Protocol感受态制作与转化

实验三感受态的制备及转化一、实验目的1．了解质粒DNA转化原理2．熟悉感受态细菌的制备和转化步骤二、实验原理1．感受态细胞与转化感受态指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。

cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。

细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。

制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。

转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。

受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。

进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。

其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。

Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106～2×107转化子/μg质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。

如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100～1000倍。

除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109～1010转化子/ug闭环DNA。

宬槮感受态制备感受态制备实验操作1．电击感受态制备（1）实验准备①玻璃制品泡酸：合适且体积相对较大的锥形瓶、装吸水纸的培养皿、装去离子水和15%甘油的锥形瓶。

②塑料制品：200ul黄色枪尖剪去枪尖，1000ml蓝色枪尖，50mL离心管。

③溶液：LB培养基（活化和扩培），去离子水，15%甘油的水。

④以上物品都需要灭菌处理（121℃20-30min），离心管、枪头、ep管都需要烘干后低温放置。

（制备感受态的试剂都需要提前预冷）（2）实验操作①将存放在-80℃的菌种取出，在超净台内用枪尖沾取一下，分别加入相对应1mL LB液体培养基中，在37℃恒温摇床中220rpm过夜培养（根据菌种特性设定）；②次日以1:100的比例将上一步培养的菌液添加入LB液体扩培培养基中，37℃220rpm摇晃培养至OD600为0.4左右；③将培养得到的菌液至于冰上静置20-30min,然后在超净台内分装到事先灭菌预冷的50mL的离心管中，4℃，4000rpm，离心10min；④在超净台内去除上清，用吸水纸吸去多余的上清，加入事先预冷的ddH2O 10mL 左右，在冰上摩擦使菌体悬起，再加入适量的ddH2O混匀（根据实际情况）4℃，4000rpm，离心10min；（此步骤目的是洗去多余的杂质，此过程一定要轻柔，且保证离心管盖严，以免染菌。

）⑤从离心机里缓慢取出，防止震动使菌体悬起（菌体松散沉积）。

在超净台内去除上清，用吸水纸吸去多余的上清，加入事先预冷的15%甘油10mL，在冰上摩擦使菌体悬起，再加入适量的15%甘油混匀（根据实际情况）4℃，4000rpm，离心10min；1/ 3宬槮感受态制备⑥重复步骤（5）⑦从离心机里缓慢取出，在超净台内倒出上清，尽量避免倒出沉淀。

最后用1ml 左右15%甘油悬起，100uL每支分装到事先插冰上预冷的1.5mL EP管中。

（此过程一定要保证无菌和低温）⑧需要转化的感受态可以防冰上待用；多余的转移到液氮中快速冷冻，放入-80℃保存。

一、金黄色葡萄球菌感受态制备1、平板上挑单菌落于TSB液体培养基过夜，37摄氏度摇床。

2、按1%接种于2ml:200ml 培养基培养2h，OD600=0.4-0.53、2个50ml管冰上预冷，4℃将培养的菌分装2个50ml管中，5000rpm离心6-8min，去上清。

4、加10ml 0.5M蔗糖，打散菌体，再加40ml 0.5M蔗糖混匀，5000rpm离心5min，去上清。

5、重复4 .6、再重复4，但加到50ml 0.5M蔗糖后要在冰上冰浴30min，再5000rpm离心5min，去上清。

7、用600ul 0.5M蔗糖垂悬。

8、分装菌液，每管100ul。

9、液氮冷冻10s，存于-80℃。

二、大肠杆菌感受态1、平板上挑单菌落于LB液体培养基过夜，37摄氏度摇床。

2、按1%接种于2ml:200ml LB培养液体基培养2h（用50ml管），到OD600=0.4-0.6。

3、冰浴10min。

4、4℃5000rpm离心5min，去上清。

5、加30ml 预冷0.1mol/l CaCl2-MgCl2 （80mmol/l CaCl2和20mmol/l MgCl2）垂悬，冰上静置10min。

6、2 ml 预冷0.1mol/l CaCl2-MgCl2 （80mmol/l CaCl2和20mmol/l MgCl2）垂悬，冰上静置10min。

7、分装每管100ul，存于-80℃。

三、超级感受态（一）溶液1、TB （1L）终浓度MnCl2-4H20 10.88g 55mmol/lCaCl2 1.665g 15mmol/lKCl 18.65g 250mmol/lPIPES(0.5mol/l,ph 6.7) 20ml 10mmol/lH2O 补至1L0.45um 过滤除菌1、PIPES(0.5mol/l,ph 6.7),哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES),≥99.5% 英文名称：Piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid1.5g PIPES溶于80ml水，5mol/l，KOH调Ph=6.7，定容100ml。

大肠杆菌超级感受态细胞原理和制备
所谓感受态，是指受体（或宿主）细胞最容易接受外源DNA片段而不将其降解并实现其转化的一种生理状态。

一. 原理：
人工感受态的形成, 需要低温和Ca2+处理，细胞膨胀成球状，细胞表面正电荷增加，
通透性增加，这样可能破坏了细胞膜上的脂质阵列。

转化的质粒DNA 由于形成抗
DNase 的羟基-钙( Ⅱ) - 磷酸复合物而粘附于细胞表面。

Ca2+与膜上的多聚羟基丁
酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物利于外源DNA 的渗入。

cAMP可以使感受态水平提高10000倍，而Ca2+也可大大的提高转化的效率，在
Mg2+的辅助下Ca2+感受的细胞转化率比单用Ca2+处理的高1.84倍。

目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。

主要有两种假说：
1）局部原生质体化假说——细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。

2）酶受体假说——感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。

证据是：
二. 制备：
本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期，实验操作必须在无菌低温下进行。

感受态的制备与转化，质粒提取（原理和操作步骤）感受态细胞: 理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。

即指细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA并使其基因型和表现型发生相应变化的能力。

如大肠杆菌经CaCl2处理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。

一般来说,感受态细胞的最基本要求是：1、没有质粒2、容易被转进去（一般是G-细菌，细胞壁薄）3、营养条件一般，非苛养菌CaCl2法：操作原理：1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。

2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。

进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。

意义：将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

转化是指质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。

实验材料：E. col i DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA；eppendorf管。

试剂:1.LB固体和液体培养基2.Amp母液(储存浓度50mg/ml)3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。

4.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。

实验方法原理细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenent cells）。

带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。

受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。

实验步骤1.从37°C过夜(16-20 hours)培养平皿内挑取一个直径约为2到3毫米的单菌落。

把这样的单菌落接种于一只装有5毫升LB肉汤的30毫升灭菌试管中，于37°C 下振荡培养过夜。

2. 转移0.2毫升过夜培养物于一只装有15或20毫升LB的50毫升灭菌三角瓶中. 于37°C下振荡培养2到2.5小时（此时细菌处于对数生长期）。

3. 室温下，4000 rpm离心5分钟收集对数期细胞。

弃培养基，保留细胞沉淀。

5. 加入10毫升冰冷的CaCl2 溶液，并轻微打匀。

6. 4°C下，4000 rpm离心10分钟收集细胞。

7. 弃CaCl2 溶液，保留细胞沉淀。

8. 加入0.8毫升(每25毫升初始培养物加入1毫升)冰冷的0.1M的CaCl2 溶液，并轻微打匀。

冰浴放置若干小时为最好。

9. 此时的感受态细胞可以依照下面的步骤10到16直接进行转化操作，也可以分装,加入甘油后于-70°C冰冻保藏。

10. 向事先灭菌，并经冷处理的1.5ml 聚丙烯管中转移100微升感受态细胞悬浮液。

向每个转化管中加入DNA(一般含量是10微升或更低的体积中所含量应不超过50纳克)。

细心混匀管中成份。

于冰浴放置30到40分钟。

11. 把转化管转移至放于42°C循环水浴锅中预热的试管架上，准确计时90秒。

（此时不能摇动转化管）12. 把试管迅速转移至冰浴2到3分钟。

实验五感受态细胞的制备及转化一、目的掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。

二、原理所谓感受态细胞是通过一定的试剂处理细胞，使细胞处于易于接受外源DNA的生理状态。

通常用0.1mol/L CaCl2处理细胞，就可得到感受态细胞。

细胞原本所处的生理状态制备对感受态细胞的制备很关键。

将重组DNA导入细胞的方法有多种，入热休克法，电击法等。

通过这些方法可以使细胞膜出现暂时的松弛，导致外源DNA进入细胞。

三、试剂与仪器（一）试剂1．0.1mol/L CaCl2称取无水氯化钙56g，加重蒸水至500ml，于高压锅灭菌20分钟。

2．LB液体培养基（见实验一）3．LB固体培养基（见实验一）4．氨苄青霉素（100mg/ml）（二）仪器1．冷冻离心机2．平衡天平3．无菌操作台4．微量移液器5．高压灭菌锅四、操作步骤（一）感受态细胞的制备(0.1mol/L CaCl2方法)1．从深冻菌株中划单克隆（LB、建议用不加抗生素和加抗生素的两种培养基，检查有无污染）。

2．挑单克隆于5ml LB中(不加抗生素)，37℃摇菌培养12~16小时(300rpm)(可过夜培养)。

3．取1ml菌液（接种）到50 ml LB中(37℃，预热), 扩大培养。

应准备两个培养物。

4．约2小时开始，用一个培养测OD600值（此培养只做测量OD600值用，OD600值指示细胞密度，这里用于判断培养物是否处于对数生长期）。

OD600值在0.4 - 0.5时( 注意此时培养物处于对数生长期，细胞数应在20分钟内加倍。

所以建议OD600值应控制在0.4为佳)，立即把另一个培养物放置在冰浴里10分钟，让细胞停止分裂。

5．把培养物分装到两个50毫升聚丙烯管(灭菌并预冷)，4℃离心4000rpm, 10分钟。

6．弃上清, 加入10ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀，4℃离心4000rpm，10 分钟。

7．弃上清, 加2ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀。

大肠杆菌感受态的制备：1)第一天下午，从平板中挑取一个单菌落（或者挑取保存菌种），接种到5ml LB培养基中，同时为确定所选菌株没有被污染，做阳性对照：Top 10、DH5α用氨苄、卡那抗性的培养基；BL21还应加上氯霉素抗性培养基，正常状态下，抗性培养基中不会有菌生长。

2)如果抗性培养基没有菌生长，将无抗性培养基中的菌液（1:100）接种到200ml LB培养基中，37℃剧烈震摇培养（旋转摇床，240rmp/min）。

为得到有效转化，活细胞数不应超过108个/ml，可每隔15-20min测量OD600值来监测培养物的生长情况，OD600=0.375时开始制备（超过或小于改值，影响感受态的效果）。

注：DH5α应该OD600=0.4～0.5。

（BL21 OD=0.3~0.5）3)在无菌条件下，将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管（Falcon270）中，冰上放置10min，使菌液冷却到0℃。

4)4℃，1600g，7min。

5)倒出细胞液，将管倒置以使最后残留的痕量培养液流尽（可事先在超净台紫外照射滤纸，倒扣上面，没有过多液体即可）。

6)以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴30min。

7)4℃，1100g，5min。

倒出细胞液，将管倒置。

8)重复步骤6、7（第二次重悬后即可离心，不用再等30min）。

9)每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀。

100µl/管分装，-80℃保存。

10)作阳性、阴性对照：①将制备的感受态接种到无抗生素的LB平板上，检查感受态的状态。

②将制备的感受态接种到有抗生素的LB平板上，检查有无染菌。

③将一空载体分别转化到新制备的感受态和一已知转化效率的感受态中，检查新制备的感受态的转化效率。

准备物品：①. 甘油-CaCl2：1.1g CaCl2 + 20ml甘油，加水至100ml（具体量根据实验来定）②. 无菌物品：Ep管、50ml离心筒、（1ml，200ul）枪头、两个5ml枪头，灭菌后-20℃预冷。

一感受态细胞的制备（材料：DH5α菌）1.下午三点左右将大肠杆菌接种于培养管中（取冻存的大肠杆菌接种于5ml LB 培养基中或用牙签挑菌培养），以220rpm在摇床上震荡过夜培养。

2.第二天取已经摇好的的菌液50或100ul接种于盛有5mlLB培养基的培养管中，每隔20分钟观察一次（大肠杆菌大约20分钟繁殖一次），2到3个小时后培养基变浑浊，将培养管置于灯光下摇动会出现大肠杆菌的絮状条带，此时培养液的OD600nm≦0.5，细胞数小于10的8次方。

3.将培养好的大肠杆菌倒到1.5ml的eppendorf管中（将菌体混匀后再倒），以10000rpm，离心1min.倒掉上清液后将培养管中的液体混匀后继续倒到eppendorf管中并于冷冻离心机中离心，直至将培养管中的菌液全部离心完毕。

4.倒净上清液后将盛有菌体的eppendorf管置于冰上，加入100ul冰的氯化钙（0.1M）溶液，并将菌体与溶液混合均匀（用手指用力弹），置于冰上静置10min （此时勿忘将氯化钙同样至于冰上保持其冰冷）。

5.将eppendorf管置于冷冻离心机中以8000rpm，离心1min。

6.弃上清后加50ul的氯化钙溶液混合均匀，若有液体溅到eppendorf管壁上可以进行短时离心，此时已制成大肠杆菌的感受态细胞。

大肠杆菌至于冰上备用，或于-80︒C保存。

二转化（transformation）1.另取1.5ml的eppendorf管置于冰上（做好相应标记），将含有感受态细胞的菌液混匀后取10ul的感受态细胞加入到eppendorf管中，随后加入1ul的质粒混匀（用手指肚轻弹），至于冰上静置30min。

2.将离心管置于42摄氏度的水浴锅中1到2min，随后迅速置于冰上，并向离心管中加入500ul LB培养基混匀后置于摇床上震荡培养1小时（37摄氏度，220rpm，使菌体恢复正常生长状态）。

3.用移液枪从离心管中取已经摇好的菌液100ul均匀的加入到相应的选择培养基上，用刮刀将菌液均匀的涂布到培养皿上过夜培养。

质粒DNA转化感受态大肠杆菌一、实验原理转化（transformation）是将一种生物（供体）的遗传物质（通常为DNA）转入另一种生物（受体）并使其在受体中得以保存和繁殖的过程。

大肠杆菌不是天然感受菌，在低温（0~5℃）环境下经CaCl2处理，细胞壁变松变软后能摄入外源DNA，这种状态称为感受态细胞（competent cell）。

质粒DNA或重组DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。

二、实验材料准备1. 器材微量移液取样器，移液器吸头，恒温水浴锅，制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，1.5 ml Eppendorf管，50 ml离心管，乳胶手套，恒温培养箱2. 试剂LB液体培养基、LB固体培养基、100mg/ml 氨苄青霉素(或卡拉霉素) 、感受态细胞3. 材料处理转化之前超净台紫外照射15-20min；枪头、50ml离心管需提前灭菌，烘箱烘干；液体LB培养基灭菌后放到冷库，防止长菌；三、转化1．从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,置冰上解冻1-2 min。

2．加入质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟。

3．42℃水浴中热击90秒, 然后迅速置冰上2min，整个过程不要振荡菌液。

4．向管中加入200μl LB液体培养基(不含抗生素),混匀后37℃振荡培养（225 rpm）1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因。

5. 将上述菌液摇匀后涂布于含Amp（或kna）的LB琼脂平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后,37℃倒置培养12-16小时。

四、注意事项1.加液体LB培养基之前观察其是否长菌2.玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂3.提前打开水浴锅，将温度调到42度4.实验目的是表达蛋白，可热击完直接涂平板；目的是质粒扩增或后续要PCR，需在热击后37℃振荡培养复苏1小时5.实验室常用的用于质粒扩增的感受态菌是Top10，用于质粒表达的感受态菌是BL21 Star(DE3)。