体内使之取得新遗传特征一个方法。

它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域基础试验技术之一。

受体细胞经过部分特殊方法，如电击法、CaCl2等化学试剂法处理后，使细胞膜通透性发生改变，成为能许可外源DNA分子经过感受态细胞。

进入细胞DNA分子经过复制、表示实现遗传信息转移，使受体细胞出现新遗传性状。

大肠杆菌转化常见化学法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年发觉。

其原理是细菌处于0℃CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中DNA形成抗DNase羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化细菌中重组子中基因得到表示，在选择性培养基平板上可选出所需转化子。

Ca2+处理感受态细胞其转化率通常能达成5×106~2×107转化子/ug质粒DNA能够满足通常基因克隆试验。

感受态细胞制备制备感受态常用得方法就是电击法与CaCl2制备法,以下介绍CaCｌ2制备法:1、可以从－８0℃冰柜中,取出一支冻存菌株,于事先照过紫外得超净台中,用无菌得接种环轻轻蘸取菌种后,在无抗平板(由于Rocetta含有氯霉素抗性,需要涂布在氯霉素抗性得平板,后面得都就是如此)上划线,并将菌种迅速放回－80℃保存,在划线板上做好相应标记,于３7℃培养过夜。

2、从37℃培养过夜得新鲜平板上挑取一个单克隆,接种于2mlEP管中,3７℃,２20ｒｐm震荡培养约6个小时至对数生长中后期;将该菌悬液以1:1０0得比例接种于5０ml LB液体培养基(２瓶)中,3７℃振荡培养2、5小时至ＯD600＝0。

5。

注意:接种比例不得大于1:１0。

3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷得离心管(50ml)中,在冰上放置5~1０ｍin; 注意:划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板与多接一根试管,划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。

4、4℃５000g离心５分钟。

用预冷得去离子水洗涤沉淀,4℃ 500０ｇ离心５分钟;Nｏte:此步主要就是为了洗去培养基中得盐等5、沉淀加入2ｍl预冷得0、05mol/L CaＣｌ2—１5％甘油混合溶液,轻吹散,冰浴5分钟,4℃5００0ｇ离心5分钟;6、沉淀加入2ｍl预冷得0.05ｍol/L CａCl２—15％甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细胞悬液。

分装成50～1００μl得小份,贮存于－70℃可保存半年。

含15％甘油得0.０5mol/L CaCｌ2制备方法:称取0。

28g CaCl２(无水,分析纯),溶于５０ml重蒸水中,加入１5ｍl甘油,定容至100ｍl,高压灭菌。

感受态细胞得特征感受态:通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源ＤＮA得状态。

感受态细胞得特征:(1)细胞表面暴露出一些可接受外来ＤNA得位点(以溶菌酶处理,可促使受体细胞得接受位点充分暴露)。

(2)细胞膜通透性增加(用钙离子处理,可使膜通透性增加,使DNＡ直接穿过质膜进入细胞)。

大肠杆菌感受态制备方法
嘿，朋友们！今天咱就来讲讲大肠杆菌感受态制备这档子事儿。

你说这大肠杆菌感受态制备啊，就像是给大肠杆菌来个大变身，让它能乖乖地接受我们给它的新东西。

这可不像咱平时做饭那么简单哦，这里面的门道可多着呢！
咱先得准备好各种材料，就像大厨做菜得有新鲜的食材一样。

然后呢，要小心翼翼地操作，不能有半点马虎。

你想想，要是一不小心弄错了一步，那不就前功尽弃啦？
比如说，在培养大肠杆菌的时候，那可得像照顾小宝宝一样细心。

温度啊、时间啊，都得把握得恰到好处。

温度高了低了，时间长了短了，都可能出问题哟！这就好像咱烤蛋糕，火候不对，蛋糕可就不好吃啦。

还有啊，在做一些关键步骤的时候，真得瞪大眼睛，全神贯注。

那感觉，就跟走钢丝似的，稍微有点偏差，后果就不堪设想。

这可不是闹着玩的呀！
咱再说说那个转化的过程，把要导入的东西加进去，就盼着大肠杆菌能顺利接受。

这就好像给它送礼物，得让它喜欢，它才能收下呀。

要是它不乐意，那咱不就白忙活啦？
制备好的感受态大肠杆菌，那可是宝贝呀！能帮我们实现好多实验目的呢。

就好像我们有了一把神奇的钥匙，可以打开好多知识的大门。

总之呢，大肠杆菌感受态制备这事儿，需要我们有耐心、细心，还得有那么点技巧。

可不能马马虎虎对待哦，不然怎么能得到我们想要的结果呢？大家可得好好记住这些要点，认真去做呀！相信只要我们用心，就一定能做好大肠杆菌感受态制备这件事儿，让我们的实验顺顺利利的！。

1试剂的配制⑴5mol/L的KOH: 10mL称取KOH（南京化学试剂有限公司）2.8055g 加无菌的Mill-Q水至10mL⑵0.5mol/L的PIPES pH:6.7称取PIPES固体（进口Sigma）3.775g 加无菌的Mill-Q水至25 mL用5mol/L的KOH调pH至6.7 并过滤除菌。

⑶Inoue转化缓冲液的配制：500mL试剂需要量/500mL 终浓度MnCl2.4H2O（国药集团化学试剂有限公司） 5.44g 55mmol/LCaCl2.2H2O （AMRESCO） 1.1g 15 mmol/LKCl（南京化学试剂一厂）9.325g 250 mmol/L PIPES(0.5mol/L, pH:6.7) 10mL 10 mmol/LH2O 补水至500 mL过滤除菌4℃冰箱存放备用2 .DH5a化学感受态细胞的制备⑴第一天划平板：DH5a从-80℃冰箱冻存管划线至LB平板，37℃培养箱培养，约12hrs.⑵第二天接种子瓶：从平板挑单clone至种子瓶20mLLB Media中,37℃，220rpm摇床过夜.⑶第三天接子瓶：从种子瓶吸取一毫升DH5a种子菌液至子瓶中，25℃，220rpm摇床培养，约6～7hrs.⑷测OD：待OD值约为0.6时开始制作(离心机事先预冷)①将培养好的菌液转移至灭菌的50mL离心管中，置于冰上10min至菌液冰冷.②4℃,2500g离心10min.③弃上清，将离心管倒扣于滤纸上吸干剩余液体．④向５０ｍＬ离心管中加约１６ｍＬ的Ｉｎｏｕｅ转化缓冲液，重悬细菌沉淀（轻轻重悬，不要用振荡器或吹吸混匀）。

⑤4℃,2500g离心10min。

⑥弃上清，将离心管倒扣于滤纸上吸干剩余液体．⑦每管各加入５ｍＬＩｎｏｕｅ缓冲液，轻轻悬浮。

⑧每管各加入３７５ｕＬＤＭＳＯ，混匀，冰上１０ｍｉｎ．⑨每管１１０uＬ，快速分装并冷冻。

－８０℃，备用。

西医学是最近三四百年来建立在解剖学 、生物 学及现 代科学 技术基 础上、 发展起 来的一 门以“ 解剖人 、肉体 人”为 概念的 、新兴 的现代 医学科 学理论 体系。 主要采 用科学 实验方 法，从 宏观到 微观， 直至目 前的分 子基因 层次水 平，发 展极为 迅速， 超过其 它任何 一门医 学科学 决目
四、注意事项
➢ 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是 最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好 分装保存于干燥的冷暗处。
➢ 4. 防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均 应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip 头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试 剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶 或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂 DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要 的麻烦。
四、注意事项
➢ 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是 超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度 在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或 体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使 50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液 的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
3、弃去上清,加入200μl预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮 细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。
二、 转化 1、取200μl感受态细胞悬液置冰上。 2、加入1-10ulDNA,轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。 3、42℃水浴中热击2min,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。 4、向管中加入1ml LB液体培养基,混匀后37℃振荡培养 45min-1小时。 5、将上述菌液摇匀后取200μl 涂布于含Amp的筛选平板上, 待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。 对照: 另取未转化感受态细胞分别涂布筛选平板(Amp终浓度 50ug/ml)和空白平板

酵母感受态YIp的制备是一个复杂的过程，涉及到细胞培养、细胞分离、基因转化等多个步骤。

下面将详细介绍酵母感受态YIp的制备过程、注意事项以及可能遇到的问题及其解决方法。

一、准备工作1. 器材和试剂：培养箱、离心机、灭菌锅、移液器、细菌培养皿、显微镜、PCR仪、氯化钙溶液、甘油、感受态细胞质提取液、酵母基因组DNA提取液等。

二、制备步骤1. 酵母细胞培养：选择酵母菌株，将菌株接种到适宜的培养基中，培养酵母细胞。

当酵母细胞生长到适当的密度时，停止培养，用移液器将酵母细胞收集到离心管中，进行离心操作。

2. 细胞分离：将离心后的酵母细胞用氯化钙溶液悬浮，并通过梯度离心法或其他分离方法，将细胞分离得到感受态细胞。

3. 基因转化：将目的基因或质粒DNA与酵母感受态细胞混合，在一定的温度下进行转化。

转化过程中，DNA分子进入酵母细胞并被复制，最终形成基因组整合。

4. 筛选鉴定：通过PCR或酶切等方法对转化细胞进行筛选鉴定，确定是否成功转化。

三、注意事项1. 培养基和环境的控制：要保证培养基的质量和适宜的温度、pH值等环境条件，以保证酵母细胞的正常生长和增殖。

2. 细胞的收集和离心：要确保收集到的酵母细胞数量和质量，以保证感受态细胞的制备效果。

3. 感受态细胞的制备：要保证细胞的活性，避免长时间离心或暴露在空气中，以保持细胞的感受态状态。

4. 转化过程的控制：要确保DNA进入酵母细胞并成功整合，需要控制转化过程中的温度、时间等因素。

5. 筛选鉴定的准确性：要确保筛选鉴定的准确性，需要建立有效的筛选方法和标准，并对筛选结果进行反复验证。

四、可能遇到的问题及其解决方法1. 酵母细胞生长不良：检查培养基的质量和配方，调整培养条件，如温度、pH值、渗透压等。

2. 感受态细胞活性不足：制备过程中要保证细胞的活性，可以尝试增加细胞的离心时间和温度等。

3. 转化效率低：可以尝试增加DNA的浓度、延长转化时间、优化转化条件等方法来提高转化效率。

电转感受态细胞的制备电转感受态细胞 (Electroporation-mediated transfection) 是一种通过电场作用将外源 DNA 或 RNA 导入细胞的技术，该技术广泛应用于基因功能研究、药物筛选、基因治疗等领域。

本文将介绍电转感受态细胞的制备方法、原理以及注意事项，帮助读者更好地理解该技术的应用和操作。

下面是本店铺为大家精心编写的5篇《电转感受态细胞的制备》，供大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。

《电转感受态细胞的制备》篇1一、电转感受态细胞的制备方法电转感受态细胞的制备方法主要包括以下步骤:1. 细胞培养：将细胞接种到培养皿或培养瓶中，利用含有营养物质的培养基进行培养，使其生长至适宜的细胞密度。

2. 构建表达载体：将目的基因或 siRNA 克隆至表达载体中，构建表达载体的过程需要考虑转染效率、选择合适的启动子、转录因子等。

3. 电转感受态细胞：将构建好的表达载体与细胞一起孵育，然后在一定强度的电场作用下将表达载体导入细胞内。

4. 筛选阳性细胞：通过抗生素抗性基因或荧光标记等方法筛选成功转染的细胞，获得电转感受态细胞。

二、电转感受态细胞的原理电转感受态细胞的原理是利用高强度电场作用下，细胞膜通透性增加，使得带电的分子 (如 DNA 或 RNA) 能够更容易地通过细胞膜进入细胞内部。

电转感受态细胞技术相比传统转染技术，具有高效、快速、简便等优点，且对细胞的毒性较小。

三、注意事项在进行电转感受态细胞制备时，需要注意以下几点:1. 细胞密度的控制：细胞密度过高或过低都会影响转染效率，一般适宜的细胞密度为 10^6-10^7 个/ml。

2. 表达载体的质量和浓度：表达载体的质量和浓度对转染效率有很大影响，通常需要在 1-10 μg/μl之间。

3. 电场强度和脉冲次数的控制：电场强度和脉冲次数对转染效率也有很大的影响，需要根据实验条件和细胞类型进行调整。

4. 细胞培养条件的控制：细胞培养条件对转染效率也有很大的影响，如温度、CO2 浓度、培养基成分等。

胶回收DNA注意事项①切胶回收DNA片段是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。

所以为了减少胶的体积，我们就可以用相对比较薄的胶来跑电泳，通常只要够点样即可，或是采用薄而宽的梳子来跑胶。

这样可减少回收试剂引起的一些后续麻烦。

②主要还是DNA的浓度，如果DNA浓度不够，想胶小点也不可能。

③紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。

④利用凝胶回收试剂盒DNA回收效率较低或者未回收到目的片段可能有以下几个原因：胶块未完全溶解，可适当延长水浴时间，并增加上下颠倒次数辅助溶解；胶块体积太大，应先将其切为小块，分多次回收；电泳缓冲液pH太高，硅基质膜在高盐低pH结合DNA，如pH太高，应作适当调整；漂洗液中未加入无水乙醇。

⑤可以改用去离子水洗脱。

但是实验室所用纯水一般pH偏低，可利用NaOH适当调高其pH 值，以增加洗脱得率。

⑥洗脱产物含有残留的乙醇会影响后续酶切实验，请确保彻底去除漂洗缓冲液，具体方法参见回收效率低的解决方案。

⑦不可以使用更小洗脱体积（小于说明书提供的最小洗脱体积）进行洗脱以提高浓度，因为说明书提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积，若减少体积则不能将DNA 完全洗脱下来。

⑧电泳检测只有一条目的带，可以选用凝胶回收试剂盒。

如果后续实验对片段纯度要求较高，建议即使只有一条带，也可以切胶纯化，其回收得到片段的纯度可能要比直接回收高一些。

⑨琼脂糖凝胶胶块不溶可能是下述原因：琼脂糖质量不好；含目的片段的凝胶再空气中放置过久，使胶块失水、干燥，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存在4℃或-20℃；制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。

关于胶回收切胶的一点注意事项1. 电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源dna污染。

2. 切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。

大肠杆菌感受态细胞的制备注意事项一、引言大肠杆菌感受态细胞是一种重要的实验材料，用于研究细胞信号转导等生物学问题。

制备感受态细胞需要注意许多事项，本文将从实验前的准备、菌种的选取、培养条件的控制、质量检测等方面进行详细阐述。

二、实验前的准备1. 实验室环境要保持干净卫生，避免灰尘和异味对实验产生影响。

2. 实验器具和试剂要提前清洗消毒，确保无菌状态。

3. 实验人员要做好个人卫生，穿上实验服和手套，并进行必要的消毒处理。

三、菌种的选取1. 选择适合自己实验目的和条件的大肠杆菌品种。

2. 选择优质的菌株，如DH5α或BL21(DE3)等常用品种。

3. 菌株应该保存在低温下，并定期检测其纯度和活性。

四、培养条件的控制1. 培养基应该选择适合大肠杆菌生长和表达蛋白质所需营养物质组成的培养基。

2. 培养温度、pH值、氧气含量等条件应该根据不同的菌株和实验目的进行调整。

3. 需要注意的是，大肠杆菌感受态细胞的制备需要进行诱导，诱导剂类型、浓度和时间等参数也需要进行优化。

五、质量检测1. 感受态细胞的制备应该进行一系列质量检测，包括蛋白质表达水平、纯度和活性等方面。

2. 蛋白质表达水平可以通过Western blot或SDS-PAGE等方法进行检测。

3. 纯度可以通过蛋白质纯化和质谱分析等方法进行检测。

4. 活性可以通过生物活性实验或酶活性分析等方法进行检测。

六、其他注意事项1. 实验过程中要保持细心、耐心和严谨，避免操作失误影响实验结果。

2. 实验数据应该记录详细并及时处理，避免数据丢失或混乱。

3. 实验结果应该经过统计分析并与文献资料进行比较，确保结果可靠和准确。

七、结论大肠杆菌感受态细胞的制备是一个复杂而重要的实验过程，需要注意许多事项。

只有在实验前的充分准备、菌株的选择、培养条件的控制、质量检测等方面做好工作，才能获得高质量的感受态细胞，并为后续研究提供可靠的实验材料。