免疫荧光实验步骤大全(精华版)

细胞免疫荧光I、步骤：一、固定：PBS 5min×3次振荡洗涤制作好的细胞爬片。

固定液覆盖细胞，RT 静置15min。

PBS 5min×3次振荡洗涤。

二、通透化：通透液覆盖细胞，RT 静置30min。

PBS 5min×3次振荡洗涤。

三、封闭：封闭液覆盖标本表面37℃孵育1h。

四、一抗孵育：一抗以合适浓度稀释PBS，覆盖标本表面。

4℃孵育过夜，第二天37℃复温1h。

PBS 5min×3次振荡洗涤。

五、二抗孵育：FITC标记二抗以合适浓度稀释于PBS，覆盖标本表面。

37℃避光孵育<60min。

PBS 5min×3次避光振荡洗涤。

六、染核：新鲜稀释Hoechst覆盖细胞表面，RT避光静置<10min。

PBS 5min×3次避光振荡洗涤。

七、封片：在干净的载玻片上滴一滴封片剂，将爬片的细胞面扣在封片剂上。

八、镜检，4℃避光保存。

II、注：1、细胞密度要合适，状态较好。

2、从孵育二抗开始要避光（关闭室内日光灯即可）。

3、完成后最好及时镜检，照相；分别用不同波长激发荧光，在Photoshop软件下合成一张图。

III、试剂配制：1、固定液：4%多聚甲醛/PBS：4g多聚甲醛，50～80mlPBS，加热至60℃，持续搅拌至完全溶解，（通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮），定容100ml，RT保存。

2、通透液：0.5 %(v/v)TritonX-100/PBS3、封闭液：正常山羊血清稀释于PBS；或商品化封闭液成品。

4、Hoechst：Hoechst33258即可。

5、封片剂：50%(v/v)甘油/PBS。

免疫荧光技术试验流程免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。

它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。

很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。

以荧光抗体方法较常用。

用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。

免疫细胞荧光试验流程：1、细胞爬片制备1）、将盖玻片放入培养瓶或多孔板中2）、细胞生长实现60％后取出盖玻片3）、用PBS清洗盖玻片3次4）、将盖玻片（细胞面朝上）浸入冷丙酮或4％多聚甲醛或中性福尔马林中10至20分钟（盖上盖子以防止蒸发）5）、用PBS清洗盖玻片3次6）、将盖玻片放在滤纸上（细胞朝上）7）、干燥8—10小时，放入—20°C保管8）、试验前解冻爬片，在室温下用中性PBS浸泡10—15分钟注意：使用多聚甲醛和福尔马林固定可能会导致绿色光谱中的自发荧光。

在这种情况下，可以试验红色或红外的荧光素。

2、破膜1）、0.1％Triton孵育10min2）、PBS洗涤3次，每次3分钟3、抗原修复1）、用滤纸擦干细胞爬片2）、在爬片上加入如胰蛋白酶或其它酶抗原修复液3）、在室温下孵育10分钟4）、用PBS洗涤3次，每次10分钟4、封闭1）、在爬片上加入5％BSA封闭液（种属与二抗来源相同）2）、37°C孵育30分钟3）、甩掉多余的液体并用滤纸擦干（不需要洗涤）5、一抗孵育1）、用抗体稀释液稀释一抗，实现抗体制造商介绍的浓度2）、将稀释的抗体（介绍浓度：0.4μg至2μg）加到爬片上，4°C孵育过夜3）、用PBS洗涤3次，每次15分钟6、二抗孵育1）、用抗体稀释液稀释生物素化的二抗2）、将稀释的抗体加到爬片上，37°C孵育30分钟3）、用PBS洗涤3次，每次8分钟7、染色1）、爬片上滴加稀释好的SABC—FITC或SABC—Cy3试剂2）、37°C孵育30分钟（避光）3）、用PBS洗涤2次4）、滴加DAPI染液，避光孵育10min5）、用PBS洗涤3次6）、用抗荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜下察看结果。

免疫荧光实验步骤大全免疫荧光实验是一种常见的实验技术，用于检测特定抗原和抗体的相互作用。

本文将介绍免疫荧光实验的详细步骤，以供参考。

实验材料准备：- 试验样本（包括细胞或组织）- 抗原或抗体- 包含荧光素的二抗- PBS缓冲液- 荧光显微镜- 封片胶实验步骤：1. 样本制备- 如果是细胞样本，在培养皿中培养并观察细胞的形态和生长状态。

- 如果是组织样本，将组织切片并进行固定，然后反复用PBS缓冲液进行洗涤。

2. 抗原或抗体的固定- 将样本固定在载玻片上，可以使用正硫酸盐和乙醇来进行固定。

- 固定后用PBS缓冲液进行洗涤，以去除多余的固定试剂。

3. 孵育抗原或抗体- 在固定后的样本上加入适量的抗原、抗体或荧光素标记的二抗。

- 在室温下或4摄氏度下孵育一定的时间，以实现抗原和抗体的特异结合。

4. 洗涤- 使用PBS缓冲液洗涤固定后的样本，可多次洗涤以去除非特异性结合。

5. 荧光显微镜观察- 将载玻片放置在荧光显微镜上，调整荧光滤镜组合以观察荧光信号。

- 使用合适的放大倍率观察细胞或组织中特定的抗原或抗体信号。

6. 影像采集与分析- 使用相机或图像采集系统记录荧光显微镜观察到的图像。

- 使用图像分析软件对图像进行处理和分析，如测量荧光强度、定量特定抗原或抗体的表达水平等。

7. 结果和讨论- 分析实验结果，比较不同样本之间的差异。

- 讨论实验结果与研究假设的一致性，并可进行进一步的实验验证。

8. 结论- 总结实验结果，并得出相应的结论。

- 可以进一步讨论实验结果在相关领域的应用和意义。

9. 实验清理- 定期清洗和消毒实验室工作区域和仪器设备，以确保实验环境的卫生和安全。

以上是免疫荧光实验的基本步骤，每一步都需要仔细操作和控制实验条件。

在实验过程中，要注意遵守实验室安全操作规范，确保自己和他人的安全。

希望本文对您的科研工作有所帮助！。

细胞免疫荧光标记实验步骤细胞免疫荧光标记实验是用来观察和分析细胞中的特定分子或结构的一种常用方法。

下面是一些常见的细胞免疫荧光标记实验步骤：1. 细胞培养准备:- 在无菌条件下准备所需培养基和培养器具。

- 将待标记细胞接种在培养皿中，以适当的细胞密度使其在培养基中生长。

2. 固定细胞:- 将细胞培养皿中的培养基倒掉。

- 用生理盐水或磷酸缓冲液轻轻洗涤细胞，以去除未附着的细胞和培养基残留。

- 加入适当的固定液，例如4%的乙醛，固定细胞并封存其内部结构。

3. 渗透化处理:- 使用适当的渗透剂，如0.1%的Triton X-100，以打破细胞膜，使抗体能够渗透到细胞内部。

- 进行渗透化处理的时间应根据实验要求而定。

4. 抗体标记:- 制备适当的抗体和荧光染料稀释液。

- 将抗体稀释液加入到细胞上，使其与目标分子结合。

- 按照实验要求，在适当的温度和时长下孵育细胞，促使抗体与目标分子充分结合。

5. 洗涤和染色:- 用洗涤缓冲液充分洗涤细胞，以去除未结合的抗体和荧光染料。

- 使用适当的荧光染料对细胞进行染色。

如需防褪色，可以添加适当的抑制剂。

6. 显微镜观察和图像捕获:- 用适当的显微镜观察细胞，并捕获荧光图像。

- 根据需要，使用图像处理软件对图像进行分析和量化。

注意事项：- 实验前确保实验室和设备都是清洁的，并遵守实验安全操作规范。

- 涉及有害物质时，戴好个人防护用品，如实验手套和护目镜。

- 每个实验步骤的时间和条件可能因实验要求而异，需根据具体实验方案进行调整。

这些步骤提供了一般的细胞免疫荧光标记实验的大致流程，但具体实验方法还需根据实验目的和材料的特性进行优化和调整。

参考资料：[1] Smith, C. et al. ___. Cold Spring Harb. Protoc. 7, 1052–1055 (2013).[2] Manders, E. M. M. et al. FISH: ___. Cold Spring Harb. Protoc. 2006, db.rot4111 (2006).。

胞免疫荧光步骤：1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8小时烤干备用。

爬片可以在培养皿六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。

一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。

培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。

最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。

爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。

同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。

将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。

注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在－20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。

2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)；3.PBS漂洗5min；4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)；5.PBS漂洗2次，每次5min；6.1%BSA封闭30min；7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h；8.PBS漂洗2次，每次5min；9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h；10.PBS漂洗2次，每次5min；11.5ug/ml DAPI染色2min；12.抗淬灭封片剂封片。

抗淬灭封片剂:2.5% DABCO (w/v)50mM Tris(pH8.0)90%甘油内容仅供参考，希望对你有帮助！抗荧光淬灭剂的作用当荧光染料暴露在激发光下时，几乎都有漂白的现象（光漂白）。

免疫荧光1.免疫荧光所用玻片的处理(1) 玻片的规格：圆形18mm×18mm可放入12孔盘；(2) 处理方法：将玻片一片一片的放入1M的盐酸中，65度浸泡过夜，每一遍均要一片一片的清洗，第一遍用流动的自来水冲洗，，其余在盆里清洗，要洗5次以上，再用蒸馏水洗，同样的方法洗5次以上，再用超声，低功率，一小时。

完后再用蒸馏水洗5遍，洗完以后放入95%的乙醇中长期保存。

临用时，在酒精灯上过一下，使玻片上残余的乙醇燃烧，干燥后放入12孔板。

2. 铺板子如细胞难以贴壁（如293T）或需观察细胞骨架的相关指标，需用多聚赖氨酸处理玻片。

多聚赖氨酸1ml，置于37度孵箱30-60min，吸干液体，用DDW洗三遍，吸干液体，紫外照射5-10min，晾干。

实验前一天将含2-3×10^4细胞的单细胞悬液铺种在放有盖玻片的十二孔盘中一个孔中（要保证有单个细胞）。

每个条件做两个复孔，待细胞贴壁12~24h后，用于实验分析；3. 固定用PBS洗涤细胞3 次(注意免疫荧光所用的PBS，均为常温的)，吸干，4%的PFA 1ml/ 孔于室温固定10min ；4. 防淬灭吸出PFA ，注意不能使细胞干燥，用PBS 洗3 次，加入1ml 的50mM 氯化铵于室温孵育10min，吸出氯化铵，PBS 洗3 遍，2-3min/次；(此步可省略)5. 通透加入1ml 的0.1%Triton X-100，10min，吸出Triton，用PBS 洗3 次，2-3min/次；6. 封闭加入1ml 3%的BSA（PBS配）封闭，室温1h，可在摇床上晃动，吸出BSA ，用PBS 洗10min；7. 一抗一般稀释比例为1：200-1：500，将抗体（BSA配；双染各加20μl ，单染加40μl ）加到封口膜上，将盖玻片从十二孔盘中取出，吸干多余的水分，有细胞的一面接触抗体，室温>1h 或4°C 过夜（效果好），将玻片重新放回到十二孔板中，有细胞的一面朝上，用PBS 洗4 次，10min/次；8.二抗稀释比例一般为1：400（BSA配），操作同一抗，避光室温反应1h, 将玻片重新放回到用锡纸包裹的十二孔盘中，有细胞的一面朝上，PBS 洗3 次，10min/ 次；9. DAPI染细胞核一般浓度为1μg/ml，每个盖玻片需20ul ，操作同一抗，避光于室温反应10min，将玻片重新放回到用锡纸包裹的十二孔盘中，有细胞的一面朝上，PBS 洗3 次，10min/ 次；10.封片把封片剂（mowoil）滴在载玻片上，每片15μl，将有细胞的面朝下，勿有气泡。

免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。

zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。

2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。

注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。

洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。

2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。

4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。

5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。

6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。

7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。

8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。

免疫荧光步骤集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]
免疫荧光步骤
1.脱蜡和水化?
脱蜡前，应将组织切片在室温中放置60min或60℃恒温箱中烘烤20min。

1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min；2）无水乙醇中浸泡
5min；3）95%乙醇中浸泡5min；4）70%乙醇中浸泡5min；（动作要快，减少暴露在空气中中的时间）
2.PBS洗两次各5min。

（整个过程中注意切片不能干）
3.抗原修复，用于多聚甲醛固定的石蜡包埋组织芯片。

煮沸热修复电炉或者水浴锅加热?0.01M柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10min，必须等缓冲液冷却后，方能将切片取出。

4.PBS洗3次每次5min。

5.滴加5%正常山羊血清，室温封闭30min，甩去多余液体。

6.滴加一抗（根据说明书的比例稀释，一般为1:100），室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45min）。

7.PBS洗3次每次5min。

8.滴加荧光标记的二抗，室温避光孵育1h。

（注意抗体针对的种属，使用浓度，用锡箔纸包住培养板放在抽屉中避光。

）
9.PBS洗3次每次5min。

10.DAPI染色：把DAPI滴在片上，将切片覆盖，50ul/片，染色10min。

11.PBS洗3次每次2min。

12.封片：抗荧光淬灭封片剂封片，再拍照。

细胞免疫荧光染色实验
1.实验前一天将细胞接入铺有盖玻片的六孔板内（盖玻片预先用酒精浸泡30分钟左右，使用之前用酒精灯灭菌几秒钟，然后用镊子夹住盖玻片放入六孔板内）；
2.第二天，待细胞融合至70%左右开始进行染色；
3.弃去旧培养基，每孔加入1-2mlPBS，漂洗3min/次*3次；
4.吸出PBS，每孔加入预冷的4%多聚甲醛1ml，室温下固定细胞20min；
5.吸出4%多聚甲醛，每孔加入1-2mlPBS，漂洗5min/次*3次；
6.吸出PBS，每孔加入0.5%TritonX-100 1ml，室温下孵育10min（0.5%TritonX-100用PBS 稀释）；
7.吸出0.5%TritonX-100，每孔加入1-2mlPBS，漂洗5min/次*3次；
8.吸出PBS，每孔加入1ml 2%BSA（PBS稀释），室温下封闭30min-1h；
9.吸出2%BSA，勿洗；
10.每个盖玻片上滴加50ul左右一抗（一抗稀释比例根据说明书，用2%BSA稀释），置于4度过夜；
11.次日取出六孔板，每孔加入1-2mlPBS，漂洗5min/次*3次；
12.吸出PBS，每个盖玻片上加入50ul左右荧光二抗（二抗稀释比例根据说明书，用2%BSA 稀释），室温下孵育1小时（我一般都是4度孵育过夜）；
13.每孔加入2mlPBS，漂洗5min/次*3次；
14.吸出PBS，每孔加入染核试剂（DAPI或Hoechst），按照说明书操作；
15.吸出染核试剂，用PBS漂洗3次；
16.加入10-20ul封片剂封片；
17.荧光显微镜下观察拍照（封片好的细胞样品可于4度存放2周以上甚至一年）。

免疫荧光染色(多标)步骤免疫荧光染色(多标)是一种常用的实验技术，用于检测和定位细胞或组织中的特定抗原。

该技术利用抗体的高度特异性与宿主细胞或组织中的抗原相结合，并通过荧光标记的二抗进行可视化。

本文将详细介绍免疫荧光染色(多标)的步骤。

一、制备标本需要从细胞培养物或动物组织中制备标本。

对于细胞培养物，可以使用离心将细胞沉淀，然后用PBS洗涤细胞沉淀。

对于动物组织，需要将组织切片并固定。

二、抗原解剖将标本进行抗原解剖，即使得细胞或组织中的抗原能够与抗体结合。

抗原解剖的方法包括共价交联、乙醛固定和冷冻解剖等。

三、非特异性结合抑制为了减少非特异性结合，需要对标本进行非特异性结合抑制。

可以使用一些蛋白质，如牛血清白蛋白(BSA)或胎牛血清(TBS)，将标本进行封闭。

四、第一次抗体孵育将具有特异性的原抗体（第一抗体）加入到标本中，使其与抗原结合。

第一抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。

五、洗涤将标本进行洗涤，去除没有结合的第一抗体。

洗涤液可以使用PBS 或TBS缓冲液。

洗涤的次数取决于实验的要求，一般需要洗涤3-5次。

六、第二次抗体孵育加入与第一抗体来源不同物种的荧光标记的二抗（第二抗体），使其与第一抗体结合。

第二抗体可以选择不同的荧光染料，如荧光素或罗丹明。

七、洗涤将标本进行再次洗涤，去除没有结合的二抗。

同样使用PBS或TBS 缓冲液进行洗涤。

八、核染色为了观察细胞核的位置，可以使用荧光标记的DNA染料，如4',6-二硫化羟喜树碱(DAPI)进行核染色。

九、封片将标本封装在载玻片上，使用适当的封片剂固定标本。

同时，可以加入抗褪色剂以保持荧光的稳定性。

十、观察与分析使用荧光显微镜观察标本，并进行图像采集和分析。

可以使用图像处理软件对采集到的图像进行进一步的定量分析。

免疫荧光染色(多标)是一种重要的实验技术，在生物医学研究中有着广泛的应用。

通过该技术，可以对细胞或组织中的特定抗原进行定位和表达分析，为研究细胞功能和疾病机制提供关键信息。