常见荧光定量PCR仪汇总讲解

四种常见PCR仪的区别及运用PCR扩增仪（俗称PCR仪）PCR：PCR（聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。

PCR仪实际就是一个温控设备，能在95℃，55℃，72℃之间很好地进行温度控制。

PCR扩增仪又称为PCR基因扩增仪、PCR核酸扩增仪、聚合酶链反应核酸扩增仪，是利用PCR(Polymerase chain reaction，聚合酶链反应)技术对特定DNA扩增的一种仪器设备，被广泛运用于医学、生物学实验室中，例如用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断、基因复制以及亲子鉴定等。

根据DNA扩增的目的和检测的标准，可以将PCR仪分为普通PCR仪，梯度PCR 仪，原位PCR仪，实时荧光定量PCR仪四类。

1). 普通PCR仪（2万以下，赛默飞、伯乐、大龙，艾本德）一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪称作传统PCR仪，也叫普通PCR仪。

如果要做不同的退火温度需要多次运行。

主要是用于简单的、对目的基因退火温度的扩增。

该仪器主要应用于科学研究、教学、医学临床、检验检疫等机构。

如:启步BSW-2P,BSW-3P,BSW-6P-I/II ,ABI 2720型2). 梯度PCR仪（2万-8万，赛默飞、伯乐、大龙，艾本德）一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件（温度梯度，通常有12种温度梯度）的PCR仪称作梯度PCR仪。

因为被扩增的不同DNA片段，其最适退火温度是不同的，通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR 扩增，就可以筛选出表达量高的最适退火温度，进行有效的扩增。

用于研究未知DNA退火温度的扩增，这样节约成本的同时也节约了时间。

PCR仪的种类1. 实时定量PCR仪实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，简称实时定量PCR）是一种用于快速、敏感且准确测定DNA、RNA拷贝数目的方法。

实时定量PCR仪是进行实时定量PCR实验的关键设备之一。

实时定量PCR仪的主要特点是能够对PCR反应过程中产生的荧光信号进行即时检测和分析，从而实现实时监测PCR反应的进程，并测定样品中目标序列的拷贝数。

实时定量PCR仪的应用非常广泛，包括基因表达检测、病原体检测、单核苷酸多态性分析等。

其高灵敏度、高特异性以及广泛的应用领域使其成为现代分子生物学和遗传学研究的重要工具。

2. 普通PCR仪普通PCR仪是进行普通聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）实验的基本设备。

普通PCR仪可以进行常规PCR实验，即通过PCR反应在体外扩增目标DNA片段。

普通PCR仪的特点是温控系统可以实现快速、精确的温度调节，从而使PCR反应在不同温度下的环境条件得以满足。

普通PCR仪的操作简单、成本较低，适用于常规PCR 实验的需求。

普通PCR仪的应用广泛，包括基因克隆、DNA测序、基因检测等。

它已成为分子生物学、医学和生物技术等领域中的一种基础设备。

3. 数字PCR仪数字PCR仪是一种相对较新的PCR仪器，它采用数字分析的方法对PCR产物进行定量，具有极高的准确性和可靠性。

数字PCR仪的工作原理是将PCR反应体系分成数百、甚至上千个微小反应体，从而形成多个独立的PCR反应。

每个微小反应体内含有目标序列与参考序列，通过数百或数千个微小反应的计数结果进行定量分析。

这种方法可以极大地降低PCR反应中的误差，提高PCR反应的准确性。

数字PCR仪的应用主要集中在绝对定量PCR、稀释样品的精确定量、病原体检测等领域。

其高准确性和可靠性使其在遗传学研究和临床诊断中得到广泛应用。

QPCR荧光实时定量仪1 StepOnePlus™ Real-Time PCR System 极易操作的扩增仪；高度精确、可靠的结果。

●96个反应孔以提供更高的反应通量●四色系统以提供更多的灵活性●VeriFlex™ 加热模块技术提供灵活的热循环模式StepOnePlus™ 系统包括：➢预校准的仪器➢ RNA酶P仪器验证反应板➢仪器操作和分析软件，以及Primer Express® 引物和探针设计软件➢包括入门指南在内的丰富的文件集，适用于各种主要的实时荧光定量PCR 应用领域系统特点➢在2小时内完成标准模式的PCR反应，40分钟内完成快速模式PCR反应➢直观灵活的软件和向导，指导新用户通过三个简单的步骤完成实时荧光PCR实验➢极紧凑的设计，适用于各种实验室环境➢LCD 触摸屏和USB 驱动使配置更加灵活，并可实现无PC 操作➢基于LED 的长寿命四色光学系统可记录FAM™/SYBR Green、VIC®/JOE™、NED™⁄TAMRA™ 和ROX™ 等染料发出的荧光➢采用了VeriFlex™ 加热模块技术，包含6 个可独立控制的温控区域，可同时扩增6 个不同退火温度的PCR 产物➢方便远程监控和电子邮件通知实验开始及结束功能，可以帮助节省时间此系统价格适中，适合各种操作经验水平、需要中等通量系统的实验室使用。

1.1仪器组成➢激发光源灯LED灯：具有长达10年的连续使用寿命。

➢滤光镜➢荧光检测器光敏二极管（PHT）：➢加热元件半导体加热：基于peltier技术的控温系统，特点是准确性好，但均一性不佳。

➢耗材8联管96孔板PCR单管毛细样品管1.2光学结构原理传统半导体顶部采光：1.3荧光检测标记探针的荧光分子的选择：StepOnePlus™系统可以检测FAM™、VIC®/JOE™、NED™⁄TAMRA™ 和ROX™染料标记的荧光探针。

荧光检测系统具有极高的灵敏度和特异性，可以很好的完成实时定量、基因表达、基因分型以及多重PCR反应等实验。

7500荧光定量PCR 仪使用说明注意事项：实验过程必须戴干净的一次性乳胶手套进行操作。

PCR 反应所用的96孔板、8联管或单管必须为ABI7500专用，凸盖PCR 管禁止使用。

使用8联管两侧需用空管支撑，使用单管四角需用空管支撑，以防止板槽受力不均。

实验数据用光盘刻录，禁止U 盘拷取，数据可暂存于本机电脑硬盘中，各实验室D 盘中有指定文件夹，中心外部人员数据存于FUWU 文件夹下的子文件夹中。

操作步骤开机放入反应板注：关闭仪器托盘时，应按一个角度推压托盘的右侧。

按压此处 ！ 待电脑启动稳定后，按压7500仪器电源按扭，等待仪器启动（约30 s ）。

当仪器只显示Power 状态指示灯时，方可按压托盘以打开它。

（以下过程按字母顺序a →q 进行操作）创建反应板文件双击电脑桌面上SDS 软件图标打开SDS 软件；a. 从 Assay 下拉列表中选择反应板类型c. 单击Next 反应板文件类型有以下几种：1. Relative Quantification (ddCt) Plate（相对定量） 2. AbsoluteQuantification(StandardCurve)（绝对定量，标准曲线）3. Allelic Discrimination （等位基因鉴别）4. Plus/Minus （阳性/ 阴性实验）d. 选择要添加到反应板文件的探针（引物），单击Add 添加选中探针e. 如果在列表中未列出所需探针，请单击New Detector 创建新探针f. 单击Nextb. 为反应板文件命名为反应孔设置样品名g.选取探针相同的反应孔h.点击反应孔对应的探针。

i.单击 Task栏的下边指定探针任务。

j.选择Use （使用）。

k.单击Finish （完成）。

ghijkl.选取反应孔，直接输入相应样品名（也可右键，调出反Well Inspector对话框，在Sample Name中进行修改）设定PCR循环参数、运行程序1.实验结束后关闭软件。

PCR仪的几种分类及操作规程PCR仪的几种分类依据DNA扩增的目的和检测的标准可以将PCR仪分为一般PCR 仪，梯度PCR仪，原位PCR，实时荧光定量PCR仪等几类。

1、一般PCR仪一般把一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪，称之为一般PCR仪。

假如要用它做不同的退火温度则需要多次运行。

紧要是用作简单的，对目的基因退火温度的扩增。

紧要应用于科研、教学、临床医学、检验、检疫等。

2、梯度PCR仪一次性PCR扩增可以设臵一系列不同的退火温度条件（通常12种温度梯度）的称之为梯度PCR仪。

由于被扩增的不同的DNA片段其比较适合的退火温度不同，通过设臵一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增就可以筛选出表达量高的比较适合退火温度进行有效的扩增。

紧要用于讨论未知DNA退火温度的扩增，这样既节省时间，也节省经费。

在不设臵梯度的情况下亦可当做一般的PCR用。

真正的梯度，是每一排管都有精准明确的加热控温探头，2023年为止只有美国ABI公司可以做到。

其他的都是从两头的热传递来设计控温。

梯度PCR仪多应用于科研、教学机构。

3、原位PCR仪（有些品牌的PCR仪具有一般PCR、梯度PCR、原位PCR的功能，通过替换模块进行多用途开展试验工作）是用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪。

如病原基因在细胞的位臵或目的基因在细胞内的作用位臵等。

可保持细胞或组织的完整性，使PCR反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位臵进行基因扩增。

不但可以检测到靶DNA，还能标出靶序列在细胞内的位臵。

于分子和细胞水平上讨论疾病的发病机理和临床过程及病理的变化有侧重点的应用价值。

4、实时荧光定量PCR仪（fluorescencerquantitivepolymerasechainreaction,FQPCR）在一般PCR仪设计基础上加添荧光信号激发和采集系统和计算机分析处理系统，形成了具有荧光定量PCR功能的仪器。

各款荧光定量PCR仪的性能比较本人从事荧光定量PCR检测试剂的开发工作，用过市场上主流的多款荧光定量PCR仪，如ABI5700，ABI7700，ABI7000，ABI7300，ABI7500，MJ opticon,MJ opticon2,bio-rad I Cycler,LightCycler1.5，roter-gene3000，Stratagene Mx3000P，line—gene等等。

这种仪器各有各的特点，但都存在不足之处。

ABI公司的荧光定量PCR仪产品比较多，成系列,但目前而言ABI5700和ABI7700不能实时在线地检测荧光，因而已经退出历史舞台，尤其是ABI7700，不但很贵，而且采用苹果机电脑，使用很不方便。

ABI7000目前也已经淘汰,我用的这台仪器老出问题,曲线极不光滑，但同样的反应体系在国产机杭州博日line-gene上曲线非常好，在ABI7500上曲线也很光滑，所以，本人估计是ABI7000设计上有不足之处.而且卤钨灯特别容易坏，在南方,我们实验室平均5个月换一个，配件容易坏,后续使用成本就会高一些。

现在市场上的ABI7300就是ABI7000的简单升级版,硬件设计上几乎没有改变，只是换过几个性能更好的配件，软件有所升级。

另外我个人感觉ABI7900（ABI公司第二代产品）有些华而不实，价格应该是所有荧光定量PCR仪中最贵的,硬件上跟ABI7700差不了太多，但性能指标还不如ABI7500(ABI公司第三代产品），硬件设计上也不如ABI7500合理。

所以这个型号的仪器，谁买了,用的时候会不呼上当.ABI7500是ABI公司最成功的产品，各方面性能都不错，虽然加热模块还是有一些边缘效应,但使用中央的孔位效果可以得到保证,在96孔板使用中间的48个孔位，结果都能得到保证。

总的来说，ABI公司在荧光定量领域上还是做出很多贡献的，其仪器在科研上还是可以用的，但由于硬件设计上的缺陷，需要额外的ROX染料进行校正，并且占用了一个检测通道。

ABI 7500荧光定量PCR
一、简介
7500型荧光定量PCR仪是特异性靶基因检测与定量的一体化平台。

7500型将PCR热循环，荧光检测和各种应用分析软件结合在一起，可实时定量观察PCR 每一循环各反应管中PCR扩增产物的情况。

PCR实验结束后即刻得到定量结果，无需凝胶电泳分析，无需纯化PCR产物，无需进行任何实验操作。

7500型实时荧光定量PCR仪具有节省时间，灵敏度高，准确性好和避免产物污染等优点。

二、主要技术参数
1. 样品孔数：96孔样品基座，
2. 温度范围：4.0-99.9℃
3. 温度显示：经计算机计算的实际样品温度，精确到0.1℃
4. 加热冷却速度：平均温度变化速度1℃/秒
5. 温度准确性：正负0.25℃，35－100℃范围
6. 升降温重现性：任意温度达到时间误差小于5秒
三、仪器性能:
1.电脑图表式PCR扩增方法，填表式PCR编程，程序运行可闪烁显示当前状态。

2.样品基座基本配置为可更换型96孔基座，可满足不同PCR反应管，不同孔数以及不同类型PCR实验的要求。

3.计算机计算不同样品体积的实际样品温度，控温精确，扩增效果重现性更好。

4.软件容量大，可储存100个完整的PCR方法，软件自动计算引物解链温度。

5.自动断电保护，恢复供电后自动执行未完成循环，保证扩增全过程安全运行。

四、主要功能
利用荧光染料和探针标记跟踪PCR产物，对反应进行实时监控；不仅可以对产物进行溶解曲线分析，而且可以通过加入已知浓度的标准样品做标准曲线，确定待测样品的浓度。

可应用于基因表达分析，突变检测；细菌、病毒等致病微生物的检测；食品卫生检疫等。