XX生物科技公司ABI7500荧光定量PCR仪标准操作规程

ABI 7500 FAST荧光定量PCR仪简明操作规程1.双击桌面图标，或从 Start >All Programs > Applied Biosystems >7500 Software > 7500 V2.0 开启软件。

进入主界面后选择Advanced Setup 。

2.默认进入 Setup 下的Experiment Properties 界面2.1输入实验名称（Experiment Name）2.2确认仪器型号2.3在实验类型中，选择 Quantitation-Comparative CT (△△CT)2.4选择试剂种类2.5确认运行模式3.进入 Setup 下的Plate Setup 界面，编辑基因（Target）及样本（Sample）；3.1在“define targets and samples”界面中设置基因3.2在“assign targets and samples”中进行样品板的排布。

4.在“Select relative quantitation setting”中设置内参基因及对照样本。

5.进入 Run Method 界面，设定反应条件及反应体积。

6.点击“save”按钮，文件储存成 Experiment Document Single Files（*.eds）格式，然后在 Run 界面按下按钮，反应即开始进行。

7.实验结束后，点击界面右上角的 Analyze 按钮，软件将会显示实验结果：7.1在扩增图中（见上图），可通过更改Plot Settings 来改变扩增图的显示方式。

如果想查看阈值线或基线，请将Threshold 及Baseline 打勾。

7.2查看相对表达量结果时，利用Plot Settings 选项，可以以不同方式显示相对表达量的结果。

7.3对于 SYBR Green 法实验，可以在Melt Curve 界面中查看熔解曲线。

7.4检测 QC Summary 结果，可以快速查看实验中是否有反应孔存在异常情况。

PCR实验室7500SOP【】ABI 7500型核酸扩增荧光检测仪使⽤、维护、校准程序-LAB-SOP-FZSW-0111.⽬的：确保ABI7500仪器的正确使⽤及正常运⾏2.适⽤范围：美国应⽤⽣物系统公司⽣产的ABI7500实时荧光定量PCR仪3.运⾏环境：电源：推荐配备合适的UPS或稳压器。

通风：仪器的通风应该没有阻挡。

温度：推荐实验室配备空调，温度应该控制在10～30℃之间。

湿度：20-80%；对于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机。

空间：易于操作，安全。

4.操作程序：4.1开关机程序：开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机⾯板上的绿灯亮后即可打开ABI7500系统软件，进⾏实验。

关机顺序：确认实验已经结束后，⾸先关闭ABI7500系统软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。

4.2 创建绝对定量反应板⽂件：4.2.1依次选择 Start > Programs > Applied Biosystems 7500 >Applied Biosystems 7500 SDS Software ( )，以启动 SDS 软件;或在桌⾯双击Applied Biosystems 7500 SDS Software ( )图标。

4.2.2选择 File （⽂件） > New （新建）。

4.2.3在 New Document Wizard （新建⽂件向导）窗⼝中，从 Assay （实验）下拉列表中选择Absolute Quantification (Standard Curve)（绝对定量，标准曲线）。

接受 Container （反应板类型）和 Template （模板）字段中的默认设置（即分别为 96-Well Clear（空⽩96 孔板）和 Blank Document（空⽩反应板））。

4.2.4在 Default Plate Name （默认反应板名）字段中输⼊反应板⽂件名，或接受默认⽂件名。

ABI7500实时跟踪荧光PCR仪使用操作规程1. 目的：使ABI 7500 型核酸扩增荧光检测仪能够正确和正常的使用，保证扩增及结果分析的标准化、规范化。

2. 范围：适用于ABI 7500型核酸扩增荧光检测仪使用操作。

3. 职责：操作人按照规程进行仪器的操作使用。

4. 程序：4.1 开机。

连接好所有连线，打开接线板开关，然后依次打开主机开关（在主机侧面），电脑显示器开关（按屏幕下方开关按钮），电脑开关（主机前面按钮）。

使用鼠标双击桌面上一体化仪3.2图标，连机后打开应用程序。

4.2 编辑样品板。

在区域选择界面中进行样品板编辑，同时输入待检样品的相关信息。

4.3 编辑实验程序。

在温度控制界面中进行程序编辑。

4.4 进行实验。

设定完成样品板和实验程序后，将实验样品按样品板设定的位置放入样品槽内，然后将样品槽放入主机内，在程序主界面下点击开始读图标开始运行实验。

实验过程中屏幕的下半部分同步显示实验的运行状态。

4.5 实验中仪器将实时显示每次的样品检测结果：在实验进行中间或实验结束后，均可组合界面中查看实时的检测结果：4.6 定量分析：实验结束后，可以点击定量图标进入定量分析功能。

4.7 打印报告单：定量完毕后，用鼠标单击文件（F）菜单中的刷新病历数据信息，用鼠标单击文件（F）菜单中的打印，系统将自动生成检测报告单，并进行打印。

4.8 关机。

实验全部结束后，可先点击Files菜单Save Data File保存实验结果，然后关闭Opticon Monitor。

依次关闭计算机主机，显示器，ABI 7500主机。

5. 相关文件：无6.相关记录：仪器设备使用、维护保养和清洁记录。

1. 目的为规范使用人正确和正常的使用ABI 7500型核酸扩增荧光定量检测仪，保证扩增及结果分析的标准化、规范化，特制定本规程。

2. 适用范围适用于本公司ABI7500荧光定量PCR仪的操作。

3. 职责3.1使用人员负责本规程的实施。

3.2 设备使用人负责设备维护保养工作；设备责任人负责设备的定期维护保养工作。

3.3 质量监督员负责监督本规程的实施。

4.内容4.1 程序设置4.1.1 打开电脑及仪器电源，待仪器电源项显示power绿色状态。

4.1.2 双击电脑桌面上的7500 software V2.3 图标打开程序，打开程序单击OK，待软件连接仪器并测试校准状态后（若有出现连接失败可尝试重启电脑，检查USB线接口），出现如下界面，单击Design Wizard选项，红色箭头指示位置有个下拉菜单，如下图所示。

下拉菜单中有一个Advanced Setup（高级设置）选项，如箭头所示：点击这个选项，可以进入下面这个界面，①②③如上图所示，红色箭头从上到下指示的分别是①实验名称、②仪器型号和③反应程序类型。

（带*号的必需填）此图是上面图的延续（自己电脑显示不完全），红色箭头从上到下指示的分别是①Plate Setup 选项、②探针类型和③程序应用速度类型，一般使用的探针就是TaqMan 探针，速度类型选择默认就可以了（如果是7500fast 的话则有快速模式可以选择）。

下一步我们可以看到左上角的红色箭头指示的一个Plate Setup 选项，点击这个选项，就可以进入下一个设置界面。

红色箭头①和②指的是设定反应探针和反应样品名称，箭头③处可以填写反应探针名称（如P1,HBV ,HCV ）。

箭头⑤是选择报告荧光，一般使用的发光基团是FAM ，箭头⑥是选择粹灭荧光，达安现在使用的是TAMRA 荧光，科华现在使用的是BHQ ，在这个仪器中无此选择项，那么就选择none 。

箭头⑧处可以填写样品名称。

点击箭头④和箭头⑨处可以添加反应探针体系名称和样品名称。

7500荧光定量PCR 仪使用说明注意事项：●实验过程必须戴干净的一次性乳胶手套进行操作。

● PCR 反应所用的96孔板、8联管或单管必须为ABI7500专用，凸盖PCR 管禁止使用。

● 使用8联管两侧需用空管支撑，使用单管四角需用空管支撑，以防止板槽受力不均。

● 实验数据用光盘刻录，禁止U 盘拷取，数据可暂存于本机电脑硬盘中，各实验室D 盘中有指定文件夹，中心外部人员数据存于FUWU 文件夹下的子文件夹中。

操作步骤➢开机➢ 放入反应板注：关闭仪器托盘时，应按一个角度推压托盘的右侧。

（以下过程按字母顺序a →q 进行操作）➢ 创建反应板文件双击电脑桌面上SDS 软件图标打开SDS 软件；a. 从 Assay 下拉列表中选择反应板类型c. 单击Next 反应板文件类型有以下几种：1. Relative Quantification (ddCt) Plate （相对定量）2. Absolute Quantification (Standard Curve)（绝对定量，标准曲线）3. Allelic Discrimination （等位基因鉴别）4. Plus/Minus （阳性/ 阴性实验）d. 选择要添加到反应板文件的探针（引物），单击Add 添加选中探针e. 如果在列表中未列出所需探针，请单击New Detector 创建新探针f. 单击Nextb. 为反应板文件命名➢为反应孔设置样品名g.选取探针相同的反应孔h.点击反应孔对应的探针。

i.单击Task栏的下边指定探针任务。

j.选择Use （使用）。

k.单击Finish （完成）。

ghijkl.选取反应孔，直接输入相应样品名（也可右键，调出反Well Inspector对话框，在Sample Name中进行修改）设定PCR循环参数、运行程序1.实验结束后关闭软件。

（确认反应板文件数据已保存）2.打开拖盘，将反应板取出，关闭拖盘。

3.按下7500仪器电源开关关闭机器。

1、目的规范该型号ABI7500Fast荧光定量PCR仪操作程序，正确使用和维护仪器，保证检测工作顺利进行，操作人员人身安全和设备安全。

2、适用范围适用于ABI7500Fast荧光定量PCR仪的使用操作与维护。

3、职责3.1 操作人员按照本规程使用仪器，对仪器进行日常维护。

3.2 保管人员负责对仪器进行定期维护、保养。

3.3 科室负责人监督检查本操作程序的执行。

4、操作程序4.1启动笔记本电脑，进入Windows XP系统。

4.2待电脑桌面图标出现后，打开ABI7500Fast荧光定量PCR仪主机电源。

4.3待主机电源指示灯亮后，双击电脑桌面7500 SDS图标，打开软件。

4.4新建文件：在Quick Startup document窗口点击Create New Document 按钮，出现New Document Wizard窗口，在Assay菜单中选择Standard Curve （Absolute Quantification），点击Finish按钮后打开一个空白96孔板文件。

4．5探针设置：双击任意一个孔打开Well Inspector窗口。

4．6点击Add Detector按钮，打开Detector Manager窗口，选择Detector List中的探针，例如用的是TaqMan-FAM标记探针，在列表中选择Reporter：FAM，Quencher：TAMRA；如果用的是SYBR Green I，则在列表中选择Reporter：SYBR，Quencher：（none）。

选择所需探针，按住Ctrl键可选择多个探针，再点击Add To Plate Document 按钮，最后点击Done按钮关闭Detector Manager窗口。

此时Well Inspector窗口仍然是打开的。

填样品表：在96孔表中选择有样品的一个或者多个孔，然后在Well Inspector窗口的Sample Name输入样品的名称，在探针列表中的Use项下的方框中打钩选择要用的探针，在Task栏中选择指定样品类型：未知样品选择Unknown，阴性对照选择NTC，标准品选择Standard。

●目的建立ABI7500型荧光定量PCR仪的标准操作及维护保养规程，为本设备的操作提供标准依据。

●适用范围ABI7500型荧荧光定量PCR仪的操作、维护保养、清洁过程。

●责任与要求质量部人员必须遵照本规程。

●培训对象质量部●内容1.设备信息2.操作流程示意图3.3.1 开机自检3.1.1 按下配套电脑的开机键打开电脑。

3.1.2 按下ABI7500开关，打开仪器，仪器自动进行自检。

待仅有“power”指示灯（绿色）亮时，自检结束。

3.2 样品上机3.2.1 按下托盘按钮，弹出96孔管架托盘，确定所需的96孔管架。

3.2.2 将加好样品的八连管或96孔板放入相应的孔位。

3.2.3 将托盘推入原来位置。

3.3 编辑运行参数3.3.1 双击桌面上7500 Software v2.3软件图标，打开7500 Software v2.3软件。

3.3.2 在弹出的窗口点击“New Experiment”新建实验程序，并对实验参数进行设置：3.3.2.1 在Experiment Name（实验名称）字段中，可以自定义实验名称。

3.3.2.2 在Barcode（条形码）字段中，输入反应板条码。

3.3.2.3 在User Name（使用者姓名）字段中，输入您的姓名。

3.3.2.4 在Comments（备注）字段中，输入您想保存到文件中的任何附加信息。

3.3.2.5 默认选择instrument（仪器）-----7500(96 wells)。

3.3.2.6 默认选择Experiment type（实验类型）----- Quantitation-Standard Curve。

3.3.2.7 默认选择Reagents （试剂）----- TaqMan® Reagents（TaqMan® 试剂）。

3.3.2.8 默认选择Ramp speed（升降温速度）-----Standard（～2 hours to complete a run）。

荧光定量PCR仪（ABI7500）操作规程及日常维护曹蕾马扬光施小明【摘要】介绍了荧光定量PCR仪（ABI7500）操作规程，总结了其日常维护和注意事项，为其使用提供指导。

【关键词】荧光定量PCR仪操作规程维护荧光定量PCR仪将PCR热循环，荧光检测和各种应用分析软件结合在一起，可以动态观察PCR每一循环各反应管中PCR扩增产物逐渐增加的情况。

1原理介绍实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[1]。

荧光染料法：荧光染料能特异性掺人DNA双链，发出荧光信号，而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步[1]。

荧光探针法：探针的5端标记荧光报告基团（reporter R）3端标记淬灭基团（quencher Q），探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步[1][2]。

通常，荧光擴增曲线可分为三个阶段，即荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。

在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，因此可以在该阶段进行定量分析。

为了便于对所检测样本进行比较，在指数期需要设定一个荧光信号的阈值。

荧光信号由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数称为ct值。

模板的ct值与其起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，则ct值越小。

利用已知起始拷贝数的标准品及其相应的ct值可绘制出标准曲线，测得未知样品的Ct值后，根据标准曲线便可准确计算出该样品的起始拷贝数[3]。

2操作规程2.1开机2.1.1依次打开电脑显示器和电脑主机的电源开关，进入Windows界面。

1. 目的为规范使用人正确和正常的使用ABI 7500型核酸扩增荧光定量检测仪，保证扩增及结果分析的标准化、规范化，特制定本规程。

2. 适用范围适用于本公司ABI7500荧光定量PCR仪的操作。

3. 职责3.1使用人员负责本规程的实施。

3.2 设备使用人负责设备维护保养工作；设备责任人负责设备的定期维护保养工作。

3.3 质量监督员负责监督本规程的实施。

4.内容4.1 程序设置4.1.1 打开电脑及仪器电源，待仪器电源项显示power绿色状态。

4.1.2 双击电脑桌面上的7500 software V2.3 图标打开程序，打开程序单击OK，待软件连接仪器并测试校准状态后（若有出现连接失败可尝试重启电脑，检查USB线接口），出现如下界面，单击Design Wizard选项，红色箭头指示位置有个下拉菜单，如下图所示。

下拉菜单中有一个Advanced Setup（高级设置）选项，如箭头所示：点击这个选项，可以进入下面这个界面，①②③如上图所示，红色箭头从上到下指示的分别是①实验名称、②仪器型号和③反应程序类型。

（带*号的必需填）此图是上面图的延续（自己电脑显示不完全），红色箭头从上到下指示的分别是①Plate Setup 选项、②探针类型和③程序应用速度类型，一般使用的探针就是TaqMan 探针，速度类型选择默认就可以了（如果是7500fast 的话则有快速模式可以选择）。

下一步我们可以看到左上角的红色箭头指示的一个Plate Setup 选项，点击这个选项，就可以进入下一个设置界面。

红色箭头①和②指的是设定反应探针和反应样品名称，箭头③处可以填写反应探针名称（如P1,HBV ,HCV ）。

箭头⑤是选择报告荧光，一般使用的发光基团是FAM ，箭头⑥是选择粹灭荧光，达安现在使用的是TAMRA 荧光，科华现在使用的是BHQ ，在这个仪器中无此选择项，那么就选择none 。

箭头⑧处可以填写样品名称。

点击箭头④和箭头⑨处可以添加反应探针体系名称和样品名称。

ABI 7500型荧光定量核酸扩增仪作业指导书1.目的：使ABI 7500型核酸扩增荧光定量检测仪能够正确和正常的使用，保证扩增及结果分析的标准化、规范化。

2.范围：ABI 7500型核酸扩增荧光检测仪。

3.性能参数：详见说明书4.程序：4.1.依次打开电脑显示器及电脑主机电源，进入windows XP 界面4.2.打开PCR主机电源4.3.点击桌面7500 software V2.0.6 图标，打开软件4.4.主界面点击SET UP 菜单下ADVANCED SETUP4.4.1.在试验属性界面：选择正确的机器型号，试验类型及试剂类型（探针法/染料法）4.4.2.在plate setup 界面，首先设定试验使用的探针，及样品名称，然后按照事先加样的位置顺序设定样品名称、类型，包括待检样本、阴性对照、阳性对照、阳性标准品、阳性室内质控样本。

4.4.3.在run method界面，编辑与试剂盒提供的温度程序相同的温度程序，包括温度与时间，及循环数4.5.将预先加好的0.2ML样品管按照设定顺序放置到仪器里面，进入到RUN界面，点击绿色START 按钮，弹出保存试验对话框，设定保存后，试验立即开始运行。

界面显示运行倒计时。

运行过程中在amplification plot界面可以查看实时的扩增曲线，在temperature plot界面可以查看实时的温度变化情况。

温度循环结束后试验自动结束。

5.结果分析5.1.在analysis setup里面修改各个探针的baseline与threshold数值，点击绿色analyze图标，软件及完成自动分析。

5.2.在amplification plot界面查看所有样品的扩增曲线。

6.整体曲线的观察,将所有曲线选中进行整体观察。

6.1.观察是否存在污染情况（包括标本污染和试剂污染），特别应注意大量曲线在同一 Ct值出现上涨的情况。

6.2.观察是否有光路传导阻滞或电压波动等机器原因形成的异常曲线。

编制人：编制日期：年月日颁发部门：品保部
审核人：审核日期：年月日
批准人：批准日期：年月日生效日期：2014年06月01日分发部门：品保部分发号：
1.目的
规范ABI 7500荧光定量PCR仪操作，保证安全操作，延长仪器寿命
2.范围
适用于ABI 7500荧光定量PCR仪
3.职责
操作人负责本规程实施，部门负责人监督实施。

4.规程
4.1 实验程序运行：
4.1.1首先打开电脑，进入操作系统后，打开ABI 7500荧光定量PCR仪电源。

双击桌面上7500 software V2.0.6。

弹出Login对话框，默认的User Name为GUEST，点击Login as GUEST，点击OK运行软件。

4.1.2进入界面，选择Advanced Setup。

4.1.3点击Experiment Properties。

在Experiment Name栏输入实验名称。

4.1.4点击Plate Setup，点击Define Targets as Samples。

设定Target Name的Reporter 为FAM。

4.1.5点击Assign Targets and Samples。

设定96孔板。

4.1.5点击Run Method。

设定反应程序。

4.1.6点击Reaction Setup设定反应体系。

4.1.7点击Run菜单，点击START RUN。

开始运行PCR反应。

1. 目的：确保荧光定量PCR仪能够正确和正常的使用，保证扩增及结果分析的标准化、规范化。

2. 范围：适用于AB7500荧光定量PCR仪的使用及维护。

3. 定义：无4. 职责：荧光定量PCR仪使用人员负责本规程的实施。

质保部对本规定的有效执行承担监督检查责任。

5. 内容：5.1 室内温度控制在15～30℃，相对湿度45～75%。

5.2 仪器操作5.2.1 依次打开电脑显示器和电脑主机的电源开关，进入Windows界面。

5.2.2 接着打开AB7500仪器电源开关，预热10分钟。

5.2.3 点击7500 Software v2.3图标，打开软件。

5.2.4 按压仪器托盘上的按压位，待托盘弹出后，将所需检测的8联PCR反应管或者96孔PCR反应板放入检测孔位，记下放置位置。

检测8联PCR反应管用**反应孔模块，检测96孔PCR反应板用**反应孔模块。

（检测8联PCR反应管需放入盖紧管盖的空8联PCR反应管配平，检测96孔PCR反应板无需配平）5.2.5 再次按压托盘使其滑入仪器。

5.2.6 新建扩增参数模板：例如新建一个UG-63-62的模板，扩增参数是95°，10′；（95°，10″；63°，45″）×5 cycles；（95°，10″；62°，35″）×40 cycles，在62°时收集荧光信号（HEX、FAM信号），20μl反应体系。

5.2.6.1 在Setup-Plate Setup-Define Targets and Samples中，将T arget Name下的T arget1改成FAM；点击Add New Target，将新增的Target1改成HEX，点击Reportee下拉菜单，选择VIC。

5.2.6.2在Setup-Run Method-Graphical View中的Reaction Volume Per Well后面输入20（20μl反应体系）。

ABI7500实时荧光定量操作程序ABI7500实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）操作程序是用于检测目标DNA的数量的一种实验方法。

在该操作程序中，使用ABI7500实时荧光定量PCR系统的仪器和相关试剂来进行PCR反应，然后通过荧光信号的变化，对PCR反应中目标DNA的数量进行定量。

下面是ABI7500实时荧光定量PCR操作程序的详细步骤：1.实验前准备a.准备所需试剂，包括PCR引物、PCR酶、荧光探针等。

b.预备PCR工作站，如PCR工作台、离心机、PCR仪等。

c.准备PCR反应管，标记每管的样品编号。

2.反应体系构建a.准备PCR反应液，根据实验需要，将反应组分如PCR引物、PCR酶、模板DNA、dNTPs等加入PCR反应管中。

b. 加入SYBR Green或荧光探针，用于在PCR反应过程中检测目标DNA。

3.试剂混合与装样a.将PCR反应液和样品混合均匀。

b.装样到ABI7500实时荧光定量PCR系统中的反应孔中，注意避免气泡的产生。

4.设置PCR程序a.打开ABI7500实时荧光定量PCR系统的软件界面，选择合适的PCR 模板。

b.设置PCR程序，包括温度、时间和荧光信号的检测。

5.PCR反应a.开始PCR反应，系统会根据设置的程序进行温度循环，在每个循环中，会记录荧光信号的变化。

b.实时监测荧光信号，根据荧光信号的变化来判断PCR反应的进行情况。

6.数据分析a.实时记录荧光信号的数值，生成实时荧光曲线。

b.通过计算机软件对实时荧光曲线进行数据分析，计算目标DNA的相对定量值。

7.结果解读a.根据相对定量值来判断样品中目标DNA的数量。

b.结果的解读可以通过进行标准曲线法或内部参照法进行。

8.结束实验a.关闭ABI7500实时荧光定量PCR系统。

b.清理和消毒实验区域和实验工具。

总结：ABI7500实时荧光定量PCR操作程序包括实验前准备、反应体系构建、试剂混合与装样、设置PCR程序、PCR反应、数据分析、结果解读和结束实验等步骤。

1. 目的：确保荧光定量PCR仪能够正确和正常的使用，保证扩增及结果分析的标准化、规范化。

2. 范围：适用于AB7500荧光定量PCR仪的使用及维护。

3. 定义：无4. 职责：荧光定量PCR仪使用人员负责本规程的实施。

质保部对本规定的有效执行承担监督检查责任。

5. 内容：5.1 室内温度控制在15～30℃，相对湿度45～75%。

5.2 仪器操作5.2.1 依次打开电脑显示器和电脑主机的电源开关，进入Windows界面。

5.2.2 接着打开AB7500仪器电源开关，预热10分钟。

5.2.3 点击7500 Software v2.3图标，打开软件。

5.2.4 按压仪器托盘上的按压位，待托盘弹出后，将所需检测的8联PCR反应管或者96孔PCR反应板放入检测孔位，记下放置位置。

检测8联PCR反应管用**反应孔模块，检测96孔PCR反应板用**反应孔模块。

（检测8联PCR反应管需放入盖紧管盖的空8联PCR反应管配平，检测96孔PCR反应板无需配平）5.2.5 再次按压托盘使其滑入仪器。

5.2.6 新建扩增参数模板：例如新建一个UG-63-62的模板，扩增参数是95°，10′；（95°，10″；63°，45″）×5 cycles；（95°，10″；62°，35″）×40 cycles，在62°时收集荧光信号（HEX、FAM信号），20μl反应体系。

5.2.6.1 在Setup-Plate Setup-Define Targets and Samples中，将T arget Name下的T arget1改成FAM；点击Add New Target，将新增的Target1改成HEX，点击Reportee下拉菜单，选择VIC。

5.2.6.2在Setup-Run Method-Graphical View中的Reaction Volume Per Well后面输入20（20μl反应体系）。

ABI 7500型荧光定量核酸扩增仪作业指导书1.目的：使ABI 7500型核酸扩增荧光定量检测仪能够正确和正常的使用，保证扩增及结果分析的标准化、规范化。

2.范围：ABI 7500型核酸扩增荧光检测仪。

3.性能参数：详见说明书4.程序：4.1.依次打开电脑显示器及电脑主机电源，进入windows XP 界面4.2.打开PCR主机电源4.3.点击桌面7500 software V2.0.6 图标，打开软件4.4.主界面点击SET UP 菜单下ADVANCED SETUP4.4.1.在试验属性界面：选择正确的机器型号，试验类型及试剂类型（探针法/染料法）4.4.2.在plate setup 界面，首先设定试验使用的探针，及样品名称，然后按照事先加样的位置顺序设定样品名称、类型，包括待检样本、阴性对照、阳性对照、阳性标准品、阳性室内质控样本。

4.4.3.在run method界面，编辑与试剂盒提供的温度程序相同的温度程序，包括温度与时间，及循环数4.5.将预先加好的0.2ML样品管按照设定顺序放置到仪器里面，进入到RUN界面，点击绿色START 按钮，弹出保存试验对话框，设定保存后，试验立即开始运行。

界面显示运行倒计时。

运行过程中在amplification plot界面可以查看实时的扩增曲线，在temperature plot界面可以查看实时的温度变化情况。

温度循环结束后试验自动结束。

5.结果分析5.1.在analysis setup里面修改各个探针的baseline与threshold数值，点击绿色analyze图标，软件及完成自动分析。

5.2.在amplification plot界面查看所有样品的扩增曲线。

6.整体曲线的观察,将所有曲线选中进行整体观察。

6.1.观察是否存在污染情况（包括标本污染和试剂污染），特别应注意大量曲线在同一 Ct值出现上涨的情况。

6.2.观察是否有光路传导阻滞或电压波动等机器原因形成的异常曲线。

荧光定量PCR标准操作程序ABI 7500荧光定量PCR仪标准操作程序1.打开UPS电源。

2.UPS电源稳定后，依次打开电脑和PCR仪，PCR仪开机时绿、黄、红3个灯全亮，最终绿灯常亮（如果是红灯常亮，则仪器运行不正常需联系仪器维护工程师排除仪器故障）。

3.双击桌面7500Sofeware V2.0.4图标，弹出Login界面，输入用户名，单击OK，进入实验设计主界面。

4.依次Set up→Advanced Setup→Experiment Menu，进入实验手动设计界面。

5.Setup→Experiment Properties→Experiment Name输入实验名称，选择染料类型，（如需选择SYBR Green Reagents，则必须选上溶解曲线选项）。

6.Setup→Plate Setup→Define Targets and samples设定染料探针名称、添加或删除探针和选择染料探针的报告基团和猝灭基团。

→Define s amples选择添加或删除样品。

→Assign Targets and samples 图标，可设定样品（S）、阴性对照（N）和标准品（S），并在右侧的96孔显示界面中设置每管的具体位置，尽量将样品管集中于96孔界面的中央位置。

注意：每管中都需选择加入染料探针。

7.Setup→Run Method→Graphical view设定PCR反应体系总体积、循环次数、添加或删除反应的阶段和步骤，以及反应的各个阶段和步骤的时间和温度。

（注意：由于数据的采集是在实验的延伸阶段，因此延伸阶段一定要选上数据采集图标，并且延伸时间不能少于35s。

）8.设置完毕后，向样品板中加入样品，单个样品管8连管需用专用平盖封好，96孔管用专用封膜封好，轻按样品槽右侧按钮，弹出样品槽，放入样品板，使A1朝向左上角，单手按住样品槽右侧按钮，将样品槽轻轻送进机体即可。

9.单击右上角绿色START RUN图标，开始实验。

ABPCR仪操作规程1、标本先处理，放入仪器后再进行以下操作。

记住标本所放的位置，设定反应板位置。

2、打开AB7500 PCR仪，双击桌面上。

3、点左上角文件（file）→ne w→出一界面点下一步（next），添加HBV（或HCV）探针，下一步，选中标本位置，选中Use HBV，close,点完成Finish。

稍等，提示与仪器连接完成。

4、选中标准品位置，task中选standard，单个设标准品浓度，Quantity，如5E5。

5、双点击U，添加sample name 如1，每个标本位置设置完成，包括质控。

6、点Instrument，在这一界面设扩增程序。

7、另存实验文件名（Fin e→sava as→E:date→Fine name 如20090429 保存。

8、在Instrumen 中选start，仪器开始运行（时间可能稍长一点，等待），时间倒记时，至实验结束。

9、在Result s→Amplifiantion Plot 选中全部标本（用鼠标同时按Ctrl或 Shift键操作）.10、Manual ct→ Manual Baseline →stant 6 →End 12,调整阈值，分析结果（Analyze），保存。

11、结果导出到D盘。

Fil e→Expor t→Result s→D:YT X→文件名，如20090429→save。

12、双击桌面中，解码程序中（或点左上角重启接口，显示解码程序），点结果文件如20090429，点检验项目如HBVDNA，入库。

13、在报告单中修改低于500的结果，为〈5.0E+2，打印报告单。

用已经设置好的程序打开（在桌面上），如HBV-KH或HCV-KH 标本先处理，放入仪器后再进行以下操作。

记住标本所放的位置，设定反应板位置。

1、打开AB7500 PCR仪，打开桌面上的HBV-KH或HCV-KH，（点击Retry,）提示与仪器连接完成。

2、选中标本位置点击（可全部选中，用Ctrl键），选中Use HBV，close。