核酮糖1,5-二磷酸羧化酶(RuBPCase)检测试剂盒(RuBP比色法)

一、水分代谢一、名词解释1.水势：每偏摩尔体积水的化学势。

即水溶液的化学势（μw）与纯水的化学势（μ0w）之差（△μw），除以水的偏摩尔体积所得的商。

2.渗透势：由于溶质颗粒的存在，降低了水的自由能，因而其水势低于纯水的水势。

3.自由水：距离胶粒较远而可以自由流动的水分。

4.束缚水：靠近胶粒而被胶粒束缚不易自由流动的水分。

5.渗透作用：水分子通过半透膜由水势高向低系统渗透6.根压：由于水势梯度引起水分进入中柱后产生的压力。

7.气孔蒸腾：通过气孔的蒸腾。

气孔是蒸腾过程中水蒸气由体内排到体外的主要出口。

8.蒸腾拉力：由于地上部分蒸腾作用产生的一系列水势梯度使导管中水分上升的力量。

9.蒸腾作用：是指水分以气体状态，通过植物体的表面（主要是叶子）从体内散失到体外的现象。

10.蒸腾速率：植物在单位时间内，单位面积通过蒸腾作用散失的水量。

11.蒸腾系数：植物制造1g干物质所需要消耗的水分量。

二、简述1.水分在根内的运输途径。

土壤水分→根毛→根皮层→根中柱→根导管→茎导管2.气孔运动的机理。

a)淀粉-糖互变学说：这个学说认为保卫细胞光合作用消耗CO2，细胞质内的ph增高，淀粉水解为可溶性糖，保卫细胞水势下降，从周围的细胞中吸收水分，气孔便张开，在黑暗中则相反，气孔关闭。

b)钾离子吸收学说：K+离子进入保卫细胞是由于ATP质子泵的作用。

促进此泵活化的壳梭孢素可以刺激气孔张开，抑制此泵活动的钒酸盐（VO3+）则抑制气孔张开。

c)苹果酸生成学说：细胞质中的淀粉通过糖酵解作用产生的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），在PEP羧化酶的作用下，与HCO3-作用，形成草酰乙酸，进一步还原为苹果酸进入液泡，降低液泡水势，水分进入保卫细胞，使气孔张开。

3.试述蒸腾作用的生理意义。

1)引起被动吸水，是水分吸收和运输的动力2)植物吸收和运输矿物盐类的动力（载体）3)能降低植物体和叶片温度4)蒸腾作用的正常进行，气孔开放，有利于光合作用CO2的固定二、矿质营养一、名词解释必需元素：维持正常生命活动不可缺少的元素。

核酮糖1,5-二磷酸羧化酶羧化活性的测定一、实验原理核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶是光合作用中一个关键酶，它在Calvin 循环中催化中催化CO2的固定，生成2分子的3-磷酸甘油酸(3-PGA)，同时它是一个双功能酶，又能催化将O2加在核桐糖-1,5-二磷酸(RuBP)上生成1分子的磷酸乙醇酸和1分子的PGA ，这两个反应的速率由O2和CO2的浓度调节[1]。

分光光度酶偶联法是根据RuBP 羧化酶催化RuBP 与CO2反应产生的磷酸甘油酸与NADH 的氧化作用相偶联的原理设计的。

当加入ATP 及NADH 后，NADH 在PGK 和GAPDH 的催化下氧化为NAD+，每羧化l mol RuBP 有2 mo1 NADH 被氧化，根据在波长340 nm 处光密度的变化，可测知NADH 的数量，从而算出同化CO2的值。

Rubisco 羧化活性的测定可用酶偶联法将3-PGA 的变化转换为NADH 的变化来测定。

RuBP+CO2+H2O −−−−→−+2Mg RuBPC ，2(3-PGA)3-PGA+ATP −−−−−→−－磷酸甘油激酶31,3-二磷酸甘油酸+ADP 1,3-二磷酸甘油酸+NADH −−−−−−→−－磷酸脱氢酶甘油醛－33-磷酸甘油醛+NAD++PO43+ 二、实验仪器及材料 2.1实验仪器研钵、分光光度计、秒表、比色杯、冷冻离心机 2.2实验材料小麦叶片 三、实验步骤1.核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶活性额测定1.1称取0.1 g 新鲜叶片，放于已经预冷的研钵中。

1.2加入1 mL ，4℃提取缓冲液（50 mM Tricine-NaOH pH 7.9， 0.1% PVP-40, 5 mM MgCl2）冰上研磨，（缓冲液分3次加入，第一次0.5ml ，剩下两次分别0.25ml 将研钵冲洗干净），将研好的样品装入1.5ml 的离心管中，放于冰盒中。

12000 g ，4℃，离心10 min 。

第三章光合作用一、名词解释1．光合色素：指植物体内含有的具有吸收光能并将其用于光合作用的色素，包括叶绿素、类胡萝卜素、藻胆素等。

2．原初反应：包括光能的吸收、传递以及光能向电能的转变，即由光所引起的氧化还原过程。

3．红降现象：当光波大于685nm时，虽然仍被叶绿素大量吸收，但量子效率急剧下降，这种现象被称为红降现象。

4. 爱默生效应：如果在长波红光（大于685nm）照射时，再加上波长较短的红光（650nm），则量子产额大增，比分别单独用两种波长的光照射时的总和还要高。

5．光合链：即光合作用中的电子传递。

它包括质体醌、细胞色素、质体蓝素、铁氧还蛋白等许多电子传递体，当然还包括光系统I和光系统II的作用中心。

其作用是水的光氧化所产生的电子依次传递，最后传递给NADP+。

光合链也称Z链。

6．光合作用单位：结合在类囊体膜上，能进行光合作用的最小结构单位。

7．作用中心色素：指具有光化学活性的少数特殊状态的叶绿素a分子。

8．聚光色素：指没有光化学活性，只能吸收光能并将其传递给作用中心色素的色素分子。

聚光色素又叫天线色素。

9．希尔反应：离体叶绿体在光下所进行的分解水并放出氧气的反应。

10．光合磷酸化：叶绿体（或载色体）在光下把无机磷和ADP转化为ATP，并形成高能磷酸键的过程。

11．光呼吸：植物的绿色细胞在光照下吸收氧气，放出CO2的过程。

光呼吸的主要代谢途径就是乙醇酸的氧化，乙醇酸来源于RuBP的氧化。

光呼吸之所以需要光就是因为RuBP的再生需要光。

12．光补偿点：同一叶子在同一时间内，光合过程中吸收的CO2和呼吸过程中放出的CO2等量时的光照强度。

13．CO2补偿点：当光合吸收的CO2量与呼吸释放的CO2量相等时，外界的CO2浓度。

14．光饱和点：增加光照强度，光合速率不再增加时的光照强度。

15．光能利用率：单位面积上的植物光合作用所累积的有机物所含的能量，占照射在相同面积地面上的日光能量的百分比。

二、填空题1.光合作用是一个氧化还原过程，其反应的特点是：、、。

RuBP羧化酶是一种双功能酶，即可催化RuBP的羧化反应，又可催化加氧反应，故齐全名为RuBP羧化酶/加氧酶（RuBP c arboxy l ase/oxy genas e,简称Rubisco）。

Rubisco 普遍存在于自养生物中，在C3植物中含量较为丰富，占叶可溶性蛋白质的50%以上，是自然界最丰富的一种蛋白质。

在叶绿素间质中浓度可达300mg/ml。

同时，Rubisco 也是高等植物中有机氮的重要贮藏形式。

通过本实验进一步掌握光合作用中的关键酶Rubisco的性质，用分光光度法测定Rubisco的羧化活性。

【实验原理】Rubisco催化RuBP与一份子CO2结合，产生两分子PGA，PGA在3-磷酸甘油酸激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下，产生3-磷酸甘油醛，并使还原型辅酶I（NADH）氧化，反应如下：RuBP+CO2+H2O----2PGA3-PGA+ATP------1,3-二磷酸甘油酸+ADP1,3-二磷酸甘酸+NADP+H+ -------3-磷酸甘油醛+NAD+通过上述偶联反应，可讲3-PGA的变化转变为NADP的变化来测定，因此可用紫外分光光度计在340nm处测定NADP的减少量来计算酶活力。

【实验材料】植物叶片【仪器设备及用品】紫外分光光度计，冷冻离心机，匀浆器或研钵，移液管等【试剂药品】1.RuBPCase提取介质：40mmol/L(PH7.6)Tris-HCl缓冲液，内含10mmol/LMgCl2、0.25mmol/LEDTA和5.0mmol/L谷胱甘肽。

2.反应介质：0.1mmol/LTris-HCl缓冲液（PH7.8），内含12mmol/LMgCl2和0.4mmol/LEDTA.3.50mmol/LATP溶液4.50mmol/L磷酸肌酸（Cr~P）溶液5.0.2mmol/LNaHCO3溶液6．160U/L磷酸肌酸激酶溶液7．25mmol/LRuBP溶液8．160U/L3-磷酸甘油醛脱氢酶溶液9．160U/L3-磷酸甘油酸激酶溶液10. 5mmol/LNADH溶液附注：U/L表示每升酶制剂含有多少酶活力单位。

1,5-二磷酸羧化酶／加氧酶（Rubisco）植物生理学通讯第43卷第2期,2007年4月363核酮糖.1,5.二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)梅杨,李海蓝,谢晋,罗红艺华中师范大学生命科学学院,武汉430079Ribulose-I,5-bisphosphateCarboxylase/oxygenase(Rubisco)MEIY ang,LIHai—Lan,XIEJin,LUOHong—YiCollegeofLifeSciences,CentralChinaNormaliVPl魄Wuhan430079,China提要:文章就核酮糖一1,5.二磷酸羧化酶,加氧酶(Rubisco)的分布,结构,性质,分类与功能的研究进展作了介绍.关键词:核酮糖一1,5一二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco);Rubisco类似蛋白(RLP);羧化/氧化值;热稳定性;分类核酮糖一1,5一二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose一1,5一bisphosphatecarboxylase/oxygenase,Rubisco)是植物光合作用过程中固定CO,的关键酶,同时也参与植物的光呼吸代谢途径,消耗植物光合作用合成的有机物,由此造成的净光合效率损失高达50%(Lundqvist和Schneider1991;熊晓然等2003;Ashida等2005).因此,研究Rubisco对提高植物的光合作用效率有重要意义.自从1953年Calvin等在研究光合碳循环过程中证实其存在至今,有关Rubisco的一系列问题不断得到阐明,人们对其性质,结构,类型和功能等诸多方面有了更深入的了解,这方面的研究己取得了较大进展,本文就此作介绍.1Rubisco的分布与定位Rubisco广泛分布于具光合功能的细胞器中.它是一个含量很丰富的酶,据估计全世界Rubisco 的量约有4×10吨.Rubisco在C植物中主要定位于叶肉细胞叶绿体问质中,在基粒片层上也有少量分布;在C植物中则定位于维管束鞘细胞中的叶绿体问质内.低等藻类的Rubisco主要定位在淀粉核上.许多化能自养细菌和蓝藻中存在多角形细胞内含物,其中含有大量的羧化酶,称之为羧基化小体.羧基化小体最初是从氧化硫细菌中分离出来的,并且含有大量的Rubisco.有研究表明,羧基化小体是原核生物体内储存Rubisco的重要场所,能够协助Rubisco在低浓度的CO,条件下完成羧化.那不勒斯硫杆菌(Thi0baci,,U neapolitanus)的Rubisco缺陷菌株无羧基化小体的形成,且必须在高浓度的CO,下才能生长(Baker等1998).海洋氢弧菌(Hydrogenovibriomarinus)MH一110在CO,浓度低于0.15%时就会形成羧基化小体(Y oshizawa等2004).2Rubisco的结构采用x射线晶体衍射技术,人们解析了不同来源的Rubisco的晶体结构,包括烟草(Nicotiana tabacum),菠菜(Spinaciaoleracea),深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum),莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii),蓝藻聚球藻(y,zcDcDcc"PCC 6301),喜温红藻(Galdieriapartite),绿色硫细菌(chlorobiumtepidum),超耐热原始菌(菌, ThermococcuskodakaraensisKOD1)等(Kitano等2001;Parry等2003;Li等2005).Rubisco一般由多个大亚基(LSU)和小亚基(ssu)组成,其中大亚基的分子量为50～55kDa,小亚基为1218kDa(Ashida等2005).大亚基具有催化功能,小亚基仅具有调节作用.迄今的研究认为,Rubisco的大亚基由N,C两个结构域组成.N结构域从N末端开始,包括137个氨基酸,其中含有5股D折叠.C结构域中含有丰富的0c螺旋,其中以0c/D桶状结构域(al Dbarreldomain)最引人注目.它包括8个0c螺旋和8个D折叠,彼此连接成8个环.一个大亚基收稿2006.11—20修定2007—03一l2资助华中师范大学精品课程建设项目.通讯作者(E—mail:******************.ca:Tel:************).364植物生理学通讯第43卷第2期,2007年4月的羧基末端为另一个大亚基氨基末端部分覆盖,形成漏滴状的活性中心,Mg参与其中.Mg与亚基中的3个氨基酸残基所含有的氧原子发生作用,它们分别是氨甲酰化的Lys,侧链Asp3和Glulq4(Lundqvist和Schneider1991).C端结构域同时含有一个特征性的突环(Lo0p6).Loop6影响酶与气体分子(包括CO和O)的亲和性,一系列发生在环内的突变均能影响酶的羧化/氧化值(Q 值);在形成烯醇化中间产物的过程中,Loop6也起关键性的作用(Parry等2003).Loop6同时还影响酶活性状态的形成与维持.活性中心的模拟分析表明,Rubisco是否处于活性状态与活性中心(Lysl75,Lys201)和Loop6(Lys334)的3个Lys残基密切相关(熊晓然等2003).小亚基远离活性中心,其含有4个反向平行的p折叠和2个0c螺旋,p折叠和0c螺旋的核心含有疏水的氨基酸残基及与大小亚基相互作用有关的保守氨基酸残基.小亚基能促进CO,与Mg对酶的活化,维持和稳定酶的活化构象.Spreitzer (2003)认为,小亚基可能在进化过程中扮演聚集大亚基活性位点的角色,小亚基可能有更多特异性功能.3Rubisco的类型根据Rubisco大亚基氨基酸序列同源性及空间结构的相似性,可以将其分为4类,即I,II,III,IV型(表1).I型主宴存在于能够进行光合作用的有机体内,如高等植物,真核藻类,蓝藻,光能及化能自养细菌及其它一些原核生物,它由8个大亚基和8个小亚基组成,呈LS的结构.Tabita(1995)分析不同的I型Rubisco结构后,又将其分为"Green—like"和"Red—like"2类,并进一步将其划分为A,B,C及D4个亚类.II型Rubisco由2罐个大亚基组成,呈L的结构,其分子量为110-450kDa,主要存在于一些光能及化能合成细菌,海产甲藻如共生甲藻(SymbiodiniumSpp.),膝钩藻(Gonyaulaxpolyedra)等中(Rowan等1996;Nassoury等2001).尽管I型与II型Rubisco在活性位点上的氨基酸残基高度保守,但II型与I型的大亚基的同源性仍很低,仅为28%(Kitano等2001;Liao等2004).III型也仅由大亚基组成,呈L结构,存在于某些嗜热古生菌如菌,詹氏甲烷球菌等中(Klenk等1997;Watson和Tabita1999;Kitano等2001).有人研究Tk-Rubisco的结果表明,它是由大亚基组表1不同来源的Rubisco及其羧化/氧化值,结构和功能代表植物;一表示暂无相关数据.好热性硫磺细菌含有2类Rubisco:rbcL—l和rbcL.2(Karlin和Mrazek2000):超耐热原始菌先前报道称为PyrococcuskodakaraensisKODI(Kitano等2001).植物生理学通讯第43卷第2期,2007年4月365成的(L)的十聚体,与菠菜中的I型Rubisco有36%的同源性,与深红红螺菌中的Ⅱ型Rubisco有30%的同源性(Kitano等2001);分析詹氏甲烷球菌Rubisco的序列表明,它与蓝藻中的聚球藻I型Rubisco有41%的同源性,与深红红螺菌中的II型Rubisco有33%的同源性(Watson和Tabita1999).尽管以上三类Rubisco相互之间的同源性较低,但已知的Rubisco参与羧化或氧化核酮糖一1,5一二磷酸(ribulose一1,5一bisphosphate,RuBP)过程的所有保守氨基酸残基在I,II和III型中都存在,除了Ⅲ型中Phe.∞被其它氨基酸所取代(Ashida等2005).IV型又称为Rubisco类似蛋白(rubisco—like—protein,RLP),存在于非光合细菌,部分不依赖卡尔文循环的光合细菌和古生菌如绿色硫细菌,好热性硫磺细菌rbcL.,泥生绿菌,枯草芽孢杆菌等中(Klenk等1997;Watson和Tabita1999;Hanson和Tabita2001,2003Ashida等2003).它与I,II,III相比,许多活性位点保守氨基酸残基缺失,同源性甚低.如泥生绿菌,好热性硫磺细菌cL.,枯草芽孢杆菌中分别有11,5,9个活性位点的保守氨基酸残基被其它氨基酸所取代;枯草芽孢杆菌RLP与I,II,III型仅有23%,23%,30%的序列同源性(Ashida等2005).实际上,在许多细菌中同时存在编码I型和Ⅱ型Rubisco的结构基因,但在正常情况下两者并不同时表达(English等1992;Karlin和Mrazek 2000).那不勒斯硫杆菌在rbcL,突变的情况下, rbcL,,可表达生成II型Rubisco,但菌体必须在高浓度的CO,下才能生长良好(Baker等1998).海洋氢弧菌MH一110含有3个拷贝的Rubisco基因(CbbLS—和CbbLS-2属于I型,CbbM属于II型).Y oshizawa等(2004)研究证实海洋氢弧菌MH一110在不同浓度的CO,条件下,三者以不同的组合形式进行表达.脱氮硫杆菌在厌氧条件下以硝酸盐作为电子受体能同时表达生成I,II2种类型Rubisco.最近,Carr~一Mlouka等(2006)报道,在世界范围内广泛引起水华的铜绿微囊藻PCC7806 (MicrocystisaeruginosaPCC7806)细胞内同时存在I,IV型Rubisco.沼泽红假单胞菌(Rhodopseudo. monaspalustris)除了含有I,II型Rubisco,还同时存在2类不同的RLP(Larimer等2004).这些发现导致不同类型Rubisco的共存问题变得更加复杂,这对研究Rubisco的进化可能有意义.4Rubisco的性质与一般的酶相比,Rubisco具有2个显着的特征.一是非专一性,即Rubisco既能催化羧化反应,也能催化加氧反应,具有双功能性;二是低效性,即Rubisco的催化效率较一般酶低,是由于Rubisco酶转换数低(真核生物的Rubiscok约为3~5S～,来源于不同生长温度的植物Rubiscok略有不同),催化效率有限(Watson和Tabita1999;Sage2002~Ashida等2005).4.1热稳定性Rubisco有一定的热稳定性,但不同来源的Rubisco的热稳定性存在较大差异.水稻Rubisco在50℃保温7min达到最大活力,随后迅速下降,30min后酶活性下降至40%;烟草Rubisco在50℃保温20min达最大活力,30min后活力还维持在98%左右;菠菜Rubisco氨甲酰化后经60℃的10mmo1.LDTr处理1h活力还维持50%(陈为钧等1999).在嗜热古生菌如菌中,Rubisco的热稳定性极高.Tk.Rubisco在30—110℃范围内均能有效完成十聚体结构的组装(Maeda等2002);在40～100℃范围内能够保持有效的羧化酶活性,且活性随温度(40-90℃)的升高而上升;在80℃保温15h活力仍维持50%(Ezaki等1999).Maeda等(2002)采用定点突变(E63S,R66S,D69S)的方法,进一步研究证实Tk—RubiSCO耐热性依赖于特殊的五角形晶体结构(pentagonalstructure),此种结构的特点是二聚体相互接触紧密,接触面上的氨基酸残基之间存在离子间的相互作用,并形成8对离子键.同时,低聚状态对耐热性的维持也有影响.Tk.Rubisco的十聚体结构提高了蛋白质的变性温度,从而进一步提高了Tk菌适应高温的能力.4.2酶促反应动力学参数一般而言,C植物及景天科酸代谢植物Rubisco的Kin(CO)在12～26 ~tmol?L～,C4植物Rubisco的Kin(CO2)为28～63 ∞1.L-(Chen等2002).但不同类型植物Rubisco Kin(CO2)仍存在差异,如水稻RubiscoKin(CO2)一般为12lxmo1.L～,而喜温红藻(Galdieriapartita)的K(co2)仅为6.6~tmol?L一,这种喜温红藻366植物生理学通讯第43卷第2期,2007年4月RubiscoK~(CO)值在当时被认为是所有Rubisco中最小的(Uemura等1997).Ezaki等(1999)研究菌的结果表明,Tk—RubiSCO具有更强的羧化能力,在CO,饱和,90℃高温条件下,Tk.Rubisco同化CO,的速率可达19.8x10.nmo1.mg(酶蛋白)? min～.Rubisco羧化与氧化反应的活力比按/V o=()/(V oKc)([CO:】/【O2】)计算.其中,,分别表示羧化和氧化反应的最大反应速率;&,K. 分别代表羧化和氧化反应的米氏常数;【CO】和【O】为气体浓度;(c.)/(.c)称特性因子(specificityfactor),即羧化/氧化值(Q值)(Uemura等1997;Parry等2003).一定种类Rubisco的Q值为一常数,但不同来源的RubiscoQ值有较大差异(表1).绿色高等植物Rubisco的Q值一般在90～95之间;蓝藻的Q值也有35～40;细菌的Q值一般在9～45之间.从喜温红藻中发现的I型RubiscoQ值高达238(25℃),是高等植物Q值的2.5倍,说明其具有极强的固定CO:的能力(Uemura等1997).更为重要的是喜温红藻本身就属于植物,这对从亚基水平上改变Rubisco动力学性质及Q值,提高植物光合效率有重大意义. Tk—Rubisco存在更高的Q值且随温度的升高而上升,在50℃时为70,70℃时上升至250,90℃时则达到最大值310(Ezaki等1999).与此相反,喜温红藻的RubiscoQ值随着温度的升高反而降低(Uemura等1997).Watson和Tabita(1999)测定詹氏甲烷球菌Q值的结果表明,其羧化能力极差,Q值只有0.5,是所有Rubisco中Q值最低的.5Rubisco的功能已经证实,O是羧化酶反应的竞争性抑制剂;同样CO是加氧酶反应的竞争性抑制剂.因此,Rubisco处于光合碳还原(光合作用)和光合碳氧化(光呼吸)2个方向相反但又相互连锁的循环反应的交叉点上.当co#o:的浓度比值较高时,促进Rubisco催化的羧化反应.羧化反应一般分为烯醇化,羧化,水合,C—C键断裂,质子化5个阶段(Lundqvist和Schneider1991;Li等2005). Rubisco催化游离的CO,共价结合到底物RuBP上,进而生成两分子的3一磷酸甘油酸(3一phosphoglyc—ericacid,PGA),推动C3-PCR循环.当CO2/O2的浓度比值较低时,促进Rubisco催化的加氧反应,RuBP即裂解产生一分子的磷酸乙醇酸和一分子的PGA,前者进一步分解成乙醇酸和磷酸,参与绿色植物的光呼吸循环.研究初期,人们认为Rubisco的功能主要集中在光合碳同化及光呼吸过程中.然而随着各种不同类型RubiSCO的陆续发现和研究的深入, Rubisco的功能呈现出多样化(表1).詹氏甲烷球菌及其它产甲烷古生菌中的III型RubiSCO参与PRPP—RuBP—PGA途径(Ashida等称之为RuPP通路) (Finn和Tabita2004;Ashida等2005).在这一途径中RuBP的合成前体是1一焦磷酸.5一磷酸.核糖(5一phospho—D—ribose一1一pyrophosphate,PRPP),脱磷酸后经NAD氧化生成RuBP,接着在Rubisco的催化下与CO,结合生成PGA.RLP一般无羧化酶活性,但它能催化2,3一二酮基一5一甲硫戊基.1一磷酸(2,3一diketo一5一methythio—pentyl一1一phosphate,DK—MTP.1一P)的烯醇化反应,与硫代谢密切相关(Ashida等2003;Li等2005;Carr6一Mlouka等2006).枯草芽孢杆菌RLP在腺苷蛋氨酸补救合成途径中作为DK—MTP一1一P烯醇化酶发挥作用(Ashida等2003,2005).在其r/p突变株中导入深红红螺菌的II型Rubisco后,该菌株竟然可恢复生长,说明光合类型的Rubisco可能仍然保持着作为一腺苷蛋氨酸补救合成途径中DK—MTP.1一P烯醇化酶的功能.也有人认为是由于RubiSCO对底物存在一定范围的适应(Li等2005).绿色硫细菌RLP与硫代谢和氧化应激(oxidativestress)有关(Hanson和Tabita2001).铜绿微囊藻PCC7806RLP在硫代谢过程中也起一定作用.半定量RT—PCR的结果显示,在硫缺乏的情况下,吐Ⅳ的转录是正常状况(硫充足)下的22倍(Carte—Mlouka等2006).Rubisco作为植物叶中的主要含氮有机物之一,必然与植物对氮的吸收,利用及循环有关.研究不同种类C植物氮利用的情况表明,较高的Rubisco,是NADP苹果酸酶类型比NAD苹果酸酶类型具有更高的氮利用率的主要原因(Ghannoum等2005).Rubisco与植物雄性不育也有一定的联系.刘祚昌等(1983)研究玉米,高粱,水稻,小植物生理学通讯第43卷第2期,2007年4月367 麦和烟草等作物的细胞质雄性不育系Rubisco的结果表明,其活性均高于相应的保持系.水稻光周期敏感核不育农垦58S经长光照及红光间断暗周期处理表现为雄性不育,其Rubisco的活性明显低于可育状态(夏凯等1989).Schwender等(2004)最新发现甘蓝型油菜(Brassicanapus)中Rubisco参与植物中碳转化为油的代谢通道,此通道可导致碳作为油贮存的效率达到最大.6结语有人曾将红藻中高效率Rubisco酶的小亚基基因转入植物叶绿体中并得到表达,但表达出的小亚基却不能与植物本身的大亚基组装成全酶(Whitney和Andrews2001).这可能是由于小亚基存在特异性的修饰,或者协助组装的分子伴侣无法识别异源亚基.要解决上述问题尚待深入研究Rubisco的组装机制.众多的研究表明,低等藻类和古生菌体内存在不同类型Rubisco.Lonsdale等(1983)从玉米(Zeamays)线粒体中分离到一个与Rubisco大亚基同源的基因,此基因在大肠杆菌中表达合成的分子量为2lkDa的蛋白能与小麦的Rubisco抗体反应.如何科学地解释Rubisco的共存现象,共存现象与Rubisco的分子进化是否存在某种内在联系,植物体内是否也存在多拷贝的Rubisco基因,均待进一步研究.微生物Rubisco的研究大大扩展了人们对Rubisco类型及功能的认识.序列同源性比较分析的结果显示,III型和Ⅳ型Rubisco比I型及II型更原始;枯草芽孢杆菌及铜绿微囊藻PCC7806RLP功能及突变株的研究结果表明,m型与Ⅳ型Rubisco中可能存在Rubisco的原始形式,或者说它们与Rubisco的原始形式在结构及功能上有更多的相似性.根据研究枯草芽孢杆菌RLP的结果,Ashida等(2003,2005)提出一条Rubisco可能的进化路线,认为光合类型Rubisco正是由枯草芽孢杆菌RLP演变而来的.以上研究和发现并未完全解决Rubisco的分子进化问题,但却为人们指明了方向,即通过研究和分析微生物Rubisco的结构和功能有可能部分或完全揭示Rubisco的分子进化历程.参考文献陈为钧,赵贵文,顾月华(1999).RubisCO的研究进展.生物化学与生物物理进展,26(5):433-.-436刘祚昌,李继耕,罗会馨,陈福太(1983).二磷酸核酮糖羧化酶与细胞质雄性不育性的研究.遗传,10(1):362吕红,周集体,王竞,安利佳(2003).原核生物Rubisco的研究进展.微生物学通报,30(2):82—85夏凯,肖翊华,刘文芳(1989).湖北光敏感核不育水稻光敏感期叶片中ATP含量与RuBPcase活力的分析.杂交水稻,(4): 412.30熊晓然,陈蔚梅,冯胜彦,郭明雄,艾建宇,吴斌(2003).植物Rubisco 活性中心的模拟分析.中国生物化学与分子生物,19(4):493--498AshidaH,DanchinA,Y okotaA(2005).Wasphotosynthetic RuBisCOrecruitedbyacquisitiveevolutionfromRuBisCO—likeproteinsinvolvedinsulfurmetabolism?ResMicrobiol,l56:6lll8AshidaH,SaitoY,KojimaC,KobayashiK,OgasawaraN,Y okotaA(2003).AfunctionallinkbetweenRuBisCO—likeproton ofBacillusandphot0syntheticRuBisCo.Science,302:286~290BakerSH,JinS,AldrichHC,HowardGT,ShivelyJM(1998). 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4-17 二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubisco)羧化活性的测定核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(EC 4.1.1.39) 是光合作用中的一个关键酶，它在Calvin循环中催化CO2的固定，生成二分子的3-磷酸甘油酸(3-PGA),同时它是一个双功能酶，又能催化将O2加在核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)的C-2位置上生成一分子的磷酸乙醇酸和一分子的3-磷酸甘油酸，这两个反应的速率由O2和CO2浓度调节。

Rubisco羧化活性的测定一般通过测定从NaH14CO3生成酸稳定的[1-14C]-3-PGA的速率来进行, 也可以用酶偶联法将3-PGA的变化转变为NADH 来测定。

其原理如下：RuBP + CO2 + H2O Rubisco+Mg2+ 2 ×3-磷酸甘油酸3-磷酸甘油酸+ ATP 3-磷酸甘油酸激酶+ Mg2+1,3-二磷酸甘油酸+ ADP1,3-二磷酸甘油酸+ NADH 3-磷酸甘油醛脱氢酶3-磷酸甘油醛+ NAD+ + H+ + PO4-3从以上反应计算一分子RuBP的羧化就有两分子的NADH被氧化，这样就可以用紫外分光光度计在340 nm测NADH的减少来计算酶活力。

1仪器设备液体闪烁计数器、烘箱、水浴锅、研钵或组织捣碎机、分光光度计等2 操作方法2.1 Rubisco的提取及纯化2.1.1植物粗提液的制备称约X g叶片加入X ml预冷到4℃提取缓冲液(Tris-HCl pH 7.8 100 mmol/L, KCl 20 mmol/L, EDTA 1 mmol/L)中匀浆，15000g离心10 min取上清液备用。

2.1.2 酶的纯化将上述得到的粗提液用40%饱和度的硫酸铵进行分部，8000 g, 在4℃冷冻离心20min。

然后取上清液加硫酸铵至70%的饱和度，10000g，冷冻离心20 min后取沉淀，用少量重悬缓冲液(25 mmol/LTris-HCl pH7.8, 1 mmol/L EDTA, 5 mmol/L 巯基乙醇，20 mmol/L KCl)溶解，再经Sephadex G-25脱盐后上DEAE (DE52)柱，用含0-0.5 mol/L NaCl的重悬缓冲液进行梯度洗脱，收集0.25 mol/L NaCl分部。

第四章光合作用（一）填空1．绿色植物和光合细菌都能利用光能将合成有机物，它们都属于光养生物。

从广义上讲，所谓光合作用，是指光养生物利用把合成有机物的过程。

（CO2，光能，CO2）2．光合作用本质上是一个氧化还原过程。

其中是氧化剂，是还原剂，作为CO2还原的氢的供体。

（CO2，H2O）3．1940年S.Ruben等发现当标记物为H218O时，植物光合作用释放的Ｏ2是，而标记物为C18O2时，在短期内释放的Ｏ2则是。

这清楚地指出光合作用中释放的Ｏ2来自于。

（18O2，Ｏ2，H2O）4．1939年Robert.Hill发现在分离的叶绿体悬浮液中加入适当的电子受体，如铁氰化钾或草酸铁等，照光时可使水分解而释放氧气，这一现象称为，其中的电子受体被称为。

（希尔反应，希尔氧化剂）5．1954年美国科学家，当向体系中供给无机磷、ADP和NADP时，体系中就会有和两种高能物质的产生。

同时发现，只要供给了这两种高能物质，即使在黑暗中，叶绿体也可将转变为糖。

所以这两种高能物质被称为“”。

(ATP，NADPH，CO2，同化力)6．20世纪初人们研究光强、温度和CO2浓度对光合作用影响时发现，在弱光下增加光强能提高光合速率，但当光强增加到一定值时，再增加光强则不再提高光合速率。

这时要提高温度或CO2浓度才能提高光合速率。

用藻类进行闪光试验，发现在光能量相同的前提下闪光照射的光合效率是连续光下的200%～400%。

这些实验表明光合作用可以分为需光的和不需光的两个阶段。

(光反应，暗反应)7．由于ATP和NADPH是光能转化的产物，具有在黑暗中使光合作用将CO2转变为有机物的能力，所以被称为“”。

光反应的实质在于产生“”去推动暗反应的进行，而暗反应的实质在于利用“”将转化为有机碳(CH2O)。

（同化力，同化力，同化力，CO2）8．量子产额的倒数称为，即光合作用中释放1分子氧和还原1分子二氧化碳所需吸收的。

(量子需要量，光量子数)9．类囊体膜上主要含有四类蛋白复合体，即、、、和。

实验⼋Rubisco活性的测定RuBP羧化酶活性测定⼀、实验⽬的了解核酮糖-1,5-⼆磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）在光合作⽤中的作⽤，掌握⽐⾊法测定Rubisco的原理和⽅法。

⼆、实验原理RuBP羧化酶是⼀种双功能酶，是光合作⽤中的关键酶，是⼀个双功能酶，即可催化RuBP的羧化反应，⼜可催化加氧反应，故全名为RuBP羧化酶/加氧酶（RuBP carboxylase/oxygenase,简称Rubisco），普遍存在于⾃养⽣物中，在C3植物中含量较为丰富。

在卡尔⽂循环中，Rubisco 催化CO2的固定，⽣成2分⼦的3-磷酸⽢油酸；同时⼜能催化将氧⽓加在核酮糖-1,5-⼆磷酸的C2位置上⽣成1分⼦的磷酸⼄醇胺和1分⼦的3-磷酸⽢油酸，这两个反应的速率由细胞内O2和CO2的相对浓度调节。

Rubisco催化RuBP与⼀份⼦CO2结合，产⽣两分⼦PGA，PGA在3-磷酸⽢油酸激酶和3-磷酸⽢油醛脱氢酶的作⽤下，产⽣3-磷酸⽢油醛，并使还原型辅酶I（NADH）氧化。

反应如下：RuBP+CO2+H2O----2PGA3-PGA+ATP------1,3-⼆磷酸⽢油酸+ADP1,3-⼆磷酸⽢酸+NADP+H+ -------3-磷酸⽢油醛+NAD+通过上述偶联反应，1分⼦的CO2被固定，2分⼦NADH被氧化。

因此，从340nm吸光度的变化可计算NADP的减少量来计算酶活⼒。

三、实验材料与试剂1.实验材料：⼩麦和⽟⽶2.试剂药品：Rubisco提取介质；反应体系；ATP溶液；磷酸肌酸溶液；磷酸肌酸激酶溶液；3-磷酸⽢油酸激酶溶液；3-磷酸⽢油醛脱氢酶溶液；RuBP溶液；ATP；NADH 溶液。

四、实验仪器及⽤品紫外分光光度计，冷冻离⼼机，研钵，移液枪，剪⼑，胶头滴管等。

五、实验⽅法与步骤1.酶粗提液的制备取新鲜的⽟⽶与⼩麦叶⽚各0.1g于预冷的研钵中，加⼊1ml的酶提取液充分研磨，转⼊2ml的离⼼管中，12000g 4℃离⼼10min，弃沉淀，上清液即为粗酶提取液。