细胞总蛋白的制备,SDS-PAGE,WesternBlot

1培养细胞总蛋白的抽提1)将代测细胞标准条件下培养48h，PBS洗涤2次，用细胞刮匙轻轻将细胞从培养瓶中刮下，收集细胞总量1×107个。

1500rpm离心10min，弃上清。

2)PBS洗涤2min×3，每次1500rpm 离心10min，弃去上清。

3)150μl三去污细胞裂解液重悬细胞，冰上静置30min。

15000rpm离心30min弃去沉淀，细胞总蛋白即在上清液中。

三去污细胞裂解液的成分：50mM tris-HCl, pH 8.0,150 mM NaCl,0.5% 去氧胆酸钠1% NP-400.1% SDS1 mM EDTA100 μg/ml苯甲基磺酰氟(PMSF) （临用前配制）10U/ml aprotinin（临用前配制）4)将蛋白定量、分装。

细胞总蛋白经BCA Protein Assay ReagentKit定量后分装保存。

Western blot检测（ECL法）1）SDS-PAGE（凝胶）电泳：配制12%的分离胶和5%的浓缩胶。

取15μl样品液和3μl 6×加样缓冲液，混匀。

煮沸5min使蛋白变性后上样，每孔上样量约为30μg。

110V恒压电泳约90min，至溴酚蓝完全消失。

SDS-PAGE的配制成分分离胶(12%) 浓缩胶(5%)去离子水 1.6ml 1.8ml3%AA母液 2.0ml 0.3ml1.5M Tris-HCl (PH8.8) 1.3ml --1 M Tris-HCl (PH6.8) -- 0.75ml10% SDS 50μl 30μl10%过硫酸胺(APS) 50μl 50μlTEMED 5μl 5μl总体积5ml 3ml2）转膜：电泳完毕后，切去浓缩胶，将胶浸于蛋白转移缓冲液中平衡10-20min。

用湿转的方法将蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上( SDS-凝胶位于负极，硝酸纤维素膜位于正极)，0.3A 恒流电泳80min。

3）封闭：转膜结束后，取下硝酸纤维素膜，PBS浸泡5 min后将膜浸于含5%脱脂奶粉的PBS(MPBS)中1 h。

Western blot实验步骤一、制备蛋白样品（单层贴壁细胞总蛋白提取）1.倒掉细胞培养液,加3ml预冷的PBS洗涤细胞，重复两次，弃掉PBS后将细胞培养瓶置于冰上。

2.裂解液RIPA(强)1ml +PMSF10ul(100:1),两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞，冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。

3.裂解完后，用细胞刮将细胞刮于一侧（动作要快），转移至ep管中.4.4度，12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中，用于后续实验（-80保存）常用蛋白收样：倒掉细胞培养基后，预冷PBS洗涤细胞2次，弃去，再加入1ml PBS，用细胞刮轻轻刮取细胞，转移至1.5ml ep管中，12000rpm，离心5min，尽量吸净上清，沉淀于-80保存，用于后续实验。

融化蛋白样品，加入RIPA+PMSF细胞裂解液（200ul/ep管），充分混匀，冰上裂解20min，4度离心，5min ，12000rpm，小心吸取上清至新的ep管中。

二、蛋白浓度测定(BCA法)BCA(碧云天)蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul。

在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。

标准蛋白BSA浓度：5mg/ml (-20保存) ,完全溶解蛋白标准品，取10ul稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml(ug/ul)。

蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。

但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。

1. 配置BCA工作液A液： B液= 50 : 1 ，混匀 A液+B液=200ul (每个样本)样本数量： 7个标准品 + N 个待测蛋白样本2. 先将每孔加入200ul BCA工作液，再加入蛋白样本。

（96孔板）,总体积为10ul.待测蛋白样本先10倍稀释。

3.37度，温箱中孵育30min。

Western BlotWestern Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄（NC ）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF ）膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。

流程：蛋白样品的提取→蛋白样品定量与变性→PAGE 凝胶电泳→转膜→丽春红染色→封闭→抗体孵育→底物显色。

实验器材和试剂：一． 蛋白提取试剂1.10% SDS 裂解液：称取10g SDS 粉末加入双蒸水至90mL ，充分溶解，定容至100ml 室温保存。

2.RIPA 裂解液1ml 裂解液工作液配方： 10ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.2ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 5.0ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)0.9848ml 裂解液0.5ml 裂解液工作液配方： 5ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.1ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 2.5ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)0.4924ml 裂解液 PMSF 必须摇匀至无结晶时才可与裂解液混合3．蛋白酶抑制剂：100mmol/L PMSF ：17.4mg PMSF 粉末溶于1ml 异丙醇(AR)，分装250ul 每管后－20℃保存。

使用终浓度为1 mmol/L 。

【PMSF ：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。

PMSF 剧毒，严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险一旦眼睛或皮肤接触了PMSF ，应立即用大量的水冲洗。

一、western blot 的定义：即蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。

二、western blot 的原理先制备蛋白质样品，再利用SDS-PAGE原理，分离不同的蛋白质，再将分离的蛋白质进行转膜，以便固定在新膜上进行抗原-抗体结合。

用固定在膜上的蛋白质作为抗原与对应的非标记抗体（一抗）结合。

由于此过程中，可能有未结合到抗原的抗体遗留，故需要清洗，以便保存特异性结合的抗原-抗体结合物。

抗原抗体结合物暴露出一个Fc片段，相应的二抗可以结合到这个片段上，形成抗原-一抗-二抗结合物，再用相应的过氧化物酶或碱性磷酸酯酶标记到二抗上，由于加入的标记物相对质量分子很大，可以用离心作用将其沉淀下来，如果抗原与抗体结合，便可以一起沉淀下来，最后通过显色反应或放射自显影法便可检测凝胶中的蛋白成分了。

三、Westernblot法操作步骤是：Westernblot第一步将被分析的蛋白样品做SDS—PAGE凝胶电泳，使样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成条带。

Westernblot法第二步把凝胶中的蛋白转移到膜上(所谓印迹)，其中用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC膜)和PVDF膜。

蛋白转移的方法多采用电转移，也有用吸印法转移的(原理与Southern blotting类似)电转移又有半干法和湿法之分，本实验采用后者。

bio-rad专家还提到Westernblot法最后一步是用特异性的抗体检测，看印迹膜上是否存在相应抗原。

免疫检测的方法可以是直接或间接的，现在一般都是采用间接免疫配标的方法。

在用特异性的第一抗体染色后，再用酶标的第二抗体(辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)标记的抗第一抗体的抗体)染色，再加酶的底物显色，通过膜上显现出的颜色或经化学发光在x光底片上出现的曙光条带来显示抗原的存在。

westernblot原理及过程
1、Western Blot的原理是：蛋白质是带电的，在聚丙烯酰胺凝胶中通过SDS-PAGE分离蛋白质后，蛋白质被固定在凝胶中。

当凝胶被转移到支持物（例如NC膜或PVDF膜）上时，蛋白质在膜上保留其电荷。

通过针对特定氨基酸序列的特异性抗体作为探针检测蛋白质的位置。

这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析。

2、Western Blot的过程大致分为以下几步：
蛋白提取：从细胞或组织中提取总蛋白质混合物。

蛋白定量：确定凝胶中蛋白质的浓度。

SDS-PAGE电泳：通过SDS-PAGE分离蛋白质混合物。

电转印：将分离的蛋白质从凝胶转移到支持物（例如NC膜或PVDF 膜）上。

封闭：用含有去污剂和牛血清白蛋白的溶液处理膜，以封闭膜上的任何未结合位点。

抗原-抗体免疫反应：使用特异性抗体检测目标蛋白质的位置。

蛋白检测：使用化学发光剂检测膜上的目标蛋白质。

细胞总蛋白的提取（1）离心后，弃去上清液，将收集的细胞用手指轻弹重悬于剩余的少量上清液中，转移至1.5ml离心管内，用1×PBS溶液洗涤2次，每次加入1mL PBS溶液，1000r/min，4℃离心5min，弃上层液体。

洗涤两次后，将上清液完全去除，用手指轻弹细胞团，使其分散重悬（若不分散，则无法与裂解液充分混匀）。

（2）每管加入细胞团等体积的含蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA细胞裂解液；如需检测磷酸化蛋白，则需另加入磷酸酶抑制剂。

使细胞裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min。

如暂不提取蛋白，也可在洗涤细胞2次后加入含蛋白酶抑制剂cocktail和磷酸酶抑制剂的1×PBS约100μL，1000r/min，4℃离心5min后，完全弃上层液体，置于-80℃冰箱保存备用。

（3）冰上超声处理细胞，每次超声2s，间隔3s，约10-20次。

（4）13000r/min，4℃离心15min，收集上清溶液至另一干净并预冷的1.5mL离心管中，于-80℃冰箱保存备用。

2. BCA法测定蛋白质浓度（1）配制工作液根据标准品及待测样品的个数，按BCA试剂A和试剂B体积比为50:1配制足量BCA 工作液，充分混匀，置于常温备用。

（2）配制标准品取原标准品BSA（2mg/mL）约100μL，取出50μL，用ddH2O按对数法稀释成如下浓度：1mg/mL、0.5mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL；设置96孔板第一横排第一孔为空白孔，第二横排第一、二孔加入20μL 1×PBS，从第三横排起，按浓度梯度由低到高依次取20μL标准品至96孔板中，每一浓度做2个平行孔。

（3）稀释待测样品取5μl待测蛋白样品，用ddH2O稀释到50μL，分别取20μL至96孔板中，每一浓度做2个平行孔；（4）分别加入200μL BCA工作液到蛋白标准品及待测样品中，轻轻混匀，并去掉每孔中的气泡，置于温箱37℃孵育30min。

westernblot电泳原理Western blot电泳是一种分离和鉴定蛋白质的方法，它基于电泳原理，可以将蛋白质按照分子量大小分离并定位到膜上，然后通过染色、显影等方式检测目标蛋白质的存在和数量。

Western blot电泳主要分为4个步骤：样品制备、SDS-PAGE电泳、蛋白印迹，以及染色、显影。

下面将对每个步骤进行详细介绍。

第一步：样品制备在进行Western blot电泳之前，需要对样品进行制备。

一般来说需要采用还原剂和蛋白酶抑制剂等化学试剂处理样品，以避免蛋白质被氧化或降解，保证电泳结果的准确性。

常见的还原剂有DTT和β-mercaptoethanol等。

另外，还需选用相应的溶解液处理样品，使蛋白质完全溶解并不附着于膜上。

第二步：SDS-PAGE电泳在样品制备完成后，需要将蛋白质进行分离。

SDS-PAGE电泳就是最常用的蛋白质分离方法之一。

它利用SDS与蛋白质的作用，使得蛋白质的形态发生改变，变为线性构象。

同时SDS还赋予蛋白质等电性，可以使得蛋白质按照分子量大小进行迁移。

在SDS-PAGE电泳，要将样品加入凝胶槽中，施加电场，使蛋白质向电极迁移。

随着时间的推移，蛋白质会按照分子量大小被分离到不同位置。

经过电泳，蛋白质带会形成。

第三步：蛋白印迹蛋白印迹是Western blot电泳的核心步骤，它将已经分离好的蛋白质转移到膜上，并固定在膜上以方便后续的染色和检测。

常用的膜包括尼龙膜、nitrocellulose膜和PVDF膜等。

在印迹过程中，需要将SDS-PAGE凝胶与膜叠在一起，并由电流进行迁移，使蛋白质分子也迁移至膜上，形成同样的蛋白质带。

通过此步骤，可以在膜上确定蛋白质的位置和分子量。

第四步：染色、显影蛋白印迹完成后，即可进行染色、显影。

通常的做法是利用特殊的染料如蛋白质染料Ponceau S染色检测蛋白质是否在膜上，并调整印迹的质量。

对于染色后的膜，可以通过荧光素着色、成像的方式直接观察目标蛋白的含量。

蛋白质提取原理：使用机械法破坏细胞膜，将细胞内的蛋白质释放到溶液中，然后通过离心或过滤的方法去除细胞碎片、细胞核和细胞碎片等杂质，以得到较为纯净的蛋白质上清液→通过加入盐或有机溶剂等物质，使蛋白质发生沉淀，然后通过离心将沉淀的蛋白质分离出来→通过柱层析、电泳、凝胶过滤等方法进一步纯化蛋白质，去除其他蛋白质、核酸、小分子物质等杂质，使目标蛋白质得到更高纯度。

方法：组织液氮冷冻，研磨成粉末状→加入适量蛋白提取液，冰上放置20 min→4℃，12000 rpm离心10 min→吸上清，在通风橱加入5×Loading Buffer，99 ℃加热10 min，冰上冷却用于Western bolt 或-20℃保存。

5×Loading Buffer配方：①Tris-HCl (250 mM)：Tris-HCl 是一种缓冲盐，用于维持溶液的酸碱平衡，常用于蛋白质提取过程中调节pH 值的作用；②SDS (10%)：SDS （十二烷基硫酸钠）是一种离子型表面活性剂，具有溶解蛋白质和破坏细胞膜的作用，常用于蛋白质提取和电泳分析中；③BPB (0.5%)：BPB（溴酚蓝）是一种染色剂，常用于帮助观察蛋白质电泳分析结果，以检测样品前进方向和监测蛋白质迁移速度；④甘油(50%)：甘油是一种保护剂，可以增加蛋白质提取液的粘度和稳定性，有利于蛋白质的溶解和保存；⑤β-巯基乙醇(5%)：β-巯基乙醇（巯基乙醇）是一种还原剂，可以断裂蛋白质之间的二硫键，有助于蛋白质的还原和解聚。

Western bolt原理及步骤原理：Western Blot是一种常用的蛋白质检测技术，它能够检测复杂蛋白混合物中的某个蛋白的存在，还可以确定其大致分子量，检测其表达水平变化等。

WB以组织或细胞中的蛋白质为研究对象，经过SDS-PAGE分离蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

wb细胞蛋白提取步骤一、背景介绍WB（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析方法，通过将蛋白质样品经电泳分离后转移到膜上，再与特异性抗体反应并检测，从而确定目标蛋白的存在与表达水平。

而WB细胞蛋白提取是WB实验的前提，本文将介绍WB细胞蛋白提取的步骤。

二、实验器材准备1. 细胞培养器：细胞培养器是培养细胞的必备设备，可提供适宜的温度、湿度和CO2浓度等环境条件。

2. 细胞离心管：用于离心细胞，分离细胞上清液和细胞沉淀。

3. 细胞裂解液：细胞裂解液是提取细胞蛋白的重要试剂，可选择RIPA缓冲液等。

4. 低温冰箱：用于保存试剂和细胞裂解液等在实验过程中需要低温保存的物品。

5. 离心机：用于离心细胞、沉淀蛋白等。

三、细胞样品准备1. 细胞培养：将需要研究的细胞株在无菌条件下培养至对数生长期。

2. 细胞收集：用PBS等缓冲液洗涤细胞，使细胞悬浮液中不含有培养基或其他杂质。

3. 细胞裂解：将细胞悬浮液加入细胞裂解液中，用震荡器或超声波仪器进行细胞裂解。

四、细胞蛋白提取1. 细胞裂解：将细胞裂解液和细胞悬浮液混合，通过震荡器或超声波仪器进行细胞裂解，破坏细胞膜释放细胞内的蛋白质。

2. 离心：将细胞裂解液离心，分离出细胞碎片和细胞膜等残留物，得到上清液。

3. 蛋白含量测定：使用BCA或Bradford方法等，测定提取的蛋白液中的蛋白质浓度，以便后续实验的样品配比。

4. 储存：将提取的蛋白液分装成适量的小管，存放在低温冰箱中保存，避免蛋白质降解和污染。

五、质检和实验准备1. SDS-PAGE凝胶制备：根据需要分离的蛋白质大小，选择合适的凝胶浓度，制备SDS-PAGE凝胶。

2. SDS-PAGE电泳：将提取的蛋白液按照浓度进行加载，进行电泳分离。

3. 转膜：将电泳分离后的蛋白质转移到PVDF或nitrocellulose膜上，使蛋白质固定在膜上。

4. 阻断：将转膜后的膜放入蛋白质阻断液中，阻断膜上未结合的部分空位。

Western-Blot操作流程试剂配制蛋白提取试剂1. RIPA裂解液：50mM Tris（MW121.14，PH7.5） 3.02g150mM NaCl 4.38g1%TritonX-100 5ml1%脱氧胆酸钠5g0.1%SDS 0.5g蒸馏水至500ml。

调pH值至7.5。

混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。

使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。

2. 蛋白酶抑制剂cooktail所需母液成分：（1）100mmol/L PMSFPMSF 17.4mg异丙醇1ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。

（2）10mM 亮肽素leupeptin: -20℃保存（3）2.1mg/ml 抑肽素Aprotinin: 4℃保存配制：成分终浓度每ml裂解液所加母液量PMSF 1mmol/L（储存浓度稀释100倍）10ulLeupeptin 0.1mmol/L（储存浓度稀释100倍）10ulAprotinin 1ug/ml （储存浓度稀释2000倍）0.5ul各成分直接加入所用的RIPA裂解液中，之后按照60ul/孔（12孔板）提取蛋白。

蛋白定量试剂1. G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）考马斯亮蓝G250 100mg95％乙醇50ml85％磷酸100ml蒸馏水至1000ml配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存于棕色瓶中。

2．牛血清白蛋白BSA储存液（1mg/ml）：100mg BSA粉末溶于20 ml双蒸水，定容至100 ml，加少量防腐剂，4℃保存。

上样用试剂1．4X上样缓冲液1.0 mol/L Tris·HCl（pH6.8）2mlSDS 0.8g溴酚蓝0.04g甘油4ml去离子水定容至10ml。

混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。

使用时稀释成1X。

2．1.0 mol/L二硫苏糖醇（DTT）（10X）用20 ml 0.01 mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT,分装成1ml小份储存于-20?C。

总蛋白Westernblot检测[正常成纤维细胞总蛋白的提取]（1）培养正常成纤维细胞，待细胞生长密度达到70-80%时更换无血清培养基培养并且加入处理因素。

（2）以下所有步骤均在冰上操作。

在到达处理时间后，将培养瓶取出置于冰上。

弃去原培养基，用预冷的PBS溶液清洗细胞两次。

（3）每个培养瓶中加入400μl RIPA细胞裂解液（其中含有1% PMSF试剂），摇晃培养瓶使RIPA均匀分布在小皿中。

用细胞刮将瓶中的细胞尽量刮至角落。

用移液枪将全部液体移入新的预冷的EP管中。

（4）冰上裂解30 min，每5 min最大涡旋10秒。

（5）12000g，4℃离心15min。

（6）转移上清至新的预冷的1.5 ml EP管中。

用Qubit蛋白定量检测方法测定细胞总蛋白含量。

[ Western-blot操作步骤]（1）蛋白样品前处理：蛋白样品与5×Loading Buffer按4:1比例混匀，在沸水中煮5min，瞬离后待用。

上样总体系为30μ1，不足的部分用1×Loading Buffer补充，（2）配胶：配置10%的分离胶，放置30min后待分离胶凝固后在其上配置5%的浓缩胶，并且插上10孔的梳子，放置90min，收好备用。

（3）SDS-PAGE电泳：使用微量进样针给每孔加样，浓缩胶电压为70V，电泳30min；待到溴酚蓝前沿进入分离胶后，将电压调整到120V，电泳60-80min，使得溴酚蓝电泳到分离胶底部。

剪取合适大小的PVDF膜，用甲醇浸泡5min，然后浸于电转液中备用。

其他电转部件充分浸泡于回收电转液中15min。

（4）转膜：电泳完成后，小心取出玻璃板，厚板朝下用割胶刀轻轻撬开薄板，将PVDF膜贴上，按照膜的大小和预染maker的指示切割凝胶，将切下的胶和膜在新鲜配置的电转液中浸泡10min以上。

转膜按照经典Western三明治法负极朝下依次放置海绵、厚滤纸、凝胶、PVDF膜、厚滤纸以及海绵，注意赶走每层中的气泡。

western blot实验内容Western Blot实验内容可以简单描述为一种生物化学分析技术，主要用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的存在和表达水平。

该实验通常包括以下步骤：1. 样品制备：首先，从细胞培养物或组织中提取蛋白质。

这可以通过细胞裂解和蛋白质提取试剂盒等方法来完成。

2. SDS-PAGE电泳：将提取的蛋白质样品通过SDS-PAGE凝胶电泳进行分离。

在SDS-PAGE中，样品中的蛋白质按照大小被分离成不同的带状条带。

3. 转印：将分离的蛋白质通过电泳转印技术转移到聚丙烯酰胺薄膜（或称为膜）上。

膜可以是尼龙膜或聚乙烯膜。

4. 阻断：将膜置于含有蛋白质阻断剂（如牛血清蛋白或脱脂奶粉）的缓冲液中，以阻止非特异性结合。

5. 一抗孵育：将膜与特异性抗体（一抗）一起在某种缓冲液中孵育。

这些一抗可以结合到目标蛋白质上。

6. 洗涤：通过多次洗涤，去除与一抗非特异性结合的蛋白质。

7. 二抗孵育：膜与与一抗的物种不同的次级抗体（二抗）一起在缓冲液中孵育。

二抗与一抗结合，形成复合物。

8. 洗涤：去除与二抗非特异性结合的蛋白质。

9. 显色：将特定酶底物添加到膜上，使目标蛋白质变色。

例如，常用的酶底物是辣根过氧化物酶（HRP）和4-氨基乙基硅烷（DAB），可以生成棕色的色斑。

10. 图像获取和分析：使用相应的设备（如基于膜的成像系统）捕捉膜的图像，并使用分析软件定量分析蛋白质的表达水平。

通过Western Blot实验，研究人员能够检测和定量不同细胞组分中蛋白质的存在和表达水平，从而深入了解生物系统的功能和调控机制。

蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项实验方法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基乙醇ddH2O甘氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。

3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24 g；加ddH2O至1000 ml。

5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸 2 ml；ddH2O118 ml。

Western Blot一、蛋白制备1.蛋白质提取（细胞样品一般约10-20ug）2.BCA法测定蛋白浓度（A562）3.蛋白处理1）分装不同样本蛋白，稀释至相同浓度，加入对应的5×Loading buffer。

(用前加25ul β-巯基乙醇）。

2）煮沸5分钟后瞬时离心，12000rpm，2min，取上清，至于冰上冷却，不可置于4℃冰箱。

二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)A.实际操作1.做胶前的准备1）检查是否有足够的干净的梳子、玻璃板和架子。

2）检查是否有新鲜的，足量的10%AP，没有立刻重配。

3）按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度。

2.制胶，电泳1）装好架子注：TEMED最后加，在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好地凝集，30min左右胶凝固。

4）倒好后插入预先准备好的梳子，浓缩胶的高度以插入梳子后1cm（低于1cm 适当调低电压）比较合适，胶要充分凝集，否则影响浓缩效果。

待胶凝集好后，上样（加Marker，一般用6-8ul），电泳。

选择恒压时，浓缩胶用60-80v电压，当样品至分离胶时，用100-120V电压。

选择恒流时，浓缩胶为10mA，分离胶为20mA。

一般电泳时间在100min（75V，40min；110V，60min）左右。

B：电泳加样操作1.玻璃板对齐后放入玻璃板夹紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶）。

2.按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶，灌胶时，吸取4.2ml左右胶沿玻璃板灌入。

随后在胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。

（注意：灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度；操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。

加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。

)3.当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。

30分钟左右，胶大体凝固。

可以做好分离胶后待其定型后放入4度冰箱过夜。

附录一Western blotting实验步骤1．组织总蛋白样品制备：取适量组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。

将组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清，样品分装冻存于-20℃备用。

细胞总蛋白样品制备：对于悬浮细胞：离心收集细胞，每106细胞加250 ul细胞总蛋白提取试剂（在使用前数分钟内加入cooktail+磷酸化蛋白酶抑制剂），振荡。

对于贴壁细胞：用TBS冲洗细胞2-3次。

最后一次彻底吸干残留液。

加入适当体积的细胞总蛋白提取试剂（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。

期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。

用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。

冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。

12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。

2 .测定蛋白浓度：2.1 按50：1配置BCA工作液。

2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。

2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。

2.4 分别加PBS定容至20ul。

2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。

，依标准曲线算出蛋白浓度。

2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A5623 SDS-PAGE电泳：3.1 制胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。

同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。

医学生物学研究技术与实验实验报告实验名称：细胞总蛋白的制备,SDS-PAGE，Western Blot一、实验目的1. 掌握SDS直接裂解细胞法提取蛋白质2. 掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理3. 掌握SDS-PAGE分离蛋白质的原理和技术4. 掌握半干转移的操作和Western Blot 的原理和技术二、实验原理1. 蛋白质提取常见裂解方法极其原理。

蛋白质的抽提是指破碎过程中，将生物材料在水，缓冲液或稀盐溶液等适当溶剂中浸泡，使胞内的蛋白质等内容物释放到溶剂中。

血浆，消化液和分泌液等体液中可溶性蛋白质，可不经抽提，直接进行分离。

细胞内一般蛋白质的抽提，应先将细胞膜或细胞壁破碎，然后用适当溶剂将蛋白质溶出，再用离心法除去不溶物，得到出抽提液。

膜蛋白的抽提比较复杂。

膜蛋白按其所在位置分为外周蛋白和固有蛋白。

外周蛋白通过次级键和膜外侧脂质的性头部鳌和在一起，应选则适当离子强度及PH的缓冲液，其中要好友EDTA，将其抽出。

固有蛋白嵌和在膜脂质双层中，通过疏水键于膜内侧脂质层的疏水性尾部结合。

在抽提固有蛋白时，要减弱器与膜脂的疏水性结合，又要使其保持部分疏水基暴露在外的天然状态，这一过程叫增溶作用。

较为理想的增溶剂是去垢剂。

目前用的去垢剂分为阴离子型，阳离子型，两性离子型，非离子型。

增溶后的膜蛋白抽提剂有较好的均一性，便于进一步纯化。

纯化后的膜蛋白，可通过透析法去除去垢剂，进行膜蛋白重组。

抽提蛋白质的理想条件是尽可能促进蛋白质在溶剂中溶解，而减弱蛋白水解酶活力，以减少细胞的自溶过程。

主要是通过选择适当PH，温度，或溶剂，以及加适当蛋白水解酶抑制剂。

常见裂解方法有：1 低渗裂解，2 冻融法，3 Triton100或者NP-40等非离子去污剂（比较温柔），4 脱氧胆酸钠、SDS、Triton100 （强烈），5 上样缓冲液（含SDS）＋细胞沸水浴5 min，6 匀浆器。

2. Lowry法测定蛋白质浓度1. 蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色蛋白质-铜复合物；2. 紫红色复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸和磷钨酸，产生深蓝色，呈色强度与蛋白质浓度呈正相关，分光光度计测A750吸光度，做标准曲线3.SDS-PAGE分离蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白分析中最经常使用的一种方法.它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS）及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部及肽键之间的二硫键被还原，肽键被打开，打开的肽键靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。

蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。

平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。

重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。

将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。

4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。

（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。

（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。

二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。

western blot 实验原理Western blot是一种常用的蛋白质分析技术，通过将待检测样品中的蛋白质分离并转移到膜上，然后使用特异性的抗体探针进行特定蛋白质的检测。

Western blot实验主要包括以下步骤：1. 样品制备：待检测样品通常经过细胞裂解或组织研磨，提取蛋白质。

蛋白质溶液经过蛋白浓度测定后，可进行下一步实验。

2. SDS-PAGE电泳：蛋白质溶液经过加入含有SDS（十二烷基硫酸钠）的样品缓冲液，并在电泳条件下，通过聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide gel）分离蛋白质。

在电泳过程中，SDS会使蛋白质变成带负电荷的线性结构，相同大小的蛋白质在凝胶中的迁移速度也相似。

3. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶中转移到聚氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素（nitrocellulose）膜上。

转移通常通过将膜和凝胶在电流作用下接触，使蛋白质通过电场转移到膜上。

4. 阻断：将转移后的膜放入含有蛋白质的牛乳或鸡蛋清中，使未特异性结合位点被占据，阻断非特异性结合。

通过此步骤可以减少假阳性的可能性。

5. 抗体探针结合：将特异性抗体溶解在牛乳或鸡蛋清中，并将膜与抗体溶液接触。

抗体将与目标蛋白质特异性结合。

6. 信号检测：使用染色剂或酶标记的抗体来检测抗体-目标蛋白质结合的位置。

这些检测方法可以根据被标记物的类型而有所不同，如酶方法、放射性方法和荧光方法等。

7. 结果分析：使用成像系统（如X射线胶片或数码成像设备）捕捉膜上的信号，并在计算机软件中进行定量和定性分析。

Western blot技术可以用于检测蛋白质的表达水平、翻译后修饰以及蛋白质相互作用等，广泛应用于生物医学研究、生物制药和临床诊断等领域。

SDS-PAGE及WesternBlot简明操作指南SDS-PAGE及Western Blot简明操作指南⼀．蛋⽩样品制备推荐使⽤RIPA裂解液。

⼀般使⽤强裂解液，对于coIP可⽤弱裂解液。

1.准备⼯作：1)取⾜量裂解液，加⼊PMSF和（或）蛋⽩酶抑制剂；若要检测蛋⽩磷酸化，推荐加⼊磷酸酶抑制剂。

置于冰上预冷。

2)准备⾜量PBS，置于冰上预冷。

3)提前打开离⼼机预冷⾄4度。

2.裂解样品：（注意保持样品处于冰上，4度离⼼）1)动物组织：取1g左右置⼊离⼼管，加⼊配制好的裂解液0.5-1ml，置于冰上，⽤匀浆器充分匀浆；2)悬浮细胞：以6孔板的⼀个孔为例（⾯积约10平⽅cm）；300g离⼼10分钟，去除培养基，收集细胞；1ml 预冷的PBS重悬后，转移到1.5ml离⼼管中，300g离⼼10分钟，去除上清；加⼊60-200ul裂解液重悬细胞，置于冰上，裂解5-10分钟；裂解期间，每隔⼀分钟使⽤涡旋仪震荡5秒或使⽤移液器吹打5秒。

3)贴壁细胞：以6孔板的⼀个孔为例（⾯积约10平⽅cm）；去除培养基，⽤1ml PBS洗涤细胞；去除PBS，加⼊60-200ul裂解液，置于冰上，裂解2-3分钟；⽤细胞铲刮掉细胞，⽤移液器转移到1.5ml离⼼管中；置于冰上，裂解5-10分钟，裂解期间，每隔⼀分钟使⽤涡旋仪震荡5秒或使⽤移液器吹打5秒。

3.收集蛋⽩：1)将上述裂解样品于4度10000g离⼼10-20分钟，转移上清⾄⼀新的离⼼管，此即为蛋⽩样品。

此处样品可于-20或-80度长期保存。

4.蛋⽩的相对定量：BCA法为保证各样品western上样蛋⽩量⼀致，须定量蛋⽩；推荐相对定量；绝对定量需要在本⽅法基础上额外做BSA标准曲线。

备注：每个蛋⽩要做2个重复，blank对照须使⽤步骤2中的裂解液。

1)参考说明书，配制⾜量BCA⼯作液（多配制10%，以免不⾜）；2)取⼀96孔酶标板，在要⽤到的孔中加⼊上述BCA⼯作液，每孔100ul;3)在上述孔中分别加⼊1-2ul各蛋⽩样品及blank对照；4)将酶标板于37度孵育10-30分钟，直到出现较明显颜⾊变化即可；5)测定吸光度；6)计算相对蛋⽩含量：各吸光度去除blank背景，以吸光度最低者为参考，进⾏归⼀化处理，即计算吸光度倍数关系；western上样时，须依据此倍数关系调整各样品上样体积，以保证各样品上样蛋⽩量⼀致。