下载文档原格式
激光共聚焦使用方法嘿，朋友们！今天咱就来聊聊激光共聚焦这玩意儿的使用方法。
激光共聚焦啊，就好比是一个超级厉害的微观探险家！你想啊，它能带着我们深入到那些小小的细胞世界里，去发现好多神奇的东西呢。
首先呢，得把设备准备好呀，就像战士要先磨好自己的刀一样。
确保仪器干净整洁，各部件都正常工作。
然后呢，把咱要观察的样本放好，这可不能马虎，得放得稳稳当当的。
接下来就是调整各种参数啦。
这可不能瞎调，得根据实际情况来。
就像调收音机的频率似的，得找到最合适的那个点。
激光的强度啦、扫描的速度啦，都得仔细琢磨。
要是调得不合适，那看到的图像可就不清晰啦，那不就白折腾啦！当一切都准备就绪，就可以开始扫描啦。
看着那激光束在样本上扫来扫去，就好像是在给细胞们做按摩一样。
嘿嘿，这时候你就等着那些神奇的图像出现在屏幕上吧。
你说这激光共聚焦神奇不神奇？它能让我们看到平时看不到的细节，那些细胞里的小秘密都能被它给揪出来。
这就好比我们有了一双超级眼睛，能看穿一切！在使用的过程中，可别粗心大意哦。
要时刻关注着图像的质量，要是有啥不对劲的地方，赶紧调整。
就像开车一样，得时刻注意路况，随时调整方向。
而且哦，使用完了也得好好收拾。
把仪器清理干净，该关的关了，该保存的数据保存好。
可别用完就不管啦，那下次再用的时候可就麻烦咯。
总之呢，激光共聚焦的使用可没那么简单，但也绝对不是什么难事。
只要咱用心去学，用心去做，肯定能把它用得溜溜的。
让我们一起用激光共聚焦去探索那些微观世界的奇妙吧！难道不是吗？。
激光共聚焦显微镜原理激光共聚焦扫描显微技术（Confocal laser scanning microscopy）是一种高分辨率的显微成像技术。
普通的荧光光学显微镜在对较厚的标本（例如细胞）进行观察时，来自观察点邻近区域的荧光会对结构的分辨率形成较大的干扰。
共聚焦显微技术的关键点在于，每次只对空间上的一个点（焦点）进行成像，再通过计算机控制的一点一点的扫描形成标本的二维或者三维图象。
在此过程中，来自焦点以外的光信号不会对图像形成干扰，从而大大提高了显微图象的清晰度和细节分辨能力。
图1. 共聚焦显微镜简化原理图图1是一般共聚焦显微镜的工作原理示意图。
用于激发荧光的激光束(Laser)透过入射小孔(light source pinhole)被二向色镜(Dichroic mirror)反射，通过显微物镜(Objective lens)汇聚后入射于待观察的标本(specimen)内部焦点(focal point)处。
激光照射所产生的荧光(fluorescence light)和少量反射激光一起，被物镜重新收集后送往二向色镜。
其中携带图像信息的荧光由于波长比较长，直接通过二向色镜并透过出射小孔(Detection pinhole)到达光电探测器(Detector)（通常是光电倍增管（PMT）或是雪崩光电二极管（APD）），变成电信号后送入计算机。
而由于二向色镜的分光作用，残余的激光则被二向色镜反射，不会被探测到。
图2. 探测针孔的作用示意图图2解释了出射小孔所起到的作用：只有焦平面上的点所发出的光才能透过出射小孔；焦平面以外的点所发出的光线在出射小孔平面是离焦的，绝大部分无法通过中心的小孔。
因此，焦平面上的观察目标点呈现亮色，而非观察点则作为背景呈现黑色，反差增加，图像清晰。
在成像过程中，出射小孔的位置始终与显微物镜的焦点(focal point)是一一对应的关系（共轭conjugate）,因而被称为共聚焦（con-focal）显微技术。
激光共聚焦显微镜工作原理
激光共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscopy, LSCM）是一种常用的高分辨显微成像技术，其工作原理如下：
1. 激光：首先，选择合适波长的激光器产生单色的激光束，常见的波长有488nm（常用于激发荧光染料）和633nm（常用
于激发受体标记染料）等。
2. 激光聚焦：激光通过一系列透镜逐层聚焦，使得激光束的直径变窄，激光的光斑能够更加集中。
透镜组合使光束对准一个平面。
3. 共聚焦点：激光经过透镜后，由于透镜组合以及光路设定，激光束的最终焦点被限制在一个非常小的空间区域内，称为共聚焦点。
共聚焦点是激光在待观察样品中最小的光斑。
4. 扫描：共聚焦点在样品上以二维或三维方式进行扫描。
通常采用高速马达驱动镜片组件，使共聚焦点在样品表面来回扫描。
扫描方式包括线扫描和点扫描等形式。
5. 信号检测：样品中的荧光或反射光经过共聚焦点时产生的光信号由探测器收集，并转换为电信号。
常用探测器包括光电倍增管（photomultiplier tube, PMT）或光电二极管（photodiode）等。
6. 图像重建：通过对检测到的信号进行处理和计算，可以将扫描到的信号重建成具有空间分辨率的二维或三维图像。
利用激
光聚焦特性和扫描方式，可以获取样品的各种层面和不同方向的断面图像。
总之，激光共聚焦显微镜利用激光束的聚焦特性、样品的扫描和信号的检测，实现了高分辨的光学显微成像。
它可以在样品内实现特定深度的光学切片，提供空间分辨率较高的三维图像。
它在生命科学、材料科学、纳米科学等领域中广泛应用。
模块九激光共聚焦技术1. 实验目的让学生了解激光共聚焦显微镜硬件组成，掌握激光共聚焦显微镜常用的基本操作及注意事项，能够熟练、准确地设计光路，重点掌握激光共聚焦显微镜测定细胞荧光信号动态变化的方法以及钙指示剂（fluo-3/AM）标记Ca2＋的基本原理与方法，了解激光共聚焦显微镜在生物学上的应用。
2. 实验原理激光扫描共聚焦显微镜是采用激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机控制来进行数字化图像采集和处理的系统。
激光扫描共聚焦显微镜系统主要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。
激光扫描共聚焦显微镜基本结构（1）扫描模块扫描模块主要由针孔光栏（控制光学切片的厚度）、分光镜（按波长改变光线传播方向）、发射荧光分色器（选择一定波长范围的光进行检测）、检测器（光电倍增管）组成。
荧光样品中的混合荧光进入扫描器，经过检测针孔光栏、分光镜和分色器选择后，被分成各单色荧光，分别在不同的荧光通道进行检测并形成相应的共焦图象，同时在计算机屏幕上可以显示几个并列的单色荧光图象及其合成图象。
（2）荧光显微镜系统激光扫描共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体与常规荧光显微镜相同，但又有其特点：需与扫描器连接，使激光能进入显微镜物镜照射样品，并使样品发射的荧光到达检测器；需有光路转换装置，即汞灯与激光转换，同时汞灯光线强度可调。
（3）常用激光器激光扫描共聚焦显微镜使用的激光光源有单激光和多激光系统，常用的激光器包括以下三种类型：多谱线Ar离子激光器（氩离子激光器）：发射波长为458 nm、477 nm、488 nm、514 nm的蓝绿光；He-Ne激光器（氦氖激光器）：发射波长为543 nm的绿光和633 nm的红光；UV激光器（紫外激光器）：发射波长为351 nm、364 nm的紫外光。
（4）辅助设备风冷、水冷冷却系统及稳压电源。
激光扫描共聚焦显微镜的基本工作原理：激光扫描共聚焦显微镜的基本工作原理是首先由激光器发射的一定波长的激发光，光线经放大后通过扫描器内的照明针孔光栏形成点光源，由物镜聚焦于样品的焦平面上，样品上相应的被照射点受激发而发射出的荧光，通过检测孔光栏后，到达检测器，并成像于计算机监视屏上。
