二磷酸核酮糖羧化酶-加氧酶(Rubisco)活性检测试剂盒说明书 微量法

核酮糖1,5-二磷酸羧化酶羧化活性的测定一、实验原理核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶是光合作用中一个关键酶，它在Calvin 循环中催化中催化CO2的固定，生成2分子的3-磷酸甘油酸(3-PGA)，同时它是一个双功能酶，又能催化将O2加在核桐糖-1,5-二磷酸(RuBP)上生成1分子的磷酸乙醇酸和1分子的PGA ，这两个反应的速率由O2和CO2的浓度调节[1]。

分光光度酶偶联法是根据RuBP 羧化酶催化RuBP 与CO2反应产生的磷酸甘油酸与NADH 的氧化作用相偶联的原理设计的。

当加入ATP 及NADH 后，NADH 在PGK 和GAPDH 的催化下氧化为NAD+，每羧化l mol RuBP 有2 mo1 NADH 被氧化，根据在波长340 nm 处光密度的变化，可测知NADH 的数量，从而算出同化CO2的值。

Rubisco 羧化活性的测定可用酶偶联法将3-PGA 的变化转换为NADH 的变化来测定。

RuBP+CO2+H2O −−−−→−+2Mg RuBPC ，2(3-PGA)3-PGA+ATP −−−−−→−－磷酸甘油激酶31,3-二磷酸甘油酸+ADP 1,3-二磷酸甘油酸+NADH −−−−−−→−－磷酸脱氢酶甘油醛－33-磷酸甘油醛+NAD++PO43+ 二、实验仪器及材料 2.1实验仪器研钵、分光光度计、秒表、比色杯、冷冻离心机 2.2实验材料小麦叶片 三、实验步骤1.核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶活性额测定1.1称取0.1 g 新鲜叶片，放于已经预冷的研钵中。

1.2加入1 mL ，4℃提取缓冲液（50 mM Tricine-NaOH pH 7.9， 0.1% PVP-40, 5 mM MgCl2）冰上研磨，（缓冲液分3次加入，第一次0.5ml ，剩下两次分别0.25ml 将研钵冲洗干净），将研好的样品装入1.5ml 的离心管中，放于冰盒中。

12000 g ，4℃，离心10 min 。

RuBP羧化酶是一种双功能酶，即可催化RuBP的羧化反应，又可催化加氧反应，故齐全名为RuBP羧化酶/加氧酶（RuBP carboxylase/oxygenase,简称Rubisco）。

Rubisco 普遍存在于自养生物中，在C3植物中含量较为丰富，占叶可溶性蛋白质的50%以上，是自然界最丰富的一种蛋白质。

在叶绿素间质中浓度可达300mg/ml。

同时，Rubisco 也是高等植物中有机氮的重要贮藏形式。

通过本实验进一步掌握光合作用中的关键酶Rubisco的性质，用分光光度法测定Rubisco的羧化活性。

【实验原理】Rubisco催化RuBP与一份子CO2结合，产生两分子PGA，PGA在3-磷酸甘油酸激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下，产生3-磷酸甘油醛，并使还原型辅酶I（NADH）氧化，反应如下：RuBP+CO2+H2O----2PGA3-PGA+ATP------1,3-二磷酸甘油酸+ADP1,3-二磷酸甘酸+NADP+H+ -------3-磷酸甘油醛+NAD+通过上述偶联反应，可讲3-PGA的变化转变为NADP的变化来测定，因此可用紫外分光光度计在340nm处测定NADP的减少量来计算酶活力。

【实验材料】植物叶片【仪器设备及用品】紫外分光光度计，冷冻离心机，匀浆器或研钵，移液管等【试剂药品】1.RuBPCase提取介质：40mmol/L(PH7.6)Tris-HCl缓冲液，内含10mmol/LMgCl2、0.25mmol/LEDTA和5.0mmol/L谷胱甘肽。

2.反应介质：0.1mmol/LTris-HCl缓冲液（PH7.8），内含12mmol/LMgCl2和0.4mmol/LEDTA.3.50mmol/LATP溶液4.50mmol/L磷酸肌酸（Cr~P）溶液5.0.2mmol/LNaHCO3溶液6．160U/L磷酸肌酸激酶溶液7．25mmol/LRuBP溶液8．160U/L3-磷酸甘油醛脱氢酶溶液9．160U/L3-磷酸甘油酸激酶溶液10. 5mmol/LNADH溶液附注：U/L表示每升酶制剂含有多少酶活力单位。

RubiscoRubisco,即核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulosebisphosphate carboxylase oxygenase).是光合作用C3碳反应中重要的羧化酶,也是光呼吸中不可缺少的加氧酶.1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase ，通常简写为RuBisCO ）是一种酶(EC 4.1.1.39)，分子量约为550kD ，由8个大亚基和8个小亚基组成，是光合作用中决定碳同化速率的关键酶。

它在光合作用中卡尔文循环里催化第一个主要的碳固定反应，将大气中游离的二氧化碳转化为生物体内储能分子，比如蔗糖分子。

1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶可以催化1,5-二磷酸核酮糖与二氧化碳的羧化反应或与氧气的氧化反应。

同时RuBisCO 也能使RuBP 进入光呼吸途径。

同时，它的活性也由光照影响，在暗处，rubisco 的活性受到抑制，这也是为什么在黑暗时，碳反应难以进行的原因。

1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶在生物学上有重要的意义，因为它所催化的反应是无机态的碳进入生物圈的主要途径。

1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶是植物叶片中含量最丰富的蛋白质，也可能是地球上含量最多的蛋白质。

鉴于它对生物圈的重要性，人们正在努力改进自然界中的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的功能。

Rubinsco 是植物C3途径中的关键酶，同时也是植物光呼吸的关键酶。

Rubinsco 叶绿体基质中催化CO2与Rubp 即1,5-二磷酸核酮糖结合生成2分子3-磷酸甘油酸，进而发生一系列反应，将ATP 中的化学能转化到葡萄糖中。

核酮糖二磷酸缩化酶在植物机体代谢过程中居于中心地位，但它却是效率奇低的操作员。

让我们作一个显而易见的比较：典型的酶分子1秒钟可催化1000个底物分子，但Rubisco 每秒钟仅固定3分子CO2。

植物细胞为弥补低效的缺陷而产生大量的Rubisco 。

核酮糖1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)检测试剂盒(RuBP比色法)简介：植物光合作用的中，C3途径是所有植物共有的光合碳同化途径，核酮糖1,5-二磷酸羧化酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase，Rubisco或RuBPCo或RuBPCase)是一种酶(EC4.1.1.39)，又称1,5-二磷酸核酮糖羧化酶，分子量约为53kD，由8个大亚基和8个小亚基组成，是光合作用中决定碳同化速率的关键酶，该酶活力的大小反应了植物光合能力的强弱，RUBP羧化酶是光合作用碳代谢中的重要的调节酶，主要存在于叶绿体的可溶部分，总量占叶绿体可溶蛋白50-60%。

在植物叶片发育过程中，此酶活性呈规律性的变化。

Leagene核酮糖1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)检测试剂盒(RuBP比色法)检测原理是在Rubisco催化核酮糖1,5-二磷酸(RuBP)，1分子后者与1分子的CO2结合，产生2分子的3-磷酸甘油酸(PGA)，后者通过3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛-1,3-二磷酸，并使NADH氧化。

因此1分子CO2被固定，伴随2分子NADH氧化，由NADH氧化的量就可计算Rubisco的活性，通过分光光度比色法(分光光度计)测定340处吸光度的变化，计算出NADH的消耗速率进一步推算出核酮糖1,5-二磷酸羧化酶活性水平。

该试剂盒主要用于检测植物样本、血清等中核酮糖1,5-二磷酸羧化酶活性，25T规格的试剂盒可检测23-24个样本。

组成：编号名称TE044925TStorage试剂(A):Rubisco Lysis buffer250ml4℃试剂(B):Rubisco Assay buffer15ml4℃试剂(C):ATP Solution3ml-20℃试剂(D):CP Solution 1.5ml-20℃试剂(E):CPK Solution1ml-20℃试剂(F):PGK Solution1ml-20℃试剂(G):GAPD Solution1ml-20℃试剂(H):NADH1支-20℃试剂(I):碱性基液3ml RT 使用说明书1份自备材料：1、研钵或匀浆器2、离心管3、低温离心机4、恒温箱或水浴锅5、比色杯6、分光光度计操作步骤(仅供参考)：1、准备样品：①植物样品：取植物组织清洗干净，切碎，按植物组织：Rubisco Lysis buffer按一定比例，加入预冷的Rubisco Lysis buffer，冰浴情况下充分匀浆或研磨。

RuBP羧化酶是一种双功能酶，即可催化RuBP的羧化反应，又可催化加氧反应，故齐全名为RuBP羧化酶/加氧酶（RuBP c arboxy l ase/oxy genas e,简称Rubisco）。

Rubisco 普遍存在于自养生物中，在C3植物中含量较为丰富，占叶可溶性蛋白质的50%以上，是自然界最丰富的一种蛋白质。

在叶绿素间质中浓度可达300mg/ml。

同时，Rubisco 也是高等植物中有机氮的重要贮藏形式。

通过本实验进一步掌握光合作用中的关键酶Rubisco的性质，用分光光度法测定Rubisco的羧化活性。

【实验原理】Rubisco催化RuBP与一份子CO2结合，产生两分子PGA，PGA在3-磷酸甘油酸激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下，产生3-磷酸甘油醛，并使还原型辅酶I（NADH）氧化，反应如下：RuBP+CO2+H2O----2PGA3-PGA+ATP------1,3-二磷酸甘油酸+ADP1,3-二磷酸甘酸+NADP+H+ -------3-磷酸甘油醛+NAD+通过上述偶联反应，可讲3-PGA的变化转变为NADP的变化来测定，因此可用紫外分光光度计在340nm处测定NADP的减少量来计算酶活力。

【实验材料】植物叶片【仪器设备及用品】紫外分光光度计，冷冻离心机，匀浆器或研钵，移液管等【试剂药品】1.RuBPCase提取介质：40mmol/L(PH7.6)Tris-HCl缓冲液，内含10mmol/LMgCl2、0.25mmol/LEDTA和5.0mmol/L谷胱甘肽。

2.反应介质：0.1mmol/LTris-HCl缓冲液（PH7.8），内含12mmol/LMgCl2和0.4mmol/LEDTA.3.50mmol/LATP溶液4.50mmol/L磷酸肌酸（Cr~P）溶液5.0.2mmol/LNaHCO3溶液6．160U/L磷酸肌酸激酶溶液7．25mmol/LRuBP溶液8．160U/L3-磷酸甘油醛脱氢酶溶液9．160U/L3-磷酸甘油酸激酶溶液10. 5mmol/LNADH溶液附注：U/L表示每升酶制剂含有多少酶活力单位。

RuBP羧化酶活性测定一、实验目的了解核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）在光合作用中的作用，掌握比色法测定Rubisco的原理和方法。

二、实验原理RuBP羧化酶是一种双功能酶，是光合作用中的关键酶，是一个双功能酶，即可催化RuBP的羧化反应，又可催化加氧反应，故全名为RuBP羧化酶/加氧酶（RuBP carboxylase/oxygenase,简称Rubisco），普遍存在于自养生物中，在C3植物中含量较为丰富。

在卡尔文循环中，Rubisco 催化CO2的固定，生成2分子的3-磷酸甘油酸；同时又能催化将氧气加在核酮糖-1,5-二磷酸的C2位置上生成1分子的磷酸乙醇胺和1分子的3-磷酸甘油酸，这两个反应的速率由细胞内O2和CO2的相对浓度调节。

Rubisco催化RuBP与一份子CO2结合，产生两分子PGA，PGA在3-磷酸甘油酸激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下，产生3-磷酸甘油醛，并使还原型辅酶I（NADH）氧化。

反应如下：RuBP+CO2+H2O----2PGA3-PGA+ATP------1,3-二磷酸甘油酸+ADP1,3-二磷酸甘酸+NADP+H+ -------3-磷酸甘油醛+NAD+通过上述偶联反应，1分子的CO2被固定，2分子NADH被氧化。

因此，从340nm吸光度的变化可计算NADP的减少量来计算酶活力。

三、实验材料与试剂1.实验材料：小麦和玉米2.试剂药品：Rubisco提取介质；反应体系；ATP溶液；磷酸肌酸溶液；磷酸肌酸激酶溶液；3-磷酸甘油酸激酶溶液；3-磷酸甘油醛脱氢酶溶液；RuBP溶液；ATP；NADH 溶液。

四、实验仪器及用品紫外分光光度计，冷冻离心机，研钵，移液枪，剪刀，胶头滴管等。

五、实验方法与步骤1.酶粗提液的制备取新鲜的玉米与小麦叶片各0.1g于预冷的研钵中，加入1ml的酶提取液充分研磨，转入2ml的离心管中，12000g 4℃离心10min，弃沉淀，上清液即为粗酶提取液。

1,5-二磷酸羧化酶／加氧酶（Rubisco）植物生理学通讯第43卷第2期,2007年4月363核酮糖.1,5.二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)梅杨,李海蓝,谢晋,罗红艺华中师范大学生命科学学院,武汉430079Ribulose-I,5-bisphosphateCarboxylase/oxygenase(Rubisco)MEIY ang,LIHai—Lan,XIEJin,LUOHong—YiCollegeofLifeSciences,CentralChinaNormaliVPl魄Wuhan430079,China提要:文章就核酮糖一1,5.二磷酸羧化酶,加氧酶(Rubisco)的分布,结构,性质,分类与功能的研究进展作了介绍.关键词:核酮糖一1,5一二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco);Rubisco类似蛋白(RLP);羧化/氧化值;热稳定性;分类核酮糖一1,5一二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose一1,5一bisphosphatecarboxylase/oxygenase,Rubisco)是植物光合作用过程中固定CO,的关键酶,同时也参与植物的光呼吸代谢途径,消耗植物光合作用合成的有机物,由此造成的净光合效率损失高达50%(Lundqvist和Schneider1991;熊晓然等2003;Ashida等2005).因此,研究Rubisco对提高植物的光合作用效率有重要意义.自从1953年Calvin等在研究光合碳循环过程中证实其存在至今,有关Rubisco的一系列问题不断得到阐明,人们对其性质,结构,类型和功能等诸多方面有了更深入的了解,这方面的研究己取得了较大进展,本文就此作介绍.1Rubisco的分布与定位Rubisco广泛分布于具光合功能的细胞器中.它是一个含量很丰富的酶,据估计全世界Rubisco 的量约有4×10吨.Rubisco在C植物中主要定位于叶肉细胞叶绿体问质中,在基粒片层上也有少量分布;在C植物中则定位于维管束鞘细胞中的叶绿体问质内.低等藻类的Rubisco主要定位在淀粉核上.许多化能自养细菌和蓝藻中存在多角形细胞内含物,其中含有大量的羧化酶,称之为羧基化小体.羧基化小体最初是从氧化硫细菌中分离出来的,并且含有大量的Rubisco.有研究表明,羧基化小体是原核生物体内储存Rubisco的重要场所,能够协助Rubisco在低浓度的CO,条件下完成羧化.那不勒斯硫杆菌(Thi0baci,,U neapolitanus)的Rubisco缺陷菌株无羧基化小体的形成,且必须在高浓度的CO,下才能生长(Baker等1998).海洋氢弧菌(Hydrogenovibriomarinus)MH一110在CO,浓度低于0.15%时就会形成羧基化小体(Y oshizawa等2004).2Rubisco的结构采用x射线晶体衍射技术,人们解析了不同来源的Rubisco的晶体结构,包括烟草(Nicotiana tabacum),菠菜(Spinaciaoleracea),深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum),莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii),蓝藻聚球藻(y,zcDcDcc"PCC 6301),喜温红藻(Galdieriapartite),绿色硫细菌(chlorobiumtepidum),超耐热原始菌(菌, ThermococcuskodakaraensisKOD1)等(Kitano等2001;Parry等2003;Li等2005).Rubisco一般由多个大亚基(LSU)和小亚基(ssu)组成,其中大亚基的分子量为50～55kDa,小亚基为1218kDa(Ashida等2005).大亚基具有催化功能,小亚基仅具有调节作用.迄今的研究认为,Rubisco的大亚基由N,C两个结构域组成.N结构域从N末端开始,包括137个氨基酸,其中含有5股D折叠.C结构域中含有丰富的0c螺旋,其中以0c/D桶状结构域(al Dbarreldomain)最引人注目.它包括8个0c螺旋和8个D折叠,彼此连接成8个环.一个大亚基收稿2006.11—20修定2007—03一l2资助华中师范大学精品课程建设项目.通讯作者(E—mail:******************.ca:Tel:************).364植物生理学通讯第43卷第2期,2007年4月的羧基末端为另一个大亚基氨基末端部分覆盖,形成漏滴状的活性中心,Mg参与其中.Mg与亚基中的3个氨基酸残基所含有的氧原子发生作用,它们分别是氨甲酰化的Lys,侧链Asp3和Glulq4(Lundqvist和Schneider1991).C端结构域同时含有一个特征性的突环(Lo0p6).Loop6影响酶与气体分子(包括CO和O)的亲和性,一系列发生在环内的突变均能影响酶的羧化/氧化值(Q 值);在形成烯醇化中间产物的过程中,Loop6也起关键性的作用(Parry等2003).Loop6同时还影响酶活性状态的形成与维持.活性中心的模拟分析表明,Rubisco是否处于活性状态与活性中心(Lysl75,Lys201)和Loop6(Lys334)的3个Lys残基密切相关(熊晓然等2003).小亚基远离活性中心,其含有4个反向平行的p折叠和2个0c螺旋,p折叠和0c螺旋的核心含有疏水的氨基酸残基及与大小亚基相互作用有关的保守氨基酸残基.小亚基能促进CO,与Mg对酶的活化,维持和稳定酶的活化构象.Spreitzer (2003)认为,小亚基可能在进化过程中扮演聚集大亚基活性位点的角色,小亚基可能有更多特异性功能.3Rubisco的类型根据Rubisco大亚基氨基酸序列同源性及空间结构的相似性,可以将其分为4类,即I,II,III,IV型(表1).I型主宴存在于能够进行光合作用的有机体内,如高等植物,真核藻类,蓝藻,光能及化能自养细菌及其它一些原核生物,它由8个大亚基和8个小亚基组成,呈LS的结构.Tabita(1995)分析不同的I型Rubisco结构后,又将其分为"Green—like"和"Red—like"2类,并进一步将其划分为A,B,C及D4个亚类.II型Rubisco由2罐个大亚基组成,呈L的结构,其分子量为110-450kDa,主要存在于一些光能及化能合成细菌,海产甲藻如共生甲藻(SymbiodiniumSpp.),膝钩藻(Gonyaulaxpolyedra)等中(Rowan等1996;Nassoury等2001).尽管I型与II型Rubisco在活性位点上的氨基酸残基高度保守,但II型与I型的大亚基的同源性仍很低,仅为28%(Kitano等2001;Liao等2004).III型也仅由大亚基组成,呈L结构,存在于某些嗜热古生菌如菌,詹氏甲烷球菌等中(Klenk等1997;Watson和Tabita1999;Kitano等2001).有人研究Tk-Rubisco的结果表明,它是由大亚基组表1不同来源的Rubisco及其羧化/氧化值,结构和功能代表植物;一表示暂无相关数据.好热性硫磺细菌含有2类Rubisco:rbcL—l和rbcL.2(Karlin和Mrazek2000):超耐热原始菌先前报道称为PyrococcuskodakaraensisKODI(Kitano等2001).植物生理学通讯第43卷第2期,2007年4月365成的(L)的十聚体,与菠菜中的I型Rubisco有36%的同源性,与深红红螺菌中的Ⅱ型Rubisco有30%的同源性(Kitano等2001);分析詹氏甲烷球菌Rubisco的序列表明,它与蓝藻中的聚球藻I型Rubisco有41%的同源性,与深红红螺菌中的II型Rubisco有33%的同源性(Watson和Tabita1999).尽管以上三类Rubisco相互之间的同源性较低,但已知的Rubisco参与羧化或氧化核酮糖一1,5一二磷酸(ribulose一1,5一bisphosphate,RuBP)过程的所有保守氨基酸残基在I,II和III型中都存在,除了Ⅲ型中Phe.∞被其它氨基酸所取代(Ashida等2005).IV型又称为Rubisco类似蛋白(rubisco—like—protein,RLP),存在于非光合细菌,部分不依赖卡尔文循环的光合细菌和古生菌如绿色硫细菌,好热性硫磺细菌rbcL.,泥生绿菌,枯草芽孢杆菌等中(Klenk等1997;Watson和Tabita1999;Hanson和Tabita2001,2003Ashida等2003).它与I,II,III相比,许多活性位点保守氨基酸残基缺失,同源性甚低.如泥生绿菌,好热性硫磺细菌cL.,枯草芽孢杆菌中分别有11,5,9个活性位点的保守氨基酸残基被其它氨基酸所取代;枯草芽孢杆菌RLP与I,II,III型仅有23%,23%,30%的序列同源性(Ashida等2005).实际上,在许多细菌中同时存在编码I型和Ⅱ型Rubisco的结构基因,但在正常情况下两者并不同时表达(English等1992;Karlin和Mrazek 2000).那不勒斯硫杆菌在rbcL,突变的情况下, rbcL,,可表达生成II型Rubisco,但菌体必须在高浓度的CO,下才能生长良好(Baker等1998).海洋氢弧菌MH一110含有3个拷贝的Rubisco基因(CbbLS—和CbbLS-2属于I型,CbbM属于II型).Y oshizawa等(2004)研究证实海洋氢弧菌MH一110在不同浓度的CO,条件下,三者以不同的组合形式进行表达.脱氮硫杆菌在厌氧条件下以硝酸盐作为电子受体能同时表达生成I,II2种类型Rubisco.最近,Carr~一Mlouka等(2006)报道,在世界范围内广泛引起水华的铜绿微囊藻PCC7806 (MicrocystisaeruginosaPCC7806)细胞内同时存在I,IV型Rubisco.沼泽红假单胞菌(Rhodopseudo. monaspalustris)除了含有I,II型Rubisco,还同时存在2类不同的RLP(Larimer等2004).这些发现导致不同类型Rubisco的共存问题变得更加复杂,这对研究Rubisco的进化可能有意义.4Rubisco的性质与一般的酶相比,Rubisco具有2个显着的特征.一是非专一性,即Rubisco既能催化羧化反应,也能催化加氧反应,具有双功能性;二是低效性,即Rubisco的催化效率较一般酶低,是由于Rubisco酶转换数低(真核生物的Rubiscok约为3~5S～,来源于不同生长温度的植物Rubiscok略有不同),催化效率有限(Watson和Tabita1999;Sage2002~Ashida等2005).4.1热稳定性Rubisco有一定的热稳定性,但不同来源的Rubisco的热稳定性存在较大差异.水稻Rubisco在50℃保温7min达到最大活力,随后迅速下降,30min后酶活性下降至40%;烟草Rubisco在50℃保温20min达最大活力,30min后活力还维持在98%左右;菠菜Rubisco氨甲酰化后经60℃的10mmo1.LDTr处理1h活力还维持50%(陈为钧等1999).在嗜热古生菌如菌中,Rubisco的热稳定性极高.Tk.Rubisco在30—110℃范围内均能有效完成十聚体结构的组装(Maeda等2002);在40～100℃范围内能够保持有效的羧化酶活性,且活性随温度(40-90℃)的升高而上升;在80℃保温15h活力仍维持50%(Ezaki等1999).Maeda等(2002)采用定点突变(E63S,R66S,D69S)的方法,进一步研究证实Tk—RubiSCO耐热性依赖于特殊的五角形晶体结构(pentagonalstructure),此种结构的特点是二聚体相互接触紧密,接触面上的氨基酸残基之间存在离子间的相互作用,并形成8对离子键.同时,低聚状态对耐热性的维持也有影响.Tk.Rubisco的十聚体结构提高了蛋白质的变性温度,从而进一步提高了Tk菌适应高温的能力.4.2酶促反应动力学参数一般而言,C植物及景天科酸代谢植物Rubisco的Kin(CO)在12～26 ~tmol?L～,C4植物Rubisco的Kin(CO2)为28～63 ∞1.L-(Chen等2002).但不同类型植物Rubisco Kin(CO2)仍存在差异,如水稻RubiscoKin(CO2)一般为12lxmo1.L～,而喜温红藻(Galdieriapartita)的K(co2)仅为6.6~tmol?L一,这种喜温红藻366植物生理学通讯第43卷第2期,2007年4月RubiscoK~(CO)值在当时被认为是所有Rubisco中最小的(Uemura等1997).Ezaki等(1999)研究菌的结果表明,Tk—RubiSCO具有更强的羧化能力,在CO,饱和,90℃高温条件下,Tk.Rubisco同化CO,的速率可达19.8x10.nmo1.mg(酶蛋白)? min～.Rubisco羧化与氧化反应的活力比按/V o=()/(V oKc)([CO:】/【O2】)计算.其中,,分别表示羧化和氧化反应的最大反应速率;&,K. 分别代表羧化和氧化反应的米氏常数;【CO】和【O】为气体浓度;(c.)/(.c)称特性因子(specificityfactor),即羧化/氧化值(Q值)(Uemura等1997;Parry等2003).一定种类Rubisco的Q值为一常数,但不同来源的RubiscoQ值有较大差异(表1).绿色高等植物Rubisco的Q值一般在90～95之间;蓝藻的Q值也有35～40;细菌的Q值一般在9～45之间.从喜温红藻中发现的I型RubiscoQ值高达238(25℃),是高等植物Q值的2.5倍,说明其具有极强的固定CO:的能力(Uemura等1997).更为重要的是喜温红藻本身就属于植物,这对从亚基水平上改变Rubisco动力学性质及Q值,提高植物光合效率有重大意义. Tk—Rubisco存在更高的Q值且随温度的升高而上升,在50℃时为70,70℃时上升至250,90℃时则达到最大值310(Ezaki等1999).与此相反,喜温红藻的RubiscoQ值随着温度的升高反而降低(Uemura等1997).Watson和Tabita(1999)测定詹氏甲烷球菌Q值的结果表明,其羧化能力极差,Q值只有0.5,是所有Rubisco中Q值最低的.5Rubisco的功能已经证实,O是羧化酶反应的竞争性抑制剂;同样CO是加氧酶反应的竞争性抑制剂.因此,Rubisco处于光合碳还原(光合作用)和光合碳氧化(光呼吸)2个方向相反但又相互连锁的循环反应的交叉点上.当co#o:的浓度比值较高时,促进Rubisco催化的羧化反应.羧化反应一般分为烯醇化,羧化,水合,C—C键断裂,质子化5个阶段(Lundqvist和Schneider1991;Li等2005). Rubisco催化游离的CO,共价结合到底物RuBP上,进而生成两分子的3一磷酸甘油酸(3一phosphoglyc—ericacid,PGA),推动C3-PCR循环.当CO2/O2的浓度比值较低时,促进Rubisco催化的加氧反应,RuBP即裂解产生一分子的磷酸乙醇酸和一分子的PGA,前者进一步分解成乙醇酸和磷酸,参与绿色植物的光呼吸循环.研究初期,人们认为Rubisco的功能主要集中在光合碳同化及光呼吸过程中.然而随着各种不同类型RubiSCO的陆续发现和研究的深入, Rubisco的功能呈现出多样化(表1).詹氏甲烷球菌及其它产甲烷古生菌中的III型RubiSCO参与PRPP—RuBP—PGA途径(Ashida等称之为RuPP通路) (Finn和Tabita2004;Ashida等2005).在这一途径中RuBP的合成前体是1一焦磷酸.5一磷酸.核糖(5一phospho—D—ribose一1一pyrophosphate,PRPP),脱磷酸后经NAD氧化生成RuBP,接着在Rubisco的催化下与CO,结合生成PGA.RLP一般无羧化酶活性,但它能催化2,3一二酮基一5一甲硫戊基.1一磷酸(2,3一diketo一5一methythio—pentyl一1一phosphate,DK—MTP.1一P)的烯醇化反应,与硫代谢密切相关(Ashida等2003;Li等2005;Carr6一Mlouka等2006).枯草芽孢杆菌RLP在腺苷蛋氨酸补救合成途径中作为DK—MTP一1一P烯醇化酶发挥作用(Ashida等2003,2005).在其r/p突变株中导入深红红螺菌的II型Rubisco后,该菌株竟然可恢复生长,说明光合类型的Rubisco可能仍然保持着作为一腺苷蛋氨酸补救合成途径中DK—MTP.1一P烯醇化酶的功能.也有人认为是由于RubiSCO对底物存在一定范围的适应(Li等2005).绿色硫细菌RLP与硫代谢和氧化应激(oxidativestress)有关(Hanson和Tabita2001).铜绿微囊藻PCC7806RLP在硫代谢过程中也起一定作用.半定量RT—PCR的结果显示,在硫缺乏的情况下,吐Ⅳ的转录是正常状况(硫充足)下的22倍(Carte—Mlouka等2006).Rubisco作为植物叶中的主要含氮有机物之一,必然与植物对氮的吸收,利用及循环有关.研究不同种类C植物氮利用的情况表明,较高的Rubisco,是NADP苹果酸酶类型比NAD苹果酸酶类型具有更高的氮利用率的主要原因(Ghannoum等2005).Rubisco与植物雄性不育也有一定的联系.刘祚昌等(1983)研究玉米,高粱,水稻,小植物生理学通讯第43卷第2期,2007年4月367 麦和烟草等作物的细胞质雄性不育系Rubisco的结果表明,其活性均高于相应的保持系.水稻光周期敏感核不育农垦58S经长光照及红光间断暗周期处理表现为雄性不育,其Rubisco的活性明显低于可育状态(夏凯等1989).Schwender等(2004)最新发现甘蓝型油菜(Brassicanapus)中Rubisco参与植物中碳转化为油的代谢通道,此通道可导致碳作为油贮存的效率达到最大.6结语有人曾将红藻中高效率Rubisco酶的小亚基基因转入植物叶绿体中并得到表达,但表达出的小亚基却不能与植物本身的大亚基组装成全酶(Whitney和Andrews2001).这可能是由于小亚基存在特异性的修饰,或者协助组装的分子伴侣无法识别异源亚基.要解决上述问题尚待深入研究Rubisco的组装机制.众多的研究表明,低等藻类和古生菌体内存在不同类型Rubisco.Lonsdale等(1983)从玉米(Zeamays)线粒体中分离到一个与Rubisco大亚基同源的基因,此基因在大肠杆菌中表达合成的分子量为2lkDa的蛋白能与小麦的Rubisco抗体反应.如何科学地解释Rubisco的共存现象,共存现象与Rubisco的分子进化是否存在某种内在联系,植物体内是否也存在多拷贝的Rubisco基因,均待进一步研究.微生物Rubisco的研究大大扩展了人们对Rubisco类型及功能的认识.序列同源性比较分析的结果显示,III型和Ⅳ型Rubisco比I型及II型更原始;枯草芽孢杆菌及铜绿微囊藻PCC7806RLP功能及突变株的研究结果表明,m型与Ⅳ型Rubisco中可能存在Rubisco的原始形式,或者说它们与Rubisco的原始形式在结构及功能上有更多的相似性.根据研究枯草芽孢杆菌RLP的结果,Ashida等(2003,2005)提出一条Rubisco可能的进化路线,认为光合类型Rubisco正是由枯草芽孢杆菌RLP演变而来的.以上研究和发现并未完全解决Rubisco的分子进化问题,但却为人们指明了方向,即通过研究和分析微生物Rubisco的结构和功能有可能部分或完全揭示Rubisco的分子进化历程.参考文献陈为钧,赵贵文,顾月华(1999).RubisCO的研究进展.生物化学与生物物理进展,26(5):433-.-436刘祚昌,李继耕,罗会馨,陈福太(1983).二磷酸核酮糖羧化酶与细胞质雄性不育性的研究.遗传,10(1):362吕红,周集体,王竞,安利佳(2003).原核生物Rubisco的研究进展.微生物学通报,30(2):82—85夏凯,肖翊华,刘文芳(1989).湖北光敏感核不育水稻光敏感期叶片中ATP含量与RuBPcase活力的分析.杂交水稻,(4): 412.30熊晓然,陈蔚梅,冯胜彦,郭明雄,艾建宇,吴斌(2003).植物Rubisco 活性中心的模拟分析.中国生物化学与分子生物,19(4):493--498AshidaH,DanchinA,Y okotaA(2005).Wasphotosynthetic RuBisCOrecruitedbyacquisitiveevolutionfromRuBisCO—likeproteinsinvolvedinsulfurmetabolism?ResMicrobiol,l56:6lll8AshidaH,SaitoY,KojimaC,KobayashiK,OgasawaraN,Y okotaA(2003).AfunctionallinkbetweenRuBisCO—likeproton ofBacillusandphot0syntheticRuBisCo.Science,302:286~290BakerSH,JinS,AldrichHC,HowardGT,ShivelyJM(1998). 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rubisco的结构和功能
Rubisco（Ribulose-1,5-bisphosphate
carboxylase/oxygenase）是一种酶，它在光合作用中起着关键作用。

Rubisco主要存在于植物叶绿体中，负责催化光合作用中的碳固定
反应。

它是光合作用中最重要的酶之一。

Rubisco的结构是复杂的，它通常由8个大亚基和8个小亚基
组成，形成一个大的复合物。

这种复合物的结构使得Rubisco能够
与许多底物和辅因子结合，从而实现其催化作用。

Rubisco的功能包括两个主要反应，羧化和氧化反应。

在羧化
反应中，Rubisco催化将二磷酸核酮糖（RuBP）与二氧化碳结合，
形成一个不稳定的6碳中间体，这是光合作用中的第一步，也是碳
固定的关键步骤。

在氧化反应中，Rubisco也能与氧气发生反应，
导致能量的损失，并产生一些有害的代谢产物。

这被认为是
Rubisco的一个缺陷，因为它降低了光合作用的效率。

除了在光合作用中的碳固定反应中发挥作用外，Rubisco还在
一些细菌中发挥着其他代谢途径中的作用，例如在一些细菌中参与
碳循环途径。

总的来说，Rubisco是植物和一些细菌中至关重要的酶，它的
结构复杂，功能多样，对于维持生物体的生存和生长具有重要意义。

命题点2CO2固定方式的比较及光呼吸1．C3植物、C4植物和CAM植物固定CO2的方式比较(1)比较C4植物、CAM植物固定CO2的方式相同点：都对CO2进行了两次固定。

不同点：C4植物两次固定CO2是空间上错开；CAM植物两次固定CO2是时间上错开。

(2)比较C3、C4、CAM途径C3途径是碳同化的基本途径，C4途径和CAM途径都只起固定CO2的作用，最终还是通过C3途径合成有机物。

2．光呼吸(1)发生原因：Rubisco是一种双功能酶，当CO2/O2的值高时，可催化C5固定CO2合成有机物；当CO2/O2的值低时，可催化C5结合O2发生氧化分解，消耗有机物，此过程称为光呼吸。

(2)一定条件下光呼吸使光合效率下降25%～30%，抑制光呼吸的措施：适当降低环境中O2浓度或提高CO2浓度。

(3)光呼吸对植物有重要的正面意义，在干旱天气和过强光照下，因为温度很高，蒸腾作用很强，气孔大量关闭，CO2供应减少。

其生理作用体现在：①光呼吸是高耗能反应，可以消耗光反应阶段生成的多余的NADPH和ATP。

②光呼吸的产物有CO2，可以弥补CO2不足，维系暗反应，暗反应也可以消耗掉NADPH和ATP。

③正常光照下体内产生乙醇酸是不可避免的，乙醇酸对细胞有毒害作用，而光呼吸可以消耗乙醇酸。

(4)光呼吸与细胞呼吸的比较项目光呼吸细胞呼吸(有氧呼吸)底物C2化合物糖类等有机物发生部位过氧化物酶体、线粒体、叶绿体细胞质基质、线粒体反应条件光照光或暗都可以能量消耗能量产生能量共同点消耗O2、释放CO21．(2021·全国乙，29)生活在干旱地区的一些植物(如植物甲)具有特殊的CO2固定方式。

这类植物晚上气孔打开吸收CO2，吸收的CO2通过生成苹果酸储存在液泡中；白天气孔关闭，液泡中储存的苹果酸脱羧释放的CO2可用于光合作用。

回答下列问题：(1)白天叶肉细胞产生ATP的场所有__________________________，光合作用所需的CO2来源于苹果酸脱羧和____________释放的CO2。

Rubisco的研究进展全光华;刘锴栋【摘要】从Rubisco的分布、基因的表达调控、结构和功能、分子结构与等电点(pI)的矛盾等方面对Rubisco的研究进展进行了综述.%The research progress of Rubisco were summarized from the distribution of Rubisco, the expression and regulation, structure andfunction of gene, the contradiction between molecular structure and pi and so on.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)021【总页数】2页(P12652,12746)【关键词】Rubisco;结构;免疫交叉反应;研究进展【作者】全光华;刘锴栋【作者单位】湛江师范学院数学与计算科学学院,广东湛江524048;湛江师范学院生命科学与技术学院,广东湛江524048【正文语种】中文【中图分类】S1321，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)是光合碳同化作用的关键酶。

Rubisco是一种双功能酶，是调节光合作用和光呼吸，从而决定净光合的一个关键酶［1］。

此外，Rubisco是植物可溶性蛋白中含量最高的蛋白质，占50%左右，它是植物体内一种重要的储藏蛋白。

在实践上，Rubisco是处于光合碳还原和氧化2个相反方向。

该酶催化光合作用的CO2固定的第1步反应，使CO2和二磷酸核酮糖(RuBP)转变成2个分子的3-2磷酸甘油酸，是碳同化的限速酶，对净光合速率起着决定性的作用;同时也催化光呼吸过程的第1步反应，即催化O2和RuBP产生1分子磷酸甘油酸和1分子磷酸乙醇酸［2］。

可见，研究Rubisco无论在理论上还是在实际上都具有重要的意义。

近年来，国内外科学家对Rubisco 进行了大量的研究［3-4］。