激光共聚焦显微镜的样本

第29卷第4期2010年8月电子显微学报Journal of Chinese Electron Microscopy SocietyVol.29，No.42010-08文章编号：1000-6281（2010）04-0399-04激光共聚焦显微镜样品制备方法（二）———组织切片样品边玮（中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，上海200031）摘要：应用激光共聚焦显微镜技术对荧光标记的组织切片样品进行三维观察成像是生物学研究的常规手段。

本文主要介绍实验室制备用于激光共聚焦显微镜成像的冷冻组织切片及免疫荧光标记过程。

关键词：冷冻组织切片；免疫荧光；激光共聚焦显微镜成像中图分类号：Q336；TG115.21+5.3文献标识码：A收稿日期：2010-05-07作者简介：边玮（1964－），女（汉族），吉林蛟河人，高级工程师.E-mail ：weibian@.应用于激光共聚焦显微镜的组织切片样品多采用冷冻组织切片，可尽量保持组织样品的抗原活性。

组织采集后，经固定、冷冻包埋、冷冻切片、晾片，进行免疫荧光抗体标记。

1组织的采集、固定和保存不同来源的组织可依据实验条件和实验目的而采用不同的固定和保存方法。

实验室通常采用液氮冷冻法和多聚甲醛（PFA ）固定法。

液氮冷冻法：采取新鲜组织后，即可放入液氮中保存。

多聚甲醛固定法：小鼠、大鼠等实验动物经生理盐水和4%PFA 灌流，采取组织，组织块尽量小于1cm ˑ1cm ˑ1cm ，置于4%PFA 中进行后固定，后固定的时间可根据组织块的大小和致密程度而调整，可以4ħ固定过夜，或室温1 4h 。

之后，用0.01mol /L PBS 缓冲液洗3次，每次10 30min 。

在20%蔗糖中4ħ浸泡1h 以上，待组织块下沉后，即可进行冷冻切片。

组织块可置于4ħ冰箱保存于20%蔗糖（含0.05%NaN 3）中，一个月内完成切片。

表达荧光蛋白的实验动物组织，可遵循以上方法处理样品。

非损伤性导入法：在正常的生理条件下加入Ca2+荧光探针与植物细胞共同孵育, 使探针渗入到细胞内的方法。

在培养液中加人荧光探针和增强膜透性的药物, 如去垢剂digitonin(毛地黄甘)、表面活性剂Pluronic F-127等, 药物使细胞膜通透性增强, 利于荧光探针的导入【1】。

周平等发现：在PH5.6条件下，绿豆、花生、水稻、烟草等细胞原生质体用5~10um ol/L Indo-1-K+或Fura-2-AM共同孵育1.5h,荧光探针可导入部分原生质体【2】。

样品的制备1：样品制备是上机检测前的关键步骤。

样品需经荧光探剂标记( 单标、双标、三标) 。

标本可以是固定的或活的组织, 也可以是固定的或活的贴壁培养, 细胞应培养在Confocal 专用小培养皿或盖玻片上, 悬浮细胞, 甩片或滴片后, 用盖玻片封片。

样品的最大厚度约1~ 2 mm, 使用的盖玻片厚度应小于0117mm, 载玻片厚度应在018~ 112 mm 之间, 而且表面光洁, 厚度均匀, 没有明显的干扰荧光。

固定样品常用封片剂进行封片,常用PH815- 9 的PBS 配制的甘油封片。

样品准备2：样品的最大厚度大约1~2mm(10×/ 0.4 物镜), 它取决于物镜的数值孔径(NA) 、物镜的工作距离、激光的穿透力以及样品的透明度。

一般要求是单层贴壁细胞, 可以是经荧光探针标记(单标、双标、三标)固定的或活的组织; 固定的或活的贴壁培养细胞(Confocal 专用小培养皿, 盖玻片); 用盖玻片封片的经甩片或滴片后的悬浮细胞。

对于非贴壁细胞的粘贴, 一般常用的粘贴剂有多聚赖氨酸﹑伴刀豆球蛋白﹑cell- tak﹑vectabond﹑琼脂凝胶等。

选择粘贴剂的标准是: 不影响实验目的, 对标本无损害[1]。

激光扫描共聚焦显微镜的样品制备技术3：3.1 取材组织标本：包括活检标本、手术切除标本、动物模型标本及尸检解剖标本等，应在标本离体后立即冰冻切片或贮存于-70℃冰箱备用，以充分保存组织的抗原性。

激光共聚焦显微镜的原理和应用1. 引言激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种高分辨率的显微镜技术，已经广泛应用于生物学、医学和材料科学等领域。

本文将介绍激光共聚焦显微镜的原理和应用。

2. 原理激光共聚焦显微镜通过激光束的共聚焦和通过物体的反射或荧光发射来实现图像的采集。

2.1 激光共聚焦•通过透镜来聚焦激光束•聚焦点在样本表面上产生光斑•样本反射或发射出来的光再次通过透镜，聚焦到探测器上•透镜的位置可以移动，可以扫描整个样本2.2 反射和荧光信号的采集•激光束照射到样本上，经过反射或荧光发射•光学系统收集并聚焦这些发射的光•通过探测器记录下发射光的强度和位置•通过移动透镜和探测器，可以获得样本的三维图像3. 应用激光共聚焦显微镜在许多领域都得到了广泛的应用，以下是其中的几个典型应用。

3.1 细胞生物学•可以观察细胞的形态和结构•可以追踪细胞内的生物分子运动•可以观察细胞的生物化学过程3.2 分子生物学•可以观察和定量细胞器的分布和聚集情况•可以观察和测量分子的扩散速率•可以研究蛋白质的合成和代谢过程3.3 医学研究•可以观察和诊断组织和器官的病理变化•可以研究疾病的发生和发展机制•可以评估治疗方法的有效性和副作用3.4 材料科学•可以观察材料的微观结构和表面形貌•可以研究材料的热力学和力学性质•可以评估材料的耐久性和可靠性4. 总结激光共聚焦显微镜是一种高分辨率的显微镜技术，通过激光束的共聚焦和物体的反射或荧光发射来实现图像的采集。

它在细胞生物学、分子生物学、医学研究和材料科学等领域都有着广泛的应用。

利用激光共聚焦显微镜，科研人员可以观察和研究生物和材料的微观结构、功能和相互作用，为科学研究和应用提供了强大的工具。

激光共聚焦显微镜的样本激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy，简称LSM）是一种高分辨率的光学显微镜技术，使用激光束扫描样本而不使用传统的白光光源。

这种显微镜技术常用于生物学、医学和材料科学中。

以下将介绍几个常见的激光共聚焦显微镜样本。

第一个样本是细胞样本。

细胞是生物界最基本的单位，通过激光共聚焦显微镜观察细胞能够提供高分辨率的细胞内部结构信息。

例如，可以观察到细胞核、细胞质、细胞骨架等结构，同时还可以研究细胞内各种生物分子的动态过程，如细胞分裂、细胞凋亡等。

第二个样本是组织样本。

组织是由大量细胞组成的结构，通常包含多种细胞类型和细胞之间的间质。

使用激光共聚焦显微镜观察组织样本可以显示细胞在组织中的分布、空间排列以及细胞与细胞之间的相互作用。

例如，可以研究组织中细胞的分化过程、组织损伤后的修复过程等。

第三个样本是活体样本。

激光共聚焦显微镜可以实时观察活体样本的结构和功能。

通过使用特定的染料，可以观察到活体样本中特定细胞类型或生物分子的分布和活动。

例如，可以观察到神经元在活体大脑中的连接和传导过程，研究神经系统的功能。

此外，还可以观察到血管、淋巴管等在活体组织中的分布和动力学过程，研究血液循环和淋巴系统的功能。

第四个样本是材料样本。

激光共聚焦显微镜可以用于研究材料中的微观结构和表面形貌。

例如，可以观察金属材料、陶瓷材料、高分子材料等的晶体结构、纳米颗粒的分布和形态等。

此外，还可以观察材料的表面形貌，如表面粗糙度、孔隙结构等，为材料科学研究提供重要的信息。

总之，激光共聚焦显微镜可以应用于各种样本的观察和研究，包括细胞样本、组织样本、活体样本和材料样本。

这种高分辨率的显微镜技术为科学研究和工程实践提供了强大的工具。

一、实验目的1. 了解激光共聚焦显微镜的基本原理和操作方法。

2. 掌握细胞激光共聚焦实验的步骤和注意事项。

3. 通过实验观察细胞内部结构，加深对细胞生物学知识的理解。

二、实验原理激光共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM）是一种利用激光束扫描样品，并通过共聚焦成像原理获得高分辨率、高对比度图像的显微镜。

其基本原理是利用激光束经照明针孔形成点光源，对样品进行逐点扫描，然后通过探测针孔收集反射光，最终形成共聚焦图像。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：细胞爬片、荧光染料（如DAPI、FITC等）、激光共聚焦显微镜、细胞培养箱、超净工作台等。

2. 实验仪器：激光共聚焦显微镜、荧光显微镜、图像采集系统、计算机等。

四、实验步骤1. 细胞爬片制备：将细胞培养于载玻片上，待细胞生长至一定密度后，用无菌PBS缓冲液洗涤细胞，并固定封片。

2. 染色：将固定封片置于荧光显微镜下，用荧光染料对细胞进行染色。

本实验采用DAPI染色细胞核，FITC染色细胞质。

3. 共聚焦显微镜操作：将染色后的细胞爬片置于共聚焦显微镜载物台上，调整物镜焦距，使样品聚焦。

4. 图像采集：设置合适的激光波长和光圈，调整曝光时间，进行图像采集。

5. 图像分析：利用图像采集系统对采集到的图像进行处理和分析，观察细胞内部结构。

五、实验结果与分析1. 细胞核与细胞质的荧光分布：通过共聚焦显微镜观察到，DAPI染色的细胞核呈蓝色荧光，FITC染色的细胞质呈绿色荧光。

结果显示细胞核位于细胞中央，细胞质分布在细胞核周围。

2. 细胞内部结构：通过共聚焦显微镜观察，发现细胞内部存在线粒体、内质网、高尔基体等细胞器，这些细胞器在荧光图像中呈现不同的颜色。

3. 细胞形态：通过共聚焦显微镜观察，发现细胞形态规则，呈椭圆形。

六、实验结论本次实验成功利用激光共聚焦显微镜观察了细胞内部结构，获得了高分辨率、高对比度的图像。

第29卷第2期2010年4月电子显微学报Journal of Chinese Electron Microscopy SocietyVol-29，No.22010-04文章编号：1000-6281（2010）02-0185-04激光共聚焦显微镜样品制备方法（一）———细胞培养样品余礼厚（中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，上海200031）摘要：随着激光共聚焦显微镜在生物学研究中的广泛应用，绿色荧光融合蛋白能够提供蛋白质在细胞体内的精确时空信息。

因此免疫荧光样品的制备也成为基本的细胞生物学实验方法。

本文主要介绍在培养细胞中表达绿色荧光融合蛋白及免疫荧光样品的制备过程。

关键词：绿色荧光蛋白；细胞培养；免疫荧光；激光共聚焦显微镜中图分类号：Q336文献标识码：A收稿日期：2010-03-20作者简介：余礼厚（1982－），男（汉族），四川自贡人，博士，E-mail ：lhyu@.随着生物学研究的不断深入，越来越多的研究要求在细胞体内（in vivo ），甚至是动物体水平上研究蛋白质功能或动态变化。

而随着检测设备的提升、各种显微技术的发展和标记手段的提高，使得研究者能够迅速、准确地观察到蛋白质在细胞内的表达情况和定位。

通过激光共聚焦显微镜观察荧光标记细胞内的蛋白质和分子，为生物学的研究提供了更直观的观测手段。

因此免疫荧光样品的制备也成为生物学研究中的基本技术方法。

鉴于生物体内的复杂多样性，制备免疫荧光样品的方法也存在一些差异。

本文主要介绍构建绿色荧光融合蛋白表达载体，并在培养细胞中表达绿色荧光融合蛋白及免疫荧光样品的制备过程。

1绿色荧光融合蛋白表达载体的构建绿色荧光蛋白（green fluorescent protein ，GFP ）及其突变体能在各种不同的生物系统中表达，这对细胞生物学的研究具有重要意义［1］。

而荧光蛋白的折叠能力及其同细胞内蛋白的融合能力，使研究者能直接在细胞体内观察到蛋白质的特性。

激光共聚焦使用步骤总结共聚焦实验步骤1.提前将PBS放在37度水浴锅中。

2.将小皿从细胞培养箱中取出，弃掉培养液，用PBS洗2——3次，轻晃几下即可。

注，此步加PBS时一定要轻一点，否则细胞会漂浮起来。

3.弃掉PBS后加1ml 4%多聚甲醛，固定细胞，室温静置30min。

4.弃掉后加PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃。

5.弃掉后加0.1%Triton-X100 1ml，室温透膜静置15min。

6.弃掉后加PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃。

7. 5%PBS脱脂乳，封闭1h，可在摇床上轻晃，也可以室温静置。

8.一抗1h，可在摇床上轻晃。

9. PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃10.二抗1h。

避光可在摇床上轻晃11. PBS，1ml，3次，5min/次避光，可在摇床上轻晃12.DAPI染色15min避光，室温静置13. PBS，1ml，3次，5min/次，避光，可在摇床上轻晃14.激光共聚焦显微镜观察。

激光共聚焦显微镜使用步骤1.打开五个绿色按钮和一个钥匙2.将物镜调至最低点。

3.电脑开启，选择TCS_User4.双击LAS AF 注意，双击软件后就耐心等待不要碰显微镜上任何东西，此时系统正在校准数据。

5.点击OK6.选择configuration7.点击像“注射器”一样的图案Laser，此时后便会出现一个画面，四个小格405 Diode，Ardon，HeNe543，HeNe633和一个尺子一样的长线Stand by。

8.点击选择前三个小格405 Diode，Ardon，HeNe543，将Stand by拉到45左右。

9.选择Acquire10.先确定右侧区域油镜型号是Objective：63×1.4，如果不是点击下拉菜单选择。

11.选择seq，最下面会弹出Sequential Scan区域，该区域作用是根据自己实验需求选择相应激光通道，其中“＋”代表增加激光通道，“－”代表删除激光通道。

电子显微学报J.Chin.Eleetr.Microse.Soc.第29卷图I气体CO:冷冻装置。

Fig.1Gas C02frozen equipment.镜下操作后,置于干冰上(临时无干冰,也可置于一80℃冰箱,待冷冻完全后,将样品移至冷冻切片机中,温度平衡后,将样品从冷冻包埋模具中取出,进行冷冻切片。

冷冻包埋模具见图2。

图2冷冻包埋模具。

Fig.2Frozen embedding mold.液氮冷冻法:成年小鼠和大鼠的脑及稍大一些的组织块也可采用此方法冷冻。

将组织块置于样品台的OCT中,为防止组织块爆裂,先在液氮中迅速浸提几次,时间从1s开始逐渐增加,直至样品温度与液氮温度平衡,之后移至冷冻切片机中,使温度与切片机箱体温度一致,进行冷冻切片。

直接冷冻法:将样品直接粘着在涂有OCT的样品台上,于冷冻切片机(箱体温度在一20℃以下中直接冷冻。

3冷冻组织切片的免疫荧光标记将冷冻组织切片从一80℃冰箱中取出,室温放置10min,待切片回温并干燥,浸于PBS中10min 洗去OCT,可以无需Triton处理,即可进行免疫荧光抗体标记,操作步骤与培养细胞反应方法相同口]。

反应在避光湿盒中进行,反应结束时用无荧光封固剂封片,4oC保存。

先用荧光显微镜观察,确认标记成功,移至激光共聚焦显微镜扫描成像。

4荧光染料及荧光蛋白传统应用于荧光标记的染料如异硫氰酸荧光素(fluoreseinisothiocyanate,FITC,ex490nm/em520 nm、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC,ex550nm//em 620am、罗丹明(Rhodamine,ex560nm/em540~ 660nnl、四甲基罗丹明(tetramethyl rhodamine, TMR,ex570nm/em595—600nm、德克萨斯红(Texas red,ex592nm/em610rim、氨甲基香豆素(Aminomethylcoumarin aceticacid,AMCA,ex345 nm/em425am等,结合激光共聚焦显微镜技术的发展,这些经典的荧光染料逐渐被层出不穷的新的荧光染料所替代。