神经HRP示踪显色液(DAB法)

神经生物学形态学方法（总结）一、束路追踪法（神经形态示踪方法）1. 辣根过氧化物酶示踪技术1971年，Kristenson和Olsson首先报道辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）可被神经末梢摄取，经轴浆逆行运输至神经元胞体，然后用组织化学方法即可显示出神经元的轮廓，从而创建了HRP追踪神经元示踪技术，即HRP法。

HRP法的基础是轴浆运输。

轴浆运输是神经元的一项基本活动，即沿其轴突有从胞体向末梢（顺向）及从末梢向胞体（逆向）的物质转运。

且不同的物质有不同的运输速度。

轴浆运输的特性为HRP在轴浆运输及其跨神经元的示踪技术奠定了基础。

该法为研究神经元之间的联系提供了一种简便可行的方法。

HRP是从辣根中提取出来的过氧化物酶，为一种结合酶，由一分子无色的酶蛋白与一分子棕色的铁卟啉辅基结合而成。

HRP比较稳定，63℃加热15min不失活。

其分子量约为40000，直径3.0nm，在水化情况下直径为5.34nm。

1966年，Shannom等曾将HRP分出A1、A2、A3 、B、C、D和E七种同工酶。

1976年，Bunt等曾试验了中枢神经系统对不同的HRP同工酶的摄取及运输能力，发现A同工酶几乎无逆行运输现象，而B、C同工酶的逆行运输效果较好，由此可见，HRP的选择是HRP追踪法成败与否的一个关键因素。

HRP法建立的早期，仅用于逆行追踪，即将HRP注入神经的末梢部位，经逆行轴浆运输至胞体，再通过酶组化染色显示。

以后的实验证明，HRP也可用于顺行运输，即将HRP注入神经元胞体所在部位，HRP可顺向运送至末梢部位。

近年来也发现，HRP注射于感觉神经末梢周围不仅可逆向标记背根节细胞，还可进一步沿背根节细胞顺向标记其所在脊髓的中枢投射，称为跨节标记（transganglionic labeling）。

与过去用于显示由损伤而引起纤维溃变的银染法相比，HRP法可更精确地研究神经纤维的联系。

TUNEL法检测细胞凋亡成功的经验与失败的教训总结TUNEL法检测细胞凋亡成功的经验与失败的教训总结1. 几种细胞凋亡检测方法中TUNEL法的优点和缺点是什么？2. TUNEL法的实验原理是什么？3. TUNEL实验中几个关键步骤是什么？4. 如何减弱非特异性染色？5. 细胞通透的时间如何选择？6. 内源性过氧化物酶的封闭时间和封闭液的浓度如何确定？7. TUNEL反应混合液的孵育时间可以调整吗？8. DAB的显色时间和条件如何把握？9. 首次做TUNEL实验的注意事项？10. PBS浸洗在TUNEL法中的作用和方法分别是什么？11. 脱蜡和水化在TUNEL法中的作用和方法分别是什么？针对问题3（TUNEL实验中几个关键步骤是什么？）：1. 充分脱蜡和水化。

脱蜡可以先60度20min，再用二甲苯两次5~10min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀；2. 把握好细胞通透的时间。

一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k 的孵育时间，常用10~30min，几um切片用短时间；几十um切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。

3. 适当延长TUNEL反应液的时间。

一般是37度1h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2h，但要结合你最终的背景着色。

4. DAB显色条件的选择。

一般DAB反应10分钟左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过30min；我不喜欢用promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色。

5.PBS的充分清洗。

我个人认为，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。

6. 此外，内源性POD的封闭也十分关键。

对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。

针对问题2（ TUNEL法的实验原理是什么？）：基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dTUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dTUTP与核断裂的DNA 3’-OH结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dTUTP上的biotin结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biotin分子），最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。

钙盐染色液，钙盐染色产品编码产品名称产品规格保存条件北京华越洋5NF061 钙盐染色液(茜素红S法) 2×50ml 室温,避光,6个月北京华越洋5NF062 钙盐染色液(改良茜素红S法)3×50ml 4℃,避光,6个月北京华越洋5NF063 钙盐染色液(硝酸银法) 2×50ml 4℃,避光,6个月用途：钙盐染色注意事项：钙沉积物成橘红色,染色时间取决于钙的含量,检测少量钙时更有效。

复染液为固绿。

MTT溶液过碘酸-雪夫（AB-PAS）染色试剂盒过碘酸-雪夫（快速）染色试剂盒糖原PAS过碘酸雪夫染色试剂盒Bennhold刚果红染色试剂盒钙盐染色液（FeH）染色试剂盒Gordon-Sweets银氨溶液100ml 结缔染色网状纤维染色,可区分胶原纤维网状纤维染色试剂盒(改良Gomori氨银法) 5×100ml 结缔染色网状纤维染色,可区分胶原纤维网状纤维染色试剂盒(改良Gomori氨银法) 5×50mlGomori氨银溶液500ml 结缔染色网状纤维染色,可区分胶原纤维羟胺溶液(1.5mol/L,pH8.5) 100ml 135 室温,3个月细胞其他青霉素-链霉素混合溶液(100×双抗) 100ml 68 —20℃,12个月抗生素青霉素-链霉素-庆大霉素混合溶液(100×三抗) 100ml 195 —20℃,12个月抗生素秋水仙碱溶液(Colchicine,10mg/ml) 5ml 143 4℃,避光,6个月药物去离子甲酰胺100ml 120 4℃,避光,12个月RNA溶液任氏液500ml 128 4℃,3个月细胞其他溶菌酶(Lysozyme,10mg/ml) 5ml 90 —20℃,12个月核酸提取鞣酸/单宁酸水溶液(5%) 100ml 68 室温,12个月结缔染色乳酸酚棉蓝染色液100ml 180 室温,避光,12个月微生物染色乳酸脱氢酶染色液(H型,四唑盐法) 2×50ml 375 4℃,避光,6个月酶类染色乳酸脱氢酶染色液(M型,四唑盐法) 2×50ml 375 4℃,避光,6个月酶类染色乳酸脱氢酶染色液(四唑盐法) 2×50ml 360 4℃,避光,6个月酶类染色乳酸银显影液100ml 105 室温,避光,6个月免疫组化瑞氏-姬姆萨复合染色液2×100ml 188 室温,12个月微生物染色瑞氏-姬姆萨复合染色液2×500ml 630 室温,12个月微生物染色瑞氏染色液(Wright stain) 2×50ml 75 室温,12个月微生物染色瑞氏染色液(Wright stain,) 2×100ml 113 室温,12个月微生物染色瑞氏染色液(Wright stain,) 2×500ml 390 室温,12个月微生物染色瑞氏染色液(Wright stain,即用型) 100ml 105 室温,12个月微生物染色瑞氏染色液(Wright stain,即用型) 500ml 375 室温,12个月微生物染色弱磷酸盐缓冲液(LoPBS,pH7.0) 100ml 120 4℃,12个月蛋白其他噻嗪红染色液(0.1%) 100ml 90 室温,避光,12个月染色其他噻嗪红染色液(0.2%) 100ml 105 室温,避光,12个月染色其他三磷酸腺苷溶液(ATP,10mmol/L) 10ml 75 —20℃,12个月PCR相关三氯化铁水溶液(10%) 100ml 53 室温,12个月常规其他三羟甲基甘氨酸加样缓冲液(2×) 10ml 75 4℃,6个月蛋白电泳沙黄/藏红T水溶液(2%) 100ml 83 室温,避光,6个月微生物染色山梨醇-磷酸盐溶液(1.2mol/L,pH7.5) 100ml 68 室温,6个月细胞组分分离山梨醇-磷酸盐溶液(1.2mol/L,pH7.5,无菌) 100ml 128 室温,6个月细胞组分分离山梨醇溶液(1.1mol/L,无菌) 100ml 113 室温,6个月细胞组分分离山梨醇溶液(1mol/L) 100ml 60 室温,6个月细胞组分分离山梨醇溶液(1mol/L,无菌) 100ml 105 室温,6个月细胞组分分离神经HRP示踪显色液(DAB法) 50T 165 4℃,避光,6个月神经染色神经HRP示踪显色液(TMB法) 50T 165 4℃,避光,6个月神经染色生理盐水(1×NS,无菌) 500ml 45 室温,12个月常规其他生理盐水(10×NS,无菌) 500ml 53 室温,12个月常规其他石碳酸复红染色液100ml 135 室温,避光,18个月微生物染色双链DNA变性缓冲液100ml 75 室温,12个月核酸杂交双缩脲法蛋白定量试剂盒500T 150 4℃,12个月蛋白检测双缩脲法蛋白定量试剂盒1000T 255 4℃,12个月蛋白检测双缩脲总蛋白试剂100ml 75 4℃,12个月蛋白检测水饱和酚(Phenol Water) 100ml 90 4℃,避光,3个月核酸提取顺丁稀二酸缓冲液(MAB,pH7.5) 500ml 90 室温,36个月核酸电泳苏丹Ⅲ酒精饱和溶液100ml 120 室温,避光,12个月脂类染色苏丹Ⅲ脂肪染色液3×50ml 240 室温,避光,12个月脂类染色苏丹Ⅳ染色液3×50ml 225 4℃,避光,12个月脂类染色苏丹Ⅳ染色液-A液100ml 120 室温,避光,12个月脂类染色酸性磷酸酶染色液(偶氮偶联法) 2×50ml 885 4℃,避光,6个月酶类染色酸性磷酸酶染色液(硝酸铅法) 2×50ml 300 4℃,避光,6个月酶类染色酸性乙醇分化液(0.5%) 500ml 75 室温,12个月染色其他。

DAB显色液的主要成分包括：
1. 抑制剂：含有3%过氧化氢溶液。

2. 通用HRP多聚体：包含有HRP标记的抗体混合物（山羊抗小鼠IgG，山羊抗小鼠IgM和山羊抗兔）（<50 μg/mL），溶于含ProClin （r）300 防腐剂的蛋白质缓冲液中。

3. DAB显色剂：在专用稳定剂溶液中含有3，3'-二氨基联苯胺盐酸盐，添加专用防腐剂。

4. DABH2O2：在磷酸盐缓冲液中含有0.04%过氧化氢。

5. 铜：在醋酸盐缓冲液中含有硫酸铜（5g/l），添加专用防腐剂。

此外，还包括表面活性剂，可以提高DAB显色液的溶解性和渗透性，使其更容易渗透到生物组织中。

常用的表面活性剂有Tween-20、Tween-80等。

以上信息仅供参考，建议查阅专业书籍或者咨询专业人士。

免疫组织化学试题参考答案一、名词解释：1.PAS 反应：即过碘酸--雪夫反应显示糖原，简称证。

PAS 反应。

其原理是通过利用过碘酸的氧化作用，7.诱发荧光：组织细胞中的某些物质本身不发荧使糖分子中的二醇基氧化为二醛基，释放出醛基，光，但在经过一定的化学反应后可以转变成荧光分与碱性品红反应，生成紫红色化合物沉淀。

子。

此技术目前主要应用在生物胺的显示中。

其中2.Feulgen 法：即福尔根反应显示DNA 法。

其原最重要的是甲醛和乙醛酸诱发多巴胺、去甲肾上腺理是组织用1NHCl 60℃水解，将DNA分子中脱氧素、肾上腺素和5—羟色胺荧光，以及邻苯二醛诱核糖核酸与嘌呤间的连链打开，使之释放出醛基与发组织胺荧光的反应。

碱性品红发生反应，生成紫红色化合物沉淀。

8.定量分析：定量判断是结果判断中最重要也是具3.PAP 法：即过氧化物酶一抗过氧化物酶法，该技有意义的判断，其判断结果有助于统计学的分析处术原理与其他免疫定位技术相同，即通过抗体使标理。

组织细胞化学结果的定量分析又称定量组织细记分子（抗辣根过氧化物酶）定位于抗原附件。

其胞化学，指在组织细胞化学阳性结果的基础上，对不同点为三步法，且有放大作用，反应完全依赖于阳性结果（最终阳性产物）进行测量，以数值反应免疫学结合，不需要标记任何抗体，反应灵敏度高，被检测物质的含量。

此法是阳性结果的进一步检测背景低。

注意一抗与复合物中的抗体必须来源于同和分析，更加直观地反应实验结果，更有力地说明一种动物，且二抗必须过剩。

实验结果。

常用有人工定量分析与仪器定量分析两4.核酸探针：指能与特定核酸序列发生特异性互补类。

的已知标记的核酸片段，可检测待测样品中特定的9.固定：为了更好的保持细胞和组织原有的形态结基因序列。

无标记的探针称裸探针。

构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定，5.核酸分子杂交：指具有互补序列的两条核酸单链其作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抵制外在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。

辣根过氧化物酶(hrp)法的发明
辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）法是一种常用的生物化学实验方法，用于检测分析物质或者观察某种化学反应的过程。

HRP法的发明可追溯到20世纪50年代初。

该方法最早是由英国科学家WG Tapper于1954年发明，他首次用辣根（一种根茎植物）中的过氧化物酶（peroxidase）作为催化剂来观察化学反应。

HRP法的原理是利用辣根过氧化物酶作为催化剂，加入过氧化氢（hydrogen peroxide）和某种显色底物（如TMB或DAB），辣根过氧化物酶会催化底物的氧化反应并产生显色产物，从而使观察者能够观察到某种化学反应的进行。

HRP法在科学研究和医学诊断中得到了广泛应用。

它可以用于检测分析物质的浓度、观察某种酶活性、研究分子相互作用等。

此外，HRP法还被广泛用于酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）和免疫组织化学领域。

辣根过氧化物酶法的发明开创了一种新的生物化学实验方法，为科学研究和医学诊断提供了一种快速、敏感、特异的检测手段，并在很大程度上促进了生物化学领域的发展。

仅供科研版本号：161208 DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(20×)【产品组成】【保存条件】-20℃,避光,12个月【产品概述】DAB辣根过氧化物酶显色液(DABHorseradishPeroxidaseColorDevelopmentKit)是一种依据辣根过氧化物酶(HRP)结合显色，用于免疫组化显色、原位杂交显色或Western、Southern、Northern、EMSA等膜显色的试剂盒。

DAB即3,3N-DiaminobenzidineTertrahydrochloride,是辣根过氧化物酶的常用底物。

在辣根过氧化物酶的催化下,DAB会产生棕色沉淀，该棕色沉淀丌溶于水和乙醇。

因此在DAB显色后,还可以使用溶于乙醇的染料进行后续染色。

本显色液可以用于细胞或组织在免疫组化或原位杂交时结合的辣根过氧化物酶显色，也可用于Western 等结合有辣根过氧化物酶的膜的显色检测。

同时也可以用于细胞或组织内源性的辣根过氧化物酶显色。

【使用方法】1、常规组织切片、细胞样品、膜不辣根过氧化物酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。

对于检测内源性辣根过氧化物酶的组织或细胞样品，在适当固定后，也可用洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。

2、按(A):试剂(B):蒸馏水=1:1:18的比例混合,即为DAB染色工作液，即配即用。

3、洗涤过组织后，去除洗涤液，加入适量DAB染色工作液，确保覆盖样品。

4、室温避光孵育30min或更长时间，直至显色至预期深浅。

5、去除DAB染色工作液，用蒸馏水清洗1～2次即可终止显色反应。

6、对组织切片或细胞样品，反应终止后，如有必要可用中性红染色液染色，便于观察。

对于膜染色，反终止后可室温晾干避光保存。

【常见问题及可能原因】1、背景显色太深①在免疫组化时如果背景显色太深，考虑使用适当的封闭液进行封闭，例如选购适当的封闭液或使用和一抗相同来源的血清(10%)进行封闭。