大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化大肠杆菌感受态细胞制备的原理：大肠杆菌自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难。

在转化实验中,通常先采用人工的方法制备感受态细胞，代表性的方法之一是Ca2+诱导法.感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等.细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成能接受外来的DNA分子的受体位点等。

Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化：①在0℃的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀,同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,诱导大肠杆菌形成感受态。

②Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶（DNase）的羟基—磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。

当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。

一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E。

coli DH5α单菌落，接种于3—5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。

将该菌悬液以1:100—1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。

（OD600值在0.4到0.6之间）二、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法）1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。

2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L 的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15—30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。

3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。

4、感受态细胞分装成200μl的小份，贮存于—80℃可保存半年。

大肠杆菌感受态过程中的注意事项：1、细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从—80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

实验三大肠杆菌感受态细胞的制备【课前预习】1、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理是什么？2、大肠杆菌感受态细胞的制备可以采用哪些方法？【目的要求】1、了解感受态细胞生理特性及制备条件；2、掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法；【基本原理】所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。

它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。

cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。

细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。

感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。

细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。

基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术，虽然对其基本原理仍然不完全清楚，但是比较认同的看法是，细菌处干0℃、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀形成球状，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附与细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，之后细菌在富含营养的培养基上生长，球状细胞复原并分裂繁殖，重组质粒在转化的细菌中，表达目的基因，因而在选择性培养基平板中，可以选出阳性细菌转化子。

Ca2+处理的感受态细胞，一般每微克DNA能转化105-106个细菌、环化的质粒DNA 愈小，转化率愈高。

环化的DNA分子比线性DNA分子转化率高1000倍。

CaCl2转化法的优点是：简单快速，重复性好，菌株适用范围广。

另外，电击法也可用于转化过程，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依赖短暂的电击，利用瞬时高压电流（数千伏特）处理细胞悬浮液，使微生物细胞膜在高压电作用下发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部，转化率最高达109-1010转化子/μg闭环DNA。

大肠杆菌体验态细胞的造备战变化本理及注意事项之阳早格格创做1、体验态细胞的观念沉组DNA分子体中建立完毕后必须导进特定的宿主（受体细胞）使之无性繁殖并下效表白中源基果大概曲交改变其遗传性状，那个导进历程及支配统称为沉组DNA分子的变化.正在本核死物中，变化是一个较一致的局里，正在细胞间变化是可爆收，一圆里与决于供体菌与受体菌二者正在进化历程中的亲缘关系，另一圆里还与受体菌是可处于一种体验状态有着很大的关系. 所谓的体验态：即指受体大概者宿主最易交受中源DNA片段并真止其变化的一种死理状态，是由受体菌的遗传性状所决断的共时也受菌龄、中界环境果子的效用.cAMP不妨使体验态火仄普及一万倍，而Ca2+也可大大促进变化的效用.细胞的体验态普遍出当前对付数死少久新陈幼老的细胞是造备体验态细胞战举止乐成变化的关键.造备出的体验态细胞姑且没有必时可加进占总体积15%的无菌苦油大概-70℃保存灵验期6个月.2、变化的观念及本理正在基果克隆技能中，变化特指将量粒DNA大概以其为载体建立的沉组DNA导进细菌体内使之赢得新的遗传个性的一种要收.它是微死物遗传、分子遗传、基果工程等钻研范畴的基础真验技能之一.受体细胞通过一些特殊要收，如电打法、CaCl2等化教试剂法处理后，使细胞膜的通透性爆收变更，成为能容许中源DNA分子通过的体验态细胞.加进细胞的DNA分子通过复造、表白真止遗传疑息的变化，使受体细胞出现新的遗传性状.大肠杆菌的变化时常使用化教法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年创造的.其本理是细菌处于0℃CaCl2的矮渗溶液中，菌细胞伸展成球形，变化混同物中的DNA产死抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲打处理，督促细胞吸支DNA 复合物，正在歉富培植基上死少数小时后，球状细胞复本并团结删值，被变化的细菌中沉组子中基果得到表白，正在采用性培植基仄板上可选出所需的变化子.Ca2+处理的体验态细胞其变化率普遍能达到5×106~2×107变化子/ug量粒DNA 不妨谦脚普遍的基果克隆考查.如正在Ca2+的前提上共同其余的二价金属离子如Mn2+、Co2+、DMSO大概还本剂等物量处理细菌，则可使变化率普及100~1000倍.化教法简朴、赶快、宁静、沉复性好，菌株适用范畴广，体验态细菌不妨正在-70℃保存，果此被广大用于中源基果的变化.除化教法变化细菌中，另有电打变化法，电打法没有需要预先诱导细菌的体验态，依赖短促的电打，督促DNA加进细菌，变化率最下能达到109~1010变化子/ug关环DNA.果支配烦琐愈去愈为人们所交受.3、体验态细胞造备及变化中的效用果素⑴、细胞的死少状态战稀度最佳从-70℃大概-20℃苦油保存的菌种中曲交转交用于造备体验态细胞的菌液.没有要用已通过多次转交及贮存留4℃的培植菌液.细胞死少稀度以每毫降培植液中的细胞数正在5×107个安排为好.即应用对付数期大概对付数死少前期的细菌,可通过测定培植液的OD600统造.对付TG1菌株OD600为0.5时,细胞稀度正在5×107个/ml安排.应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的分歧而分歧.稀度过下大概缺累均会使变化率下落.别的受体细胞普遍应是节造-建饰系统缺陷的突变株，即没有含节造性内切酶战甲基化酶的突变株.而且受体细胞还应与所变化的载体本量相匹配.⑵、量粒DNA的品量战浓度用于变化的量粒DNA应主假如超螺旋态的变化率与中源DNA的浓度正在一定范畴内成正比但是当加进的中源DNA 的量过多大概体积过大时则会使变化率下落.普遍天，DNA 溶液的体积没有该超出体验态细胞体积的5%1ng的cccDNA 即可使50ul的体验态细胞达到鼓战.对付于以量粒为载体的沉组分子而止，分子量大的变化效用矮，真验说明大于30kb 的沉组量粒将很易举止变化.别的沉组DNA分子的构型与变化效用也稀切相关，环状沉组量粒的变化率较分子量相共的线性沉组量粒下10~100倍，果此沉组DNA多数形成环状单螺旋分子.⑶、试剂的品量所用的CaCl2等试剂均需是最下杂度的，并用最杂洁的火配造，最佳分拆保存于4℃.⑷、预防杂菌战杂DNA的传染所有支配历程均应正在无菌条件下举止，所用器皿，如离心管、移液枪头等最佳是新的，并经下压灭菌处理.所有的试剂皆要灭菌，且注意预防被其余试剂、DNA酶大概杂DNA所传染可则均会效用变化效用大概杂DNA的转进.⑸、所有支配均需正在冰上举止没有克没有及离启冰浴可则细胞变化率将会落矮.。

实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验目的1.了解和掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法的原理和操作要点;2.质粒DNA转化大肠杆菌细胞的原理和方法.二、实验原理外源DNA只有转化到大肠杆菌细胞内才能得到扩增，而大肠杆菌转化实验的技术关键就是制备感受态细胞，即应用一些特殊方法（如点击法，CaCl2处理）处理后，使细菌细胞膜通透性发生暂时的改变，处于能允许外源DNA分子进入的状态，即为感受态细胞。

CaCl2转化法的基本原理是细菌在低温，低渗（0℃0.1mol/LCaCl2）的溶液中，菌体细胞膨胀成球形，局部失去细胞壁或细胞壁溶解，外来的DNA可形成抗DNase的羟基--钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42℃短暂热冲击处理，促使DNA复合物进入细胞，从而实现外源基因的转化。

三、实验材料（一）样品1.连接了目的基因的重组体分子2.细菌——大肠杆菌DH5α菌株：R （限制酶缺陷型），M（甲基化修饰缺陷型），Amp。

（二）试剂1.LB固体和液体培养基（营养培养基）和含Amp的LB固体培养基（选择培养基）；2.氯化钙溶液（1）0.01mol/Lcacl2溶液：称取0.56g无水cacl2（分析纯），溶于50ml水中，定容至100ml，高压灭菌后备用。

（2）保存液（含15%甘油的0.01mol/Lcacl2）：称取0.56g无水cacl2（分析纯），溶于50ml 水中，加入15ml甘油，定容至100ml，高压灭菌后备用。

3.氨苄青霉素（Amp）母液配成100mg/ml水溶液，-20℃保存备用。

（三）仪器及器材①超净工作台；②恒温摇床；③离心机；④V-1100分光光度计；⑤水浴锅；⑥微量移液器。

四、实验步骤（一）操作步骤1.感受态细胞的制备和保存感受态细胞的制备试验步骤步骤操作（1）细菌小量培养从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α单菌落，接种于3-5mlLB液体培养基中，37℃180r/min震荡培养过夜（2）扩大培养取细菌悬液1ml，以1:100的比例接种于100mlLB液体培养基中，37℃震荡培养1-2h至A600=0.5左右（3）收集菌体将培养液转入离心管中，冰上放置10min，然后4℃5000r/min离心10min，弃上清（4）cacl2处理菌体加入1/10体积（10ml）0-4℃预冷的无菌cacl2（0.01mol/L）溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置10min后，4℃5000r/min离心10min，弃上清（5）感受态细胞的手机与分装加入2000ul预冷的无菌cacl2e(0.01mol/L)重新悬浮细胞，分装成100ul备用（6）长期保存加入1600ul预冷的无菌cacl2(0.01mol/L)和400ul无菌的70%甘油轻轻悬浮细胞或直接加保存液200ml，冰上放置几分钟后，分装成100ul小份，液氮速冻10min后，-70℃保存备用2.转化DNA转化实验步骤步骤操作（1）冰浴取100ul感受态细胞悬液，在冰浴中加入10ul连接产物（或质粒DNA）（含量不超过50mg，体积不超过10ul），轻轻混匀，冰上静置30min（2）热击转化产物在42℃水浴中热击90s（勿摇动，勿超时），之后迅速置于冰上冷却2min（3）复苏向管中加入1mlLB液体培养基，37℃，100-180r/min震荡培养45min至菌液肉眼观察到轻微浑浊（4）涂板，培养取上述菌液100ul涂板，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12-16h（二）注意事项1.细胞的生长状态和密度。

大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化【目的】1. 掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验方法和技术。

2. 熟悉大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验原理。

【原理】1. 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化原理细菌的生物学特性由于吸收外源 DNA 发生可遗传的改变叫转化，在基因克隆技术中，转化（ transformation ）特指以质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。

转染（ transfection ）是指噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子导入细胞的过程。

未经特殊处理的宿主细胞较难进行转化，细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。

重组 DNA 转化细菌的技术操作关键就是通过一定的方法，人工诱导细菌进入一个敏感的感受态，以便外源 DNA 进入细胞内。

本实验采用氯化钙溶液处理对数生长期的E.coli. DH-5α细胞 , 使E.coli. DH-5α细胞的通透性增加，摄取外来 DNA （本实验中的质粒 DNA 为 pUC-18 ）能力增加，其原理为当细菌处于0 ℃ ， CaCl 2 低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNAase 的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃ 短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。

2. 转化大肠杆菌的筛选由于 pUC-18 （如图）含有 Amp r （氨苄青霉素抗性）基因便具有在含 Amp 培养基上生长的能力，形成单个菌落，而未转入 pUC-18 的E.coli. DH-5α细胞，不具有 Amp r 基因，在含 Amp 的培养基中，生长受到抑制，不能形成肉眼可见的菌落，从而使转化和未转化宿主细胞得以区分开来。

进一步将转化菌涂布在含IPTG 和 X-gal 的 LB 平板上，由于 pUC-18 还带有一段大肠杆菌β- 半乳糖苷酶基因（ lacZ ）的启动子及其编码α- 片段的 DNA 序列，此结构成为lacZ ＇基因，在 lacZ ＇基因中的靠近 5 ＇端有一段多克隆位点（ MCS ），而大肠杆菌含有β- 半乳糖苷酶ω片段的编码基因，尽管载体和宿主编码的这两个片段都没有活性，但两者同时存在时能够融为一体，形成具有酶活性的蛋白质，这样 lacZ 基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α- 互补。

实验八实验九大肠杆菌感受态细胞制备与转化一、实验目的1. 学习大肠杆菌感受态细胞的制备方法；2. 掌握大肠杆菌感受态细胞的质粒转化实验。

二、实验原理在大肠杆菌的分泌途径中，感受态细胞用于感知环境信号，并调控下游基因表达。

大肠杆菌感受态细胞通过感受胞外分子信号，使得胞内信号通路被触发，从而改变基因表达水平。

感受态细胞的制备需要温和条件和合适培养基的选择。

2. 大肠杆菌质粒转化大肠杆菌质粒转化技术是基因工程中应用广泛的技术。

将目的DNA（一般为质粒）转化到大肠杆菌中，目的DNA在大肠杆菌中能够被稳定复制并且表达。

常用的转化方法有化学转化法和电转化法。

三、实验步骤①在LB培养基中培养感受态细胞至对数生长期，收集细胞；②用感受态诱导液对收集的细胞进行感受态诱导；③收集诱导后的感受态细胞，用80%甘油置于-80℃冰盒中保存。

①在LB平板上分别涂抹野生型大肠杆菌菌落和转化素质粒（如pUC18）大肠杆菌菌落；②接种待转化的细胞于10ml LB培养液（含抗生素），在37℃振荡培养至OD600=0.4±0.1；③收集菌落，用LB缓冲液洗涤；④将菌落再悬于25mM CaCl2，转化素质粒；在微量水平下，用蒸馏水稀释菌落以便于操作；⑤恒流电极制备，用电解质转换液将转化后的菌落转移到LB培养基固体培养基上，加入抗生素；⑥在37℃下培养16~20小时。

可以制成固体培养基快速筛选。

四、实验注意事项1.在大肠杆菌感受态细胞制备过程中，需要注意细胞生长的温度和培养基的种类；2.大肠杆菌质粒转化时，需要注意细胞的生长状态和转化电压的设置；3.操作过程中应注意无菌操作，避免受到细菌感染。

五、实验结果分析检测感受态细胞能够感知胞外分子信号，并且响应相应基因表达水平的变化。

通过筛选获得含有目的质粒的大肠杆菌细胞，检测目的基因能否被稳定表达。

实验九：大肠杆菌质粒转化1. 了解大肠杆菌质粒转化技术的基本原理；2. 熟悉大肠杆菌质粒转化实验的操作步骤。

大肠杆菌感受态细胞制备及质粒转化及铺平板筛选转化子一、实验目的了解大肠杆菌感受态细胞制备、质粒转化大肠杆菌、转化子筛选的原理和一般方法。

二、实验原理质粒是基因工程的常用载体，携带外源基因的质粒可进入经过一定处理、容易接受外源基因的受体细胞，即感受态细胞，并在受体细胞内扩增（基因克隆）或表达外源基因（基因表达）。

质粒载体或携带外源基因的质粒进入受体细胞的过程称为转化，质粒转化的受体细胞称为转化子。

（一）制备感受态细胞常用方法：1.电击法（电穿孔法）。

电转法需要仪器，超螺旋质粒转化效率大于109转化子 /μgDNA)。

2.化学诱导法：a. CaCl2法：CaCl2试剂便宜、易得，超螺旋质粒转化效率大约为106－108转化子 /μgDN。

b. PEG法：PEG法制备方法更简便（一步完成），超螺旋质粒转化效率大约为106－108 转化子 /μgDNA。

（二）关于质粒：1.质粒是一种寄生于宿主细胞中染色体外裸露的双链DNA分子。

2.质粒的特点a.在宿主细胞中，质粒一般以超螺旋共价闭环DNA分子b.能自主复制、但其复制受到宿主细胞的控制，需要利用宿主的酶系统。

c.复制产物可正确分配给子代细胞3.质粒的用途: 主要作为基因重组的一种载体。

4.提取质粒的大致过程：扩增宿主菌：加适宜的抗生素（特异抗生素、氯霉素）。

裂解宿主菌：碱处理法、加热处理法、去污剂处理法、酶法。

提取质粒：变性沉淀其他物质、分离质粒。

纯化质粒：琼脂糖凝胶电泳、离子交换层析、氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心。

5.选择裂解方法原则选择裂解方法主要取决于质粒的大小。

(1)大质粒(大于15kb)选用缓和裂解法。

用溶菌酶和EDTA进行处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解原生质体。

(2)小质粒用较剧烈的方法分离。

在加入EDTA后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。

受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，使外源DNA能够进入；进入受体细胞的DNA分子可表达其携带的某些基因（如抗生素抗性、酶等选择标记基因），使转化细胞在选择培养基上表现出不同于未转化细胞的特征，从而可将转化细胞选择出来。

实验大肠杆菌感受态细胞的制备实验原理：转化是将异源DNA分子引入另一细胞系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。

受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，经过CaCl2等化学试剂的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。

经过转化的细胞在选择性培养基上，可以筛选出转化体，即带有外源DNA分子的受体细胞。

实验目的：学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞过程。

实验内容：JM109感受态细胞的制备、一、实验材料和试剂大肠杆菌JM109或DH5α，LB固体/液体培养基，0.1mol/LCaCl2溶液。

二、主要设备台式高速离心机，超净工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度计，微量移液器、恒温摇床，等。

三实验方法1.受体菌的培养从于37℃培养16-20小时的新鲜LB平板上挑取新活化单菌落，接种于3~5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养（300rpm）12小时左右，直至对数生长后期。

将该菌悬液以1：100~1：50（V：V）的比例接种于100ml LB液体培养基，37℃下振荡培养2~3小时至OD600=0.35～0.5左右。

2.感受态细胞的制备（1）在无菌条件下，将培养液转入预冷的1.5ml离心管中，冰上放置20min，使其停止生长。

（2）4℃下，4000rpm离心5min，弃去上清。

（3）加入0.75ml预冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮细胞，冰上放置30分钟，4℃下4000离心5min。

（4）弃去上清，加入0.2ml预冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮细胞，贮存于4℃备用。

或贮存于-70℃（加10-30%的甘油），可保存半年。

四.注意事项：1、整个实验都应在无菌的条件下操作。

2、整个操作均在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率会降低。