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第2章_酶学

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2基因工程的酶学基础

2基因工程的酶学基础

GCGC NarI BsaHI
GGCC
BbeI HaeII XbaI Bcl I
FspI
ApaI BanII
Bsp1286
T****A T****A NruI T****A T****A
EaeI MscI
GTAC **** **** **** **** A****T A****T A****T A****T A****T
② 不完全同裂酶： 识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。
Xma I
Sma I
5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
（6）同尾酶(Isocaudamers）
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末 端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等
核酸限制性内切酶的类型及主要特性
特性 I类内切酶 II类内切酶 III类内切酶
限制和修饰 单一多功能的酶 活性 内切酶和甲基 共同亚基的双 化酶分开 功能酶
内切酶的蛋 3种不同的亚基 白结构 限制作用所 ATP、 Mg2+和SAM 需要的辅助 因子 寄主特异性 EcoB： 位点识别序 TGA(N)8TGCT 列 EcoK： AAC(N)6GTGC
BamH I Bgl Ⅱ
Bcl I Xho Ⅱ
5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’ 5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’ 5’-UGATCY-3’ 3’-YCTAGU-5’
U代表嘌呤；Y代表嘧啶。
Sau 3A
BfaI
DpnI
HinpI
HaeIII HhaI

酶学及酶工程2章1节

酶学及酶工程2章1节

例：转化酶（invertase）的活性测定
催化反应：蔗糖+水→葡萄糖+果糖 Nelson还原糖定量法测定生成的还原糖量来测定反应速 度。 1单位转化酶活性定义为标准测活条件下1min内水解 1μmole蔗糖生成2μmols还原糖的酶活性。 Nelson试剂：含碳酸钠，酒石酸钾钠，碳酸氢钠，硫酸 钠，硫酸铜 。 砷钼酸试剂：含钼酸铵，砷酸钠，硫酸。 测定方法：将酶和底物混和保温，反应一定时间后加入 Nelson试剂中断酶反应，沸水浴后加入砷钼酸试剂，充分 反应后测定510nm光吸收，由标准曲线上得到还原糖量， 计算得到酶活性。
比色杯
酶反应在比色杯中进行，将反应系统加入比色杯恒温，通常 是最后加入酶溶液启动反应，混匀后即启动连续监测。也有 最后加某一底物启动反应的。 按材料比色杯有石英、玻璃和塑料的。石英杯适用于紫外， 可见各波长，但价格高。玻璃杯价低，准确性亦好，但不适 用紫外（不透明）。塑料杯价最低，也不适用紫外，准确性 稍差，可用于一次性使用。 标准比色杯大小为1cm×1cm内径，容量为3ml，一般测活可 用2ml。窄缝比色杯宽度0.5cm或更少，可节省测活材料，但 需注意和光束位置的配合，做不好易出操作误差。 标准光径为1cm，非标准光径有0.5cm, 2cm, 4cm甚至10cm 光径，可用于光吸收过大或过小的溶液。
ε :摩尔消光系数，c: 浓度，l: 光径
物化性质
3. 空间结构的稳定性 有活性的酶的空间结构稳定性有限。不同的酶 可能有不同的稳定性。 保持稳定性的环境因素： 1）离子强度适当； 2）最适酸碱度左右； 3）低温； 4）加入稳定剂：甘油，糖类，聚乙二醇等。
物化性质
4. 化学反应性 1）水解：酸水解，碱水解，蛋白酶水解。 2）氧化：侧链的巯基易被氧化，甚至可被溶 于水中的溶解氧所氧化。如巯基是必需基团，会 使酶失活。另外氧化会形成二硫键，影响酶的空 间结构。保护的方法：真空除氧；加入保护剂， 如巯基乙醇，二巯基苏糖醇（DTT）。 3）侧链基团被化学作用：除巯基很易被作用 外，羟基，氨基，胍基，羧基，咪唑基，苯基等 均可被特定试剂作用。化学修饰的基础。

第二章 酶1

第二章 酶1

三、酶活性的调节
影响酶促反应速度的因素包括： 底物浓度、酶浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。
参与酶活性调控方式包括：
基因表达调控、激素、反馈抑制、蛋白酶激活、可逆共价修 饰、别构调节等。
（一）共价修饰
1.不可逆共价修饰：蛋白酶解激活
酶原与酶原的激活
有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体， 必须在一定条件下，这些酶的前体水解一个或几个特定的 肽键，致使构象发生改变，表现出酶的活性。这种无活性 酶的前体称为酶原（zymogen）。 酶原向酶的转化过程称为酶原的激活。酶原的激活实 际上是酶的活性中心形成或暴露的过程。
协同效应： 寡聚酶（几个亚基）中，每个亚基的一个结合部位， 一旦一个效应物结合以后，会引起（诱导）酶分子构 象变化，使得酶分子上的电子分布被改变， 结果是使 后面的配体对酶的亲和力发生相应的改变。 如果一个效应物结合以后，后面的配体更容易结合，则 为正协同效应。 如果一个效应物结合以后，面后的配体更难结合，则为 负协同效应。 但同促协同效应一般为正协同效应。
（一）不可逆抑制作用： 抑制剂与酶分子的必需基团共价结合引 起酶活性的抑制，且不能采用透析等简 单方法使酶活性恢复的抑制作用就是不 可逆抑制作用。 酶的 不可 逆抑制 作用包 括专一 性抑制 （如有机磷农药对胆碱酯酶的抑制）和 非专一性抑制（如路易士气对巯基酶的 抑制）两种。
（二）可逆抑制作用： 抑制剂以非共价键与酶分子可逆性 结合造成酶活性的抑制，且可采用 透析等简单方法去除抑制剂而使酶 活性完全恢复的抑制作用就是可逆 抑制作用。 可逆抑制作用包括竞争性、反竞争 性、和非竞争性抑制几种类型。
断裂或形成 酶活性中心外的必需基团：维持酶活性中心的空间构象
（三）酶促反应的特点与机制

第2章酶促反应动力学

第2章酶促反应动力学

酶应用的特点
1) 酶的稳定性及应用特点 2) 酶是以活力、而不是以质量购销的 3) 酶有不同的质量等级：
工业用酶 食品用酶 医药用酶 …… 实际应用酶时应注意，没有必要使用比工艺条件所需 纯度更高的酶。
酶应用的特点
酶应用的特点
酶应用的特点
酶应用的特点
• 经典酶学研究中，酶活力的测定是在反应的初始短时间内 进行的，并且酶浓度、底物浓度较低，且为水溶液，酶学 研究的目的是探讨酶促反应的机制。
酶的分类
• 例如：
编号EC1.1.1.1（已醇脱氢酶）
第一大 类（氧 化还原 酶）
第一亚 类（氧 化基团 是CHO
H）
第一亚
亚类 （NAD 为H的 受体）
在此亚 亚类中 的顺序
号
酶的催化共性
1）降低反应的活化能 如过氧化氢的分解，无催化剂时反应 活化能为75.31kJ/mol，加入过氧化氢酶后，过氧化氢分 解反应的活化能为8.37kJ/mol；
酶的分类
• 国际生物化学联合会(International Union of Biochemistry IUB)国际酶学委员会(Enzyme Commission, EC)于1961年 提出的酶的分类与命名方案的规定，按照酶进行催化反应 的类型，可将酶分为六类： 1）氧化还原酶类(oxidoreductases) 2）转移酶类(transferases) 3）水解酶类(hydrolases) 4）裂合酶(lyases) 5）异构酶(isomerases) 6）连接（或合成）酶(ligase, synthetases)
2）加快反应速率 一般非酶催化反应速率太低，不易观察， 酶催化反应速率和在相同pH值与温度下非酶催化反应速 率可直接比较的例子很少。已知己糖激酶可加快反应速率， 大于1010倍；乙醇脱氢酶大于2×108倍。

第二章 食品酶学_PPT幻灯片

第二章 食品酶学_PPT幻灯片

辅酶：结合松散，易透析除去。
辅基：结合紧密，不易透析除去。
食品化学
FOOD CHEMISTRY
第二章 食品酶学
根据结构不同酶可分为： 单体酶：
只有单一的三级结构蛋白质构成。 寡聚酶：
由多个（两个以上）具有三级结构的亚基聚合而成。 多酶复合体：
由几个功能相关的酶嵌合而成的复合体。
食品化学
FOOD CHEMISTRY
绝大多数的酶是蛋白质，具有蛋白质的一切理化性 质。按组成可分为： 单纯酶 结合酶（全酶）
食品化学
FOOD CHEMISTRY
第二章 食品酶学
单纯酶：
仅由蛋白质组成，水解的最终产物是氨基酸，如胃 蛋白酶，脉酶，木瓜蛋白酶。
结合白酶（全酶）：
由酶蛋白和辅助因子结合。
辅助因子包括包括金属离子和有机小分子，有机小 分子包括辅酶和辅基，一般是结构复杂的有机化合物。
食品化学
FOOD CHEMISTRY
第二章 食品酶学
2、底物浓度对酶促反应的影响
在酶浓度、pH、温度等条件
不变的情况下研究底物浓度和反 反
应速度的关系。如右图所示：
应
在低底物浓度时, 反应速度 与底物浓度成正比，表现为一级
速 度
反应特征。
当底物浓度达到一定值，几
乎所有的酶都与底物结合后，反
应速度达到最大值（Vmax），
FOOD CHEMISTRY
第二章 食品酶学
第三节 酶促反应动力学
酶促反应动力学是研究酶促反应速度及影响反应速度 的各种因素的科学，对于深入了解酶催化作用的本质、机 制以及对于酶的分离纯化及应用等方面都具有重要意义。
1、酶浓度对酶促反应的影响
当底物充足，其它因素不变，并且反应系统中不含 有抑制酶活性的物质及其它不利于酶发挥作用的因素时， 反应速率与酶浓度成正比；底物浓度不足或酶浓度过高、 产物积累对反应有抑制作用，会妨碍反应速率；实际生 产中，酶浓度如过高，既浪费又影响产品质量。

酶学重点

酶学重点

第1章绪论1.酶是生物体产生的一类具有生物催化活性的生物大分子。

2.米氏方程V=Vmax[S]/（Km+[S]）3.酶的一般特征1)酶的催化效率高2)大多数酶的化学本质是蛋白质3)酶作用的专一性a)键专一性b)基团专一性c)绝对专一性d)立体异构专一性4.酶包括胞外酶、胞内酶。

5. 酶的分类和命名以酶所催化的化学反应性质作为酶的分类三个名称：系统名，惯用名和一个数字编号。

系统名包括两部分，底物名称及反应类型。

酶的数字编号系统根据酶所催化反应的类型将酶分为6大类，EC是指酶学委员会。

第一个数字代表酶的6个大分类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶第2章酶催化反应动力学1.酶的动力学研究包括哪些内容?底物浓度、抑制剂、温度、pH和激活剂等2.酶活力测定时需注意：1)选择反应的最适温度，根据不同的底物和缓冲液选择反应的最适pH。

2)速度要快，取反应的初速度3)底物浓度要足够大（一般在10Km以上）3.测定酶活力的基本原理酶蛋白的含量很低，很难直接测定其蛋白质的含量，且常与其他各种蛋白质混合存在，将其提纯耗时费力。

故不能直接用重量或体积等指标来衡量。

4.测定酶活力常用的方法：分光光度法、荧光法、同位素法、电化学方法。

其他方法：如旋光法、量气法、量热法和层析法等5.酶促反应的动力学方程式（米氏方程）V=Vmax[S]/（Km+[S]）米氏常数的含义•K m值就代表着反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。

米氏常数的应用价值1)Km是酶的一个特征性常数：也就是说Km的大小只与酶本身的性质有关，而与酶浓度无关。

2)Km值还可以用于判断酶的专一性和天然底物，Km值最小的底物往往被称为该酶的最适底物或天然底物。

3)Km可以作为酶和底物结合紧密程度的—个度量指标，用来表示酶与底物结合的亲和力大小。

4)已知某个酶的Km值，就可以计算出在某一底物浓度条件下，其反应速度相当于Vmax的百分比。

5)Km值还可以帮助我们推断具体条件下某一代谢反应的方向和途径，只有Km值小的酶促反应才会在竞争中占优势。

第二章 酶类

第二章 酶类
2.分类
按照催化反应的类型，国际酶学委员会将酶分为六大类。在这六大类里，又各自分为若干亚类，亚类下又分小组。亚类的划分标准：氧化还原酶是电子供体类型，移换酶是被转移基团的形状，水解酶是被水解的键的类型，裂合酶是被裂解的键的类型，异构酶是异构作用的类型，合成酶是生成的键的类型。
（1）氧化还原酶 催化氧化还原反应，如葡萄糖氧化酶，各种脱氢酶等。是已发现的量最大的一类酶，其氧化、产能、解毒功能，在生产中的应用仅次于水解酶。需要辅因子，可根据反应时辅因子的光电性质变化来测定。按系统命名可分为19亚类，习惯上可分为4个亚类：
2.单体酶、寡聚酶和多酶体系
由一条肽链构成的酶称为单体酶，由多条肽链以非共价键结合而成的酶称为寡聚酶，属于寡聚蛋白。有时在生物体内一些功能相关的酶被组织起来，构成多酶体系，依次催化有关的反应。构成多酶体系是代谢的需要，可以降低底物和产物的扩散限制，提高总反应的速度和效率。
有时一条肽链上有多种酶活性，称为多酶融合体。如糖原分解中的脱支酶在一条肽链上有淀粉-1，6-葡萄糖苷酶和4-α-D-葡聚糖转移酶活性；来自樟树种子的克木毒蛋白（camphorin）由一条肽链组成，有三种活性：① RNA N-糖苷酶活性，可水解大鼠28S rRNA中第4324位腺苷酸的糖苷键，释放一个腺嘌呤；② 依赖于超螺旋DNA构型的核酸内切酶活性，专一解旋并切割超螺旋环状DNA形成缺口环状和线状DNA；③ 超氧化物歧化酶活性。来自红色链孢霉的AROM多酶融合体是二聚体，每条肽链含五种酶活性，可催化莽草酸途径的第二至第六步反应，由于有中间产物的传递通道，使催化效率大为提高。
2一碳基转移酶：转移一碳单位，与核酸、蛋白质甲基化有关。
2磷酸基转移酶：常称为激酶，多以ATP为供体。少数蛋白酶也称为激酶（如肠激酶）。

第二章-酶促反应动力学

第二章-酶促反应动力学
• 一个标准酶活单位定义为：每分钟使果胶裂解产生1μmol的不饱 和聚半乳糖醛酸所需的酶量。不饱和聚半乳糖醛酸在235nm处的 摩尔吸光系数为4600Lmol-1cm-1[6]。
• U =（A/4600）×106×10-3×3×10×（1/10）×n
• = A×n×(30/46)
• 式中：U-----------酶液的酶活力， U/mL
KS CS
稳态法推导动力学方程：
几点假设：
（1）CS>>CE，中间复合物ES的形成不会降 低CS。
（2）不考虑这个可逆反应。
（3）CS>>CE中间复合物ES一经分解，产生 的游离酶立即与底物结合，使中间复合物 ES浓度保持衡定，即 。 dC ES 0
dt
根据以上假设，可建立如下方程组
rk2CES
（3）E S E为S 快速平衡，E S E P 为整个反应的限速阶段，因此ES分解 成产物不足以破坏这个平衡。
根据假设建立动力学方程
rk2CES
dCES dt
k1CECSk1CES0
C E0C EC ES
CECS CES
KS
k1 k1
解之，得
r k2CE0CS KS CS
令 rmaxk2CE0 则 r rmaxCS
• A —————OD值
• n ———— 酶液稀释倍数
2.1 酶促反应动力学的特点
2.1.1 酶的基本概念 2.1.2 酶的稳定性及应用特点
酶是以活力、而不是以质量购销的。 酶有不同的质量等级：工业用酶、食品用酶、医药 用酶。酶的实际应用中应注意，没有必要使用比工艺 条件所需纯度更高的酶。
经典酶学研究中，酶反应速率的测定是在反应的 初始短时间内进行的，并且酶浓度、底物浓度较低， 且为水溶液，酶学研究的目的是探讨酶促反应的机 制。

(完整版)第二次酶学练习题-答案2007

(完整版)第二次酶学练习题-答案2007

第二章酶学练习题一、填空题1.酶促反应的特点为_____________ 、 _____________ _、________ ____、_______ ______。

条件温和高效率高专一性可调节2.酶活性的快速调节方式包括_________ 和_________ 。

酶原激活共价修饰调节3.全酶包括______________ 和______________ 。

酶蛋白辅助因子4.酶的结合部位决定酶_____________ ，而催化部位决定酶的______________ 。

专一性催化反应性质5.酶活性中心往往处于酶分子表面的______________ 中，形成区，从而使酶与底物之间的作用加强。

孔穴凹陷疏水6.在酶蛋白中既能作为质子供体又能作为质子受体的、最有效又最活泼的催化基团是。

组氨酸的咪唑基7.在胰凝乳蛋白酶的催化过程中，有质子从酶到底物的转移，此质子的供体是。

水8.胰凝乳蛋白酶活性中心的电荷转接系统是由、和三个氨基酸残基依赖氢键产生的。

Asp102、His57及Ser195 氢9.同一种酶有几种底物，就有个Km值，其中Km值最的底物，便为该酶的底物。

几小最适宜10．加入竞争性抑制剂，酶的最大反应速度会，Km值会。

不变减小11.一般别构酶分子结构中都包括部位和部位，其反应速度对底物浓度的曲线是曲线。

活性部位别构部位 S形12.测定酶活力时，底物浓度应，反应温度应选在，反应PH选在，反应时间应在反应的期进行。

过量适宜范围适宜的范围初13.表示酶量的多少常用表示。

酶活力单位14.在标准条件下，1mg酶在1min内转化了2umol底物，那么 mg酶代表1个酶活力单位。

0.515.酶原激活的本质是的形成和暴露的过程。

活性中心16.丙二酸是酶的抑制剂。

琥珀酸脱氢酶竞争性17.延胡索酸酶只对反丁烯二酸(延胡索酸)起催化作用，而对顺丁烯二酸则无作用，因而此酶具有专一性。

几何异构18.米氏方程为。

V= Vmax[S]/(Km+[S])19.酶能加速化学反应的主要原因是和结合形成了，使呈活化状态，从而了反应的活化能。

第二章 酶学基础考试

第二章 酶学基础考试

降低是由于酶分子数量的减少，每分子酶
的催化效力并无变化.
二．抑制程度的表示
一般用反应速度的变化来表示。若以不加抑 制剂时的反应速度为 Vo，加入抑制剂后的 反应速度为Vi，则酶的抑制程度有下列几 种表示方法：
二．抑制程度的表示
1． 相对活力分数（残余活力分数） a=Vi/Vo 2． 相对活力百分数（残余活力百分数） a%==Vi/Vo*100% 3． 抑制分数 指被抑制而失去活力的分数i=1-a=1-Vi/Vo 4． 抑制百分数 i%=(1-a)*100%==(1-Vi/Vo)*100% 通常所谓抑制率是指抑制分数或 抑制百分数。
与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。 与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。
金属激活剂 金属离子作为辅助因子。 酶的催化专一性主要决定于膜蛋白部分。辅因 子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载 体。
单体酶、寡聚酶和多酶复合物
1.单体酶（monomeric enzyme)：仅有一条具有活性部位的 多肽链，全部参与水解反应。 2.寡聚酶 (oligomeric enzyme)：由几个或多个亚基组成， 亚基牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以 非共价键结合。 3.多酶复合物 (multienzyme system)：几个酶镶嵌而成的 复合物。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。
丙酮酸脱氢酶系（E.coli）：丙酮酸脱氢酶（EⅠ）、 硫辛酰转乙酰酶（EⅡ）和二氢硫辛酰脱氢酶（EⅢ）。 EⅠ EⅡ EⅢ
碱性
EⅠ
+ EⅡ EⅢ
脲
EⅡ
+ EⅢ
活性部位和必需基团
必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则 酶的活性丧失。 活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶 催化作用直接有关的部位。

第二章酶学基础知识

第二章酶学基础知识

D-甘油醛-3-磷 EC5.3.1.1 酸醛-酮-异构酶
L-谷氨酸：氨连 EC6.3.1.2 6.连接酶类 接酶（生成ADP）
催化的反应
推荐名称
(S)-乳酸+NAD+ +NADH+H+
丙酮酸 L-乳酸脱 氢酶
L-丙氨酸+-酮戊二酸 丙酮酸+L-谷氨酸
丙氨酸转 氨酶
水解有3个以上1,4--D-葡萄糖 -淀粉酶 基的多糖中1,4--D-葡糖苷键
（六）催化两分子结合成一分子并偶联有高 能键的水解供能的酶类属于连接酶或 合成酶类
DNA连接酶、氨基 酰 -rRNA 合 成 酶 、 谷 氨 酰胺合成酶属于连接酶 或合成酶类（ligases或 synthetases）。
酶可按其所催化的反应类型予以命名
（一）系统名称给出酶促反应的各种信息， 但较繁琐
1．酶的活性中心由许多必需基团组成
必需基团(essential group) 酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，
与酶活性密切相关的化学基团。
常见的必需基团
丝氨酸残基的羟基 组氨酸残基的咪唑基 半胱氨酸残基的巯基 酸性氨基酸残基的羧基
➢ 活性中心内的必需基团
结合基团 (binding group)
活化能的降低可使反应速率呈指数上升
在标准状态下反应活化能降低1倍，反应速 率可提高约5000倍，呈现指数上升。 一般讲，酶的催化效率比非催化反应高1051017 倍
（二）酶与一般催化剂均可加速反应到达 反应平衡点
酶与一般催化剂一样，只能加快反应速率， 使其缩短到达反应平衡的时间，而不能改变反应 的平衡点。
习惯命名法，一般是按酶所催化的底物命名，在 其底物英文名词上加后缀“ase” 作为酶的名称。

食品酶学-酶学基础理论(第二章)

食品酶学-酶学基础理论(第二章)

NADH + H+
CH3-CO- COOH 丙酮酸
用电泳法分离LDH可得到5种同工酶区带。都是 由H和M二种不同类型的亚基组成的四聚体。
乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱
同工酶的测定可作为某些疾病的诊断指标。
正常人血清LDH主要来自红细胞渗出，活 力很低。当某一组织病变时，血清LDH同 工酶电泳图谱会发生变化。如肝细胞受 损早期，LDH总活性在正常范围内，但 LDH5升高；急性心肌变时，LDHl可升 高。
氢键
每个氨基酸残基 （第n个）的羰基 氧与多肽链C端方 向的第4个残基 （第n+4个）的酰 胺氮形成氢键。
β-折叠(β-sheet)
折叠片的构象是通过一个肽键的羰基氧和位于同一个肽链或相邻肽链 的另一个酰胺氢之间形成的氢键维持的。肽链分为平行排列（走向都 是由N到C方向）或者是反平行排列（肽链反向排列）。
1.总体积中只占相当小的部分（约1%2%）
2.酶分子表面的一个凹穴，具有一定柔性
3.活性中心为非极性的微环境 4.底物与酶通过形成较弱键力的次级 键相互作用并结合到酶的活性中心
5.酶的活性部位与底物的几何图形并 非正好吻合，底物或酶或两者的构象 同时变化后才相互契合
酶活性中心示意图
举例：酪氨酸酶（多分氧化酶） 酪氨酸酶在生物色素形成中的作用
蜂蜜品质同工酶电泳检测
• 比较两种天然蜂蜜与掺假所用的工业淀粉酶的同工 酶电泳，发现天然蜂蜜的淀粉酶同工酶酶谱和工业 淀粉酶的同工酶酶谱存在差异。
三. 酶的催化机制
底酶
物的
结作
锁钥学说（lock and key hypothesis）
合用 后专
才一
表性
过渡态学说
现必 出须

第二章 酶的结构与功能2012

第二章 酶的结构与功能2012

E+S
k1
ES
k3
P+E
k2
稳态时ES浓度不变
反应速度 V=k3[ES] ES的生成速度=消耗速度 k1[E][S]=k2[ES] + k3[ES] E的质量平衡方程 米氏方程
V=
V[S] Km + [S]
V=Vmax=k3[ES]max=k3[Et] Km= k2 + k3 k1 米氏常数
[E]=[Et] - [ES]
S
2.1.1.2 动力学参数的意义 （1）米氏常数Km的意义
V Vmax Vmax/2
Vmax 2
Km
[S]
Vmax[S] ＝ Km + [S]
Km＝[S]
∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半 时的底物浓度，单位是mol/L。
①Km是酶的特性常数：
与pH 、温度、离子强度、酶及底物种类有关，与酶浓度无 关，可以鉴定酶。
反相层析中的离子配对试剂的作用
反相层析中的离子配对试剂的作用
酶的提纯

双水相萃取法--Two-aqueous phase extraction
1.1%右旋糖苷+0.36%甲基纤维素
右旋糖苷0.39% 甲基纤维素0.65% 右旋糖苷1.58% 甲基纤维素0.15%
人生长激素提取
不均一相 用于分离的体系: PEG/Dextran PEG/Dextran 硫酸盐 PEG/硫酸盐 PEG/磷酸盐
酶的提纯
（1）膜分离技术： 微孔过滤，0.02-10um,分离完整细胞； 超滤技术，1-20nm,分离300KD以上蛋白质； 反渗析技术，1-10nm，分离100-300KD蛋白质。 （2）相分离技术： 膜蛋白分离采用水-有机溶剂混合物加非离子去垢剂； 可溶性蛋白采用聚乙二醇-葡聚糖或聚乙二醇-右旋糖酐等双 水相系统。 （3）层析技术：用酶的底物、底物类似物、抑制剂等与载 体共价连接制成亲和层吸柱；反相层析技术。 （4）萃取技术：双水相萃取技术；反胶束萃取技术。
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Chem Biol Interact. 2013,205(1): 1-10
4．酶活性中心的必需基团
O
主要包括： 亲核性基团：丝氨 酸的羟基，半胱氨 酸的巯基和组氨酸 的咪唑基。
H2N
CH CH2 OH
C
OH
OH
O H2N CH CH2 O SH H2N CH CH2 N H N NH C OH N C OH SH
咪唑和对-硝基苯酚乙酸酯的反应是一个双分子 氨解反应。 实验表明，分子内咪唑基参与的氨解反应速度比 相应的分子间反应速度大24倍。说明咪唑基与酯 基的相对位臵对水解反应速度具有很大的影响。
（2）与反应过渡状态 按 SN2 历程进行的 反应，反应速度与形 结合作用 成的过渡状态稳定性 密切相关。 在酶催化的反应中， 与酶的活性中心形成 复合物的实际上是底 物形成的过渡状态， 所以，酶与过渡状态 的亲和力要大于酶与 底物或产物的亲和力。
2．催化部位 catalytic site
酶分子中促使底物发生化学 变化的部位称为催化部位。 通常将酶的结合部位和催化 部位总称为酶的活性部位或 活性中心。 结合部位决定酶的专一性， 催化部位决定酶所催化反应 的性质。
溶菌酶的活性中心
3．调控部位 Regulatory site
酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种 程度的结合的部位，从而引起酶分子空间构象 的变化，对酶起激活或抑制作用。
相对专一性
有些酶的作用 对象不是一种 底物，而是一 类化合物或一 类化学键。这 种专一性称为 相对专一性 (Relative Specificity)。
族(group)专一性
如-葡萄糖苷酶，催化由葡萄糖所构成的糖苷水解， 但对于糖苷的另一端没有严 格要求。
CH2OH O OR OH OH OH 葡萄糖苷酶 OH OH OH CH2OH O OH
2) 底物专一性
一种酶只能作用 于某一种或某一 类结构性质相似 的物质。 根据酶对底物专 一性的程度和类 型，大至可分为 以下几类：
结构专一性
有些酶对底物的要求 非常严格，只作用于 一个特定的底物。这 种专一性称为绝对专 一性（Absolute specificity)。 如：脲酶只能催化尿 素的水解，对N-取代 的尿素不水解。
有些酶只能选择性催化某种几何异构体底物的反 应，而对另一种构型则无催化作用。
如延胡索酸水合酶只能催化延胡索酸水合生成苹 果酸，对马来酸则不起作用。
H HOOC C C COOH H 延胡索酸酶 H2O HOOC CH2CHCOOH OH
3．反应条件温和
酶促反应一般在pH 5-8 水溶液中进行， 反应温度范围为 20-40C。
——酶活性的调节方式之一：酶结构的调节
酶原激活的机理
酶原 在特定条件下 一个或几个特定的肽键断裂，水解 掉一个或几个短肽 分子构象发生改变
形成或暴露出酶的活性中心
例：胃蛋白酶原
例：Caspase 9的激活 是细胞色素c与Apaf 1 作用下完成的。Apaf1的羧基端12个WD-40 重复区可与6分子细胞 色素c结合，通过 Apaf-1的这种桥梁作 用，最终形成Cyt cApaf-1-caspase 9 “凋亡体” （Apoptosome）。这 种复合体使casp-9被 激活，它再作为蛋白 酶去激活凋亡的效应 分子casp-3，引起核 凋亡。
4.酶活力可调节控制
如抑制剂调节、共价 修饰调节、反馈调节、 酶原激活及激素控制 等。
高温或其它苛刻的 物理或化学条件， 将引起酶的失活。
第三节 酶的结构及催化作用机制
一、酶分子的结构特点
1．结合部位 Binding site 酶分子中与底物结合 的部位或区域一般称 为结合部位。
酶与底物的结合部位
1，中间产物学说
在酶催化的反应中，第一 步是酶与底物形成酶－底 物中间复合物。当底物分 子在酶作用下发生化学变 化后，中间复合物再分解 成产物和酶。 E+ S === E-S P +E 许多实验事实证明了E－S 复合物的存在。E－S复合 物形成的速率与酶和底物 的性质有关。
2. 活化能降低
酶促反应：E + S == ES == ES EP E + P 反应方向,即化学平衡方向,主要取决于反应自由能变化 G。而反应速度快慢,则主要取决于反应的活化能Ea。 催化剂的作用是降低反应活化能Ea,从而起到提高反应速 度的作用。
3. 决定酶催化作用高效率的机制
（1）邻基效应和定向效应
在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性中心， 一方面底物在酶活性中心的有效浓度大大增加， 有利于提高反应速度； 另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基 团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应 的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促 反应具有高效率和专一性特点。
NAD+ 和NADP+
功 能 ：
是 多 种 重 要 脱 氢 酶 的 辅 酶 。 NAD+ (烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸，又称为辅酶I) 和NADP+(烟酰胺-腺嘌呤磷酸二核苷酸 ,又称为辅 酶II )是维生素烟酰胺(B5)的衍生物。
生产烟酰胺工艺-广州龙沙
CH3 Pd-Al2O3 环合 N CN N 固定化腈水合酶 脱氢 N CONH2 N CH3二、酶促反应的机理
酶分子活性中心 部位，一般都含 有多个具有催化 活性的手性中心， 这些手性中心对 底物分子构型取 向起着诱导和定 向的作用，使反 应可以按单一方 向进行。 酶能够区分对称 分子中等价的潜 手性基团。
(a)“三点结合”的催化理 论
认为酶与底物 的结合处至少 有三个点，而 且只有一种情 况是完全结合 的形式。只有 这种情况下， 不对称催化作 用才能实现。
键专一性
RCH2COOR'
酯酶
RCH2COOH + R'OH
如酯酶催化酯的水解，对 于酯两端的基团没有严格 的要求。
位臵选择性
酶作用于某一类结构的物 质，只能在某一特殊位臵 形成新的化合物。 如：酪氨酸酶催化苯酚氧 化，只能产生邻位醌类化 合物。 某些脂肪酶只能催化取代 戊二酸二乙酯的一端水解.
OH 酪氨酸酶
酶-底物复合物的形成
在底物S与酶E结合之前，二者均处于自由运动状态， 在结合过程中，由于底物与酶分子的相互作用产生结 合能，结合后，形成高度有序、低熵的复合物
脱溶剂化作用
在酶-底物复合物ES形成过程中，酶分子活性中心结合 的水分子和底物分子结合的水分子相继发生脱溶剂化 作用，脱溶剂化作用增加了ES复合物的能量，使其更 活泼而容易反应。
辅酶的结构与功能
某些小分子有机化合物与酶蛋白结合在一起并 协同实施催化作用，这类分子被称为辅酶（或 辅基）。 辅酶是一类具有特殊化学结构和功能的化合物。 参与的酶促反应主要为氧化 - 还原反应或基团 转移反应。 大多数辅酶的前体主要是水溶性 B 族维生素。 许多维生素的生理功能与辅酶的作用密切相关。
酶催化的生物化 学反应，称为酶 促反应Enzymatic reaction。 在酶的催化下发 生化学变化的物 质，称为底物 substrate。
以下哪个是底物？哪个是产物？
CH3CH2OH+ NAD+
ADH
CH3CHO +NADH+ H+
辅酶coenzyme
根据酶的组成情况，可以将酶分为两大类： 单纯蛋白酶：它们的组成为单一蛋白质. 结合蛋白酶：某些酶，例如氧化 - 还原酶等， 其分子中除了蛋白质外，还含有非蛋白组分. 结合蛋白酶的蛋白质部分称为酶蛋白，非蛋白 质部分包括辅酶及金属离子(或辅因子 cofactor)。 酶蛋白与辅助成分组成的完整分子称为全酶。 单纯的酶蛋白无催化功能.
第二章
酶学基础
所有的生命现象，如生物个体的繁殖、生长、 分化、代谢、运动等，都是各种复杂的化学 变化的结果。生物体内进行的所有这些化学 变化都由一种特殊的物质，即酶的催化下进 行的。
第一节 酶是生物催化剂
一、什么是酶？
酶是活细胞产生的 一类具有催化功能 的生物分子，所以 又称为生物催化剂 Biocatalysts 。 绝大多数的酶都是 蛋白质。
酸碱性基团： 天冬氨酸和谷氨 酸的羧基； 赖氨酸的氨基；
O H2N CH C OH CH CH2 O C O OH O H2N CH CH2 C H2N OH CH CH2 CH2 CH2 CH2 NH2 OH OH NH2 C OH O O C OH COOH
CH2 H2N CH2 C OH
酪氨酸的酚羟基；
又称为特异 性，是指酶 在催化生化 反应时对底 物的选择性
(1)反应专一性
酶一般只能选择性地催化一种或一类相同类型 的化学反应。对于其他活泼功能基团不作用， 例如脂肪酶可以催化各种脂肪中酯键的水解反 应，但它不能催化脂肪化合物分子中其他键的 水解，如环氧键。
O O 脂肪酶 CH3CH2CH2CH CHCH2CH2COCH3 O O CH3CH2CH2CH CHCH2CH2COH
（3） 多功能催化作用
酶的活性中心部位，一般都含有多个起催化作用 的基团，这些基团在空间有特殊的排列和取向， 可以对底物价键的形变和极化及调整底物基团的 位臵等起到协同作用，从而使底物达到最佳反应 状态。
N CH3O CH3O CH3O O CH3O O CH3O O H CH3O CH3O O H CH3O C O H N O H
The distinct classes of mammalian PI3Ks
Nat Rev Mol Cell Bio, 2012, 13(3): 195-203.
酶原及其激活
酶原：无活性状态的酶的前体。
酶原的激活：酶原向活性酶转化的过程。 酶原激活的生理意义



避免对细胞进行自身消化 ——保护作用 酶在特定的部位和环境中发挥作用 ——保证体内代谢正常进行 酶原是部分酶的储存形式