石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
1、组织得采集、固定与保存:
采取组织后,
方法一:4％多聚甲醛(4％ＰＦＡ)4︒Ｃ固定1小时(根据组织大小与致密程度调整固定时间)或过夜
方法二:采用boｕｉn’s固定ＲT 2h(6—8dｔeｓis)or RＴ过夜(成年tesiｓ)
PBS缓冲液洗三次,每次5ｍin,4︒C保存于7０%乙醇中。
２、组织得包埋、切片、展片及保存::
固定后得样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明,５2－54︒C石蜡包埋,常规切片,切片厚4—１０μm,贴于处理过得干净载玻片上,37︒C烤片过夜,之后收集于载片盒中,RT密封保存。
石蜡包埋:
保存于４︒Ｃ70％乙醇中得组织样品
↓
80％乙醇1５ｍin
↓
95%乙醇15 miｎ
↓
1０0%乙醇15mｉｎ⨯ 2
↓
1/2乙醇１／２二甲苯15 ｍin
↓
二甲苯透明5-１0 min
↓
1／２二甲苯１/2石蜡３0 min
↓
石蜡(1) 1。5hｒ
↓
石蜡(2) 1.5－２.5hr
↓
石蜡(3) 包埋
↓
RT保存
3、石蜡组织切片得免疫组化方法:
密封保存于RT得组织切片
↓
二甲苯(1) 20 min
↓
二甲苯(2)20ｍin
↓
100％乙醇20ｍin
↓
95％乙醇10 min
↓
8０％乙醇10miｎ
↓
通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈
↓
切片在ＰBS中浸泡 5 ｍin＊2
↓
0.4%Tritonx RＴ10 mｉn
↓
切片在PＢS中浸泡 5 min＊3
３％H２O2 RT １０ｍin
切片在PBS中浸泡５ｍｉn*3
0、25％胰酶RT １0min
切片在PBS中浸泡 5 min*３
Blocking bｕｆfｅr(3%BSA+5%NGS＋０、2%Ｔritｏnx—１０0 in PBS) ＲT 60mｉn
倾去blｏｃking buffｅｒ,勿洗
一抗4 C overnighｔｉn blｏckinｇbuffeｒ
取出切片复温1h,切片在PBＳ中浸泡 5 mｉn*３
二抗iｎblocking ｂufｆer GＡR1:２00 (GＡM1:100),R Ｔ 1h
切片在PBS中浸泡５min*3
DAB显色５—１0min(５0微升A＋５0微升B＋９0０微升ＰBS+5微升3％H2Ｏ2)
如果就是增强型DＡB只要1ｍｉn即可。
切片浸入PBS终止显色,ＨE衬染1s,
玻片架放入泡沫盒,流水冲洗15mｉn,肉眼瞧到淡淡得紫色即可停止。
若颜色太深,可用0、１-０、5％盐酸乙醇分色1～2秒钟(或更久)
脱水８5％乙醇5miｎ
↓
95％乙醇5ｍin
↓
无水乙醇 5 miｎ
↓
无水乙醇５min
↓
二甲苯(１) 10min
↓
二甲苯(２) 10ｍiｎ
↓
中性树胶封片,室温干燥保存4、石蜡组织切片得免疫荧光方法:
密封保存于ＲT得组织切片
↓
二甲苯(1) ２0 miｎ
↓
二甲苯(2) 20 ｍｉn
↓
１0０%乙醇２0ｍin
↓
95％乙醇1０mｉｎ
↓
8０％乙醇１0 ｍin
↓
通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈
↓
切片在PＢS中浸泡５min＊2
↓
０。4％TｒiｔonｘＲＴ１0ｍiｎ
↓
切片在PBS中浸泡 5 min＊3
切片在PBＳ中浸泡 5 min＊3
０、２５％胰酶RＴ10min
切片在PBS中浸泡 5 mｉn＊3
Blｏcking ｂuｆfeｒ(3％BＳA+5％NGS+0、２％Tritｏnx-100 in ＰBS) RT 60miｎ
倾去ｂｌｏｃking buffer,勿洗
一抗4︒C ｏｖerｎigｈｔin blocking buffer
取出切片复温1h,切片在PBS中浸泡 5 min＊３
荧光二抗in blockiｎg buffer GAR－cy3 1:1000,GAM-488 １:１000RT 1ｈ
DAPI(1:100０请根据二抗说明稀释二抗)
切片在ＰBS中浸泡 5 miｎ*3
mｏｉｌ封片,避光4︒C保存
