荧光显微镜与激光扫描共聚焦显微镜

激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用一、激光扫描共聚焦显微镜的原理传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。

分光器将荧光直接送到探测器。

光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。

照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。

原理图二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。

显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。

通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。

三、激光扫描共聚焦显微镜的应用（一）细胞的三维重建普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。

LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。

这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。

旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。

通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。

通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。

LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。

荧光共聚焦和激光共聚焦荧光共聚焦显微镜（Fluorescence Confocal Microscopy，FCM）和激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy，LSCM）是两种常见的高分辨率显微镜技术。

它们能够提供具有亚细胞级别分辨率的三维图像，并广泛应用于生物医学研究、细胞生物学、神经科学等领域。

本文将逐步回答有关这两种技术的问题。

一、什么是荧光共聚焦和激光共聚焦显微镜？荧光共聚焦显微镜和激光共聚焦显微镜是两种基于共焦原理的高分辨率显微镜技术。

共焦显微镜利用聚焦光束与样品相交的特点，通过收集样品反射或荧光产生的信号来获取图像，并排除来自样品深部的散射或荧光信号，从而提高图像的清晰度和分辨率。

二、荧光共聚焦和激光共聚焦显微镜有何区别？荧光共聚焦显微镜和激光共聚焦显微镜在技术原理上是相似的，它们都是通过聚焦光束与样品相交，同时收集样品的信号来获取图像。

然而，它们在光源、探测器和成像模式等方面存在细微差别。

1. 光源：荧光共聚焦显微镜通常使用白光波长或相对宽的光源，如汞弧灯、钨丝灯或LED照明来激发样品中的荧光标记物。

而激光共聚焦显微镜则使用激光器作为光源，能够提供单一波长、高纯度的激光光束。

2. 探测器：荧光共聚焦显微镜的探测器通常是光电管，它能够检测荧光信号的强度和位置。

而激光共聚焦显微镜则使用光电倍增管（PMT）或光电二极管（APD）等高灵敏度探测器，能够实时探测并记录荧光信号。

3. 成像模式：荧光共聚焦显微镜主要采用点扫描模式，即通过聚焦光束在样品上的局部区域进行扫描，获取逐点的荧光强度。

而激光共聚焦显微镜则采用线扫描模式，通过聚焦光束在样品上的线条进行扫描，获取逐线的荧光信号。

三、荧光共聚焦和激光共聚焦显微镜的工作原理是什么？1. 荧光共聚焦显微镜的工作原理：荧光共聚焦显微镜与传统荧光显微镜相似，先用荧光染料或荧光标记的抗体对样品进行标记，然后使用荧光光源激发样品中的荧光标记物。

激光扫描共聚焦荧光显微镜的成像原理和基本结构显微镜操作规程（激光扫描共聚焦荧光显微镜）是一种利用计算机、激光和图像处理技术获得生物样品三维数据、先进的分子细胞生物学的分析仪器。

紧要用于察看活细胞结构及特定分子、离子的生物学变化，定量分析，以及实时定量测定等。

成像原理接受点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。

分光器将荧光直接送到探测器。

光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。

两者的几何尺寸一致，约100—200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。

这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。

以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，终在屏幕上聚合成清楚的整个焦平面的共聚焦图像。

每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横切面总是有确定厚度的，又称为光学薄片。

由于焦点处的光强宏大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深貌似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待察看样品聚焦光斑处二维的光学切片。

把X—Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。

即检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔。

激光共聚焦的工作原理简单表达就是它接受激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机掌控来进行数字化图像采集和处理的系统。

基本结构（激光扫描共聚焦显微镜系统）紧要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。

激光扫描共聚焦荧光显微镜原理介绍激光扫描共聚焦荧光显微镜（Laser Scanning Confocal Fluorescence Microscopy，LS-CFM）是一种先进的显微镜技术，用于获取高分辨率的细胞和组织图像。

它基于激光光源和共聚焦原理，通过激发标记的荧光物质来提高显微镜的分辨率和对比度。

本文将详细介绍LS-CFM的原理和应用。

激光扫描共聚焦显微镜的工作原理激光光源LS-CFM使用激光光源作为激发荧光物质的光源。

激光光源具有高强度、单色性和方向性，可以提高显微镜的灵敏度和分辨率。

扫描系统LS-CFM的扫描系统包括镜片、扫描镜和探测器。

激光光束经过镜片聚焦到样本上，扫描镜通过改变反射角度来扫描样本表面，探测器记录荧光信号。

共聚焦原理共聚焦原理是LS-CFM的核心原理，它通过控制扫描镜的运动和探测器的观察位置，只获取样本特定平面（焦平面）的荧光信号。

由于样品处于共焦面上时探测荧光的最大值，可以得到高分辨率图像。

荧光物质激发和发射过程在LS-CFM中，荧光物质被激光光源激发后会发射荧光。

荧光物质的发射波长通常比激发波长长。

激发光和发射光通过不同的光路，以避免激发光干扰荧光信号。

LS-CFM的优势1.高分辨率：共聚焦原理使LS-CFM能够获取超过传统荧光显微镜的分辨率，可以观察更细微的结构和细胞器。

2.高对比度：由于共焦面上只有样品发出的荧光被探测到，背景信号减少，对比度更高。

3.深度扫描能力：LS-CFM具有深度扫描能力，可以获取样本的三维图像。

这对于观察细胞内部结构和复杂的生物组织是非常重要的。

4.实时观察：LS-CFM可以实时地观察样本，能够捕捉到细胞和组织的动态变化。

5.多光标标记：通过使用不同的荧光标记剂，LS-CFM可以同时观察多个分子或细胞器的位置和相互作用。

LS-CFM的应用生物医学研究LS-CFM在生物医学研究中扮演着重要的角色。

它可以用于观测细胞分裂、细胞迁移、细胞凋亡以及细胞器的分布和运动。

.b ž激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。

它是在荧光ž显微镜成像基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像, 成为形态学﹑分子细胞生物学﹑神经科学﹑药理学﹑遗传学等领域新一代强有力的研究工具。

同时,激光扫描共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。

不仅可对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的“光学切片”; 进行单标记或双标记细胞及组织标本的荧光定性定量分析; 还可用于活细胞生理信号, 离子含量的实时动态分析监测, 粘附细胞的分选, 细胞激光显微外科和光陷阱技术等。

可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。

- www 生物秀-专心做生物w ww .b b i o o .c o mIntroductionžLSCM 是一种高科技显微镜ž荧光显微镜成像为基础，加装了激光扫描装置, 计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。

ž无损伤的“光学切片”ž细胞三维立体机构ž实时动态分析监测激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。

生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mž光学显微镜部分ž激光发射器ž扫描装置ž光检测器ž计算机系统( 包括数据采集, 处理, 转换, 应用软件)ž图像输出设备LSCM 的基本组成生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mLSCM 的原理激光光源：激光扫描束经照明针孔形成点光源, 普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源, 标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。

而LSCM 以激光为光源, 激光具有单色性强﹑方向性好﹑高亮度﹑相干性好等优点, 可以避免普通显微镜的缺点。

激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscopy, LSCM)成像技术目的结构是用荧光探针标记的，都可以用激光共聚焦显微镜观察形态学研究：组织细胞标本的抗原免疫荧光检测，凋亡检测…分子生物学：荧光原位杂交对DNA和RNA定量，外源基因在真核细胞的表达及定位，蛋白质相互作用(FRET)…活细胞动态荧光测量：细胞内Ca2+、Cl-等离子的动态分布及定量，细胞连接间的信息传递(FRAP)…成像基础：荧光成像主要原理：利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测。

z sections = imagesyzx激光共聚焦显微镜的设计特点：Laser：经过照明针孔后形成点光源，光源方向性强、发散小、亮度高、颜色纯、单色性强Beamsplitter(光束分离器)：将样品激发荧光与其他非信号光线分开。

Pinhole (照明针孔和探测针孔)：最大限度的阻挡非聚焦平面以及聚焦平面上非焦点斑以外的散射光，以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于样品焦点位置PMT (PhotoMultiplier Tube, 光电倍增管)：检测设定范围内的光信号，并将光信号转换成电信号，相当于相机中的CCD或胶卷PMT只能检测到信号的强弱，不能记录信号的颜色，记录的结果通过信号强度和填充颜色表示PMT单位用电压值V表示，数值越大代表信号倍增越大，提高倍增会同时增加图像的正常信号强度和噪声信号强度，使图像的信噪比下降激光扫描共聚焦与传统荧光显微镜的主要区别： 激光扫描共聚焦显微镜只接收共焦点处荧光。

普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光，来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收。

影响来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率（焦平面以外的荧光结构模糊、发虚）。

CCDPMTFV1000 (Olympus)：多个荧光通道(405, 458, 488, 515, 543, 633)，可同时检测多个荧光标记一个透射光通道，透射光图像为非共焦图像激光扫描共聚焦显微镜的主要应用No.1 免疫荧光染色(单标、双标、多标)细胞浆、核、膜抗原的分布、半定量分析 几种抗原的共定位抗原与细胞器的共定位抗原转位No. 2 荧光标记活细胞内成分：氯离子荧光探针：MQAE[N -(Ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium bromide]细胞内pH的荧光探针：BCECF AM[2’,7’-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein, acetoxymethyl ester]活性氧荧光探针：DCFH-DANO荧光探针：DAF-FM DA[3-Amino,4-aminomethyl-2’,7’-difluorescein, diacetateNo. 3 荧光标记各种亚细胞结构：细胞内微丝：荧光染料标记的毒蕈肽(phalloidin)细胞膜荧光探针：DiI 即DiIC18(3) [1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，红]和DiO即DiOC18(3) [dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate，绿] 内质网探针：荧光标记的glibenclamide高尔基体探针：荧光标记的C5-ceramide。

荧光显微镜是一种使用荧光物质和特定波长的光源来观察样本的显微镜。

荧光显微镜可以分为以下几类：1. 荧光透射显微镜（Fluorescence Transmission Microscope）：这是最常见的荧光显微镜类型，它使用荧光染料标记样本，然后通过照射特定波长的光源来激发荧光染料，并通过透射光来观察样本。

2. 荧光反射显微镜（Fluorescence Reflection Microscope）：在这种类型的显微镜中，光源从上方照射样本，而观察是通过检测反射光中的荧光信号来进行的。

这种方法适用于厚样本或需要从不同角度观察的样本。

3. 荧光共聚焦显微镜（Fluorescence Confocal Microscope）：共聚焦显微镜使用一个或多个pinholes（小孔）来聚焦样品的光线，并只允许来自特定平面的光通过，这样可以获得清晰的、无层叠的图像。

这种显微镜非常适合观察厚样本或想要获取深层结构的样本。

4. 荧光扫描显微镜（Fluorescence Scanning Microscope）：这种显微镜通过扫描光源和探测器在样本上移动，以获取整个样本区域的荧光信息。

这种方法可以用于获取高分辨率的图像，但可能需要较长的成像时间。

5. 荧光点扫描显微镜（Fluorescence Point Scanning Microscope）：这种显微镜通过逐点扫描样本来获取图像，每个点的光源和探测器都非常接近，因此可以获得高分辨率的图像。

这种方法通常用于成像较小的样本或特定区域。

6. 实时荧光显微镜（Real-time Fluorescence Microscope）：这种显微镜可以实时观察样本的荧光变化，非常适合观察动态过程，如细胞呼吸、细胞通信等。

每种类型的荧光显微镜都有其特定的应用和优势，选择合适的荧光显微镜取决于研究的需求和样本的特性。

激光扫描共聚焦荧光显微镜原理激光扫描共聚焦荧光显微镜原理一、概述激光扫描共聚焦荧光显微镜（LSCM）是一种高分辨率、高灵敏度的生物成像技术，它通过激光和荧光探针相互作用，实现对生物样品的高清晰成像。

本文将详细介绍LSCM的原理。

二、激发荧光信号的原理LSCM是基于荧光成像技术的，因此了解荧光信号的产生机制非常重要。

在LSCM中，通常使用的探针为有机染料或蛋白质标记物。

这些探针受到激发波长（通常为紫外线或蓝色激光）后会被“激发”到一个高能态，并在短时间内返回基态时释放出能量，即产生荧光信号。

三、扫描共聚焦显微镜系统结构1. 激光器：LSCM中通常使用的激光器为氩离子激光器和氦氖激光器。

它们可以提供不同波长的激发波长，以满足不同探针的需求。

2. 光学系统：光学系统包括激光束聚焦、激光扫描和探测系统。

其中，激光束聚焦是将激光束聚焦到样品上的过程，通常使用的是物镜；激光扫描是将激光束在样品表面移动的过程，通常使用的是振镜；探测系统用于收集荧光信号，并将其转化为数字信号。

3. 样品台和样品固定装置：样品台用于放置样品，通常可以进行XYZ三向移动。

样品固定装置可以确保样品不会在成像过程中移动或震动。

4. 计算机：计算机用于控制整个系统，并处理、分析和显示成像数据。

四、扫描共聚焦显微镜成像原理1. 感应体积：感应体积是指在LSCM中能够产生荧光信号的三维区域。

它由两个因素决定：一个是物镜的数值孔径（NA），另一个是激发波长。

感应体积越小，则分辨率越高。

2. 扫描方式：LSCM采用的是点扫描或线扫描方式。

点扫描方式是将激光束聚焦到样品上的一个点，然后在样品表面移动，重复这个过程直到整个样品成像完毕；线扫描方式是将激光束聚焦成一条线，然后在样品表面移动，重复这个过程直到整个样品成像完毕。

3. 探测方式：LSCM采用的是共聚焦探测方式。

共聚焦探测可以减少背景信号和散射信号的干扰，提高成像信噪比。

五、LSCM应用LSCM广泛应用于生物学研究中，如细胞生物学、神经科学、分子生物学等领域。

荧光显微镜小广告O(∩_∩)O~川大细胞4252972501.荧光技术（1）荧光原理荧光分子吸收入射光能量后，电子由基态跃迁到激发态。

激发态电子不稳定，会自发跃迁回基态，并辐射荧光。

辐射荧光λ＜入射光λ。

（2）荧光探针①荧光素如：罗丹明B②荧光蛋白如：绿色荧光蛋白（GFP）（3）荧光分类①自发荧光：如叶绿素、血红素等荧光分子经紫外线照射后，能够自发辐射红色荧光。

②诱发荧光：物质经荧光染料染色后，再经紫外线照射，进而辐射荧光。

2.荧光显微镜（1）荧光显微镜概述荧光显微镜是指利用短波长电磁波为光源，激发样品辐射荧光，之后利用样品产生的自发荧光或诱发荧光，对细胞内特异性蛋白质进行定性与定位研究的装置。

（2）荧光显微镜的特殊构件①石英透镜②滤光片系统激发滤片，位于光源与样品之间，滤过可见光，只允许作为光源的紫外光通过。

阻断滤片，位于物镜与目镜之间，只允许荧光分子产生的荧光通过。

（3）荧光显微镜的特点①优点：荧光显微镜主要用于定性、定位研究细胞内特异性蛋白质。

可以观察活细胞。

②缺点：无法排除来自样品焦平面以外的荧光，使得图像的反差与分辨率降低。

3.激光扫描共焦显微镜（1）激光扫描共聚焦显微镜概述激光扫描共焦显微镜是指以激光为光源，对样品进行逐点、逐行、逐面扫描成像的装置。

其物镜与聚光镜共焦点，以提高分辨率。

通过调节焦平面即可获得样品不同层次的图像，通过计算机分析和模拟，可以构筑样品的三维图像。

（2）激光扫描共焦显微镜的成像原理①光源为激光，经双色镜反射后，通过物镜汇聚于样品某一焦点，激发荧光。

样品所激发的荧光经透镜汇聚成像，通过共焦小孔被检测器检出。

②物镜与聚光镜共焦点，使得只有从样品焦平面发出的荧光聚焦成像，其他部分的激发荧光不能通过共焦小孔，检测器不能检出。

（3）激光扫描共焦显微镜的特点①分辨率比普通荧光显微镜提高1.5倍。

②通过改变焦平面，可以获得样品不同层次的图像，从而可以构筑样品的三维图像。

③可以实现长时间活细胞动态观察。