细胞的总蛋白质提取全过程及经验

蛋白质的分离纯化蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它在细胞内发挥着重要的功能。

由于蛋白质的复杂性和多样性，研究人员通常需要从复杂的混合物中分离和纯化蛋白质。

蛋白质的分离纯化是生物化学和生物技术领域中非常重要的一项工作，它为我们深入研究蛋白质的结构和功能提供了必要的条件。

蛋白质的分离纯化可以通过多种不同的方法实现，这些方法包括离心法、凝胶过滤法、电泳法、层析法等。

在选择合适的方法时，研究人员需要考虑到蛋白质的特性以及实验的要求。

离心法是最常用的分离方法之一，在离心过程中，通过调整离心力和离心时间，可以实现不同密度的蛋白质的分层。

这种方法适用于分离大分子量的蛋白质。

凝胶过滤法是利用孔径不同的凝胶将蛋白质分离开来。

通常使用的凝胶有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，这些凝胶具有不同的孔径，可以根据蛋白质的分子量选择合适的凝胶进行分离。

电泳法是基于蛋白质的电荷和分子量差异而进行分离的方法。

最常用的电泳方法是SDS-PAGE电泳，通过使用SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质进行解性和蛋白质间的形成复合物，使得蛋白质在电泳过程中仅仅受到电场力的影响，从而实现蛋白质的分离。

层析法是一种利用物质在载体上的分配和吸附性质进行分离的方法。

常见的层析方法有凝胶层析、亲和层析、离子交换层析等。

凝胶层析是通过利用载体颗粒的孔径进行分离，亲和层析是将特定配体固定在载体上，与目标蛋白质结合，从而实现分离，而离子交换层析是利用载体表面电荷与目标蛋白质的电荷相互作用进行分离。

在进行蛋白质的分离纯化时，需要注意以下几个关键步骤。

首先是样品制备，通常样品要经过细胞破碎、蛋白质提取等步骤，使得目标蛋白质从复杂的混合物中提取出来。

其次是样品的处理，包括去除杂质、调整蛋白质的溶液环境等。

然后是选择合适的分离方法，根据蛋白质的特性和实验要求来确定最适合的方法。

最后是纯化过程中的监测和分析，通过使用各种蛋白质分析方法，如SDS-PAGE、Western blot等，来确定目标蛋白质的纯化程度和鉴定其存在。

蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。

但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。

因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。

蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。

故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。

温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。

提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。

将细胞内蛋白质提取出来。

并与其它不需要的物质分开。

但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。

蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。

这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。

水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。

如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。

如球蛋白类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。

其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。

蛋白质类别和溶解性质白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。

真球蛋白: 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。

拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，则脂溶性占优势，如脂肪部分被包围于分子之中，则水溶性占优势。

蛋白的制备全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：蛋白是生物体内不可或缺的重要分子，它们参与了身体的生长发育、免疫防御、组织修复等多种生理功能。

在科学研究和工业生产中，制备纯净的蛋白是基础工作之一。

本文将介绍蛋白制备的基本原理、常用技术方法以及相关注意事项。

一、蛋白的结构和功能蛋白是由不同种类的氨基酸残基通过肽键连接而成的长链状分子。

它们可以折叠成特定的空间结构，从而实现各种功能。

蛋白的结构可以分为四个层次：一级结构是氨基酸序列的线性排列；二级结构是α螺旋或β折叠等局部结构；三级结构是各个结构域的整体折叠；四级结构是多个蛋白互相组装而成的复合体。

蛋白具有多种功能，如酶的催化作用、抗体的免疫防御、激素的信号传递等。

研究蛋白的结构和功能对于认识生物体的生命活动至关重要。

二、蛋白的制备原理蛋白的制备过程一般包括以下几个步骤：提取、纯化、结构鉴定和功能分析。

首先是蛋白的提取，即从生物体内分离出目标蛋白。

提取方法一般包括机械破碎、化学溶解和生物学方法等。

接下来是蛋白的纯化，通过不同的技术方法，如柱层析、凝胶电泳、超滤等，将目标蛋白从混合样品中分离出来。

然后是结构鉴定，利用质谱、X射线晶体学等方法确定蛋白的三维结构。

最后是功能分析，通过酶活性测定、配体结合实验等手段研究蛋白的功能。

三、常用的蛋白制备技术1.柱层析法柱层析法是一种基于蛋白分子大小、电荷、疏水性等特性的分离技术。

常用的柱层析方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、金属螯合层析等。

通过选择合适的柱和缓冲液条件，可以实现对蛋白的高效纯化。

2.凝胶电泳法凝胶电泳法是一种将蛋白按照大小、电荷分离的技术。

常见的凝胶电泳包括SDS-PAGE、原位电泳、双向电泳等。

通过凝胶电泳可以对蛋白进行定性和定量分析，为后续的进一步纯化和结构鉴定提供依据。

3.超滤法超滤法是利用不同孔径的超滤膜将混合液中的蛋白筛选出来的技术。

超滤法可以快速分离大分子和小分子，是一种高效的蛋白纯化方法。

1、原料的选择早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。

但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，- 105 - 蛋白质提取与制备Protein Extraction and Preparation因而对提取要求更复杂一些。

原料的选择主要依据实验目的定。

从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。

尽量要新鲜原料。

但有时这几方面不同时具备。

含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。

一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。

要事前调查制备的难易情况。

若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。

如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。

但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。

研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。

可能时尽量用全年均可采到的原料。

对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。

2、前处理a、细胞的破碎材料选定通常要进行处理。

要剔除结缔组织及脂肪组织。

如不能立即进行实验，则应冷冻保存。

除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。

不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。

如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。

⑴机械方法主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。

常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。

蛋白质提纯注意事项
蛋白质提纯的注意事项包括以下几点：
1. 操作应尽可能在冰上或冷库内进行，以防止蛋白质的变性。

2. 维持合适的pH，除非进行聚焦层析，所使用的缓冲溶液pH应避免与pI相同，以防止蛋白质的沉淀。

3. 使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的降解。

在纯化细胞中的蛋白质时，加入DNA酶，降解DNA，防止DNA对蛋白的污染。

4. 避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质的变性。

5. 缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境。

6. 在缓冲溶液中加入0.1~1mmol/LDTT（二硫苏糖醇）(或β-巯基乙醇），防止蛋白质的氧化。

7. 加1~10mmol/LEDTA金属螯合剂，防止重金属对目标蛋白的破坏。

8. 使用灭菌溶液，防止微生物生长。

9. 在前处理阶段，需要将蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。

动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免受单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。

然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。

细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。

如果碰上所要蛋白是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当介质提取。

注意，这只是蛋白质提纯的部分注意事项，具体的操作流程和实验条件可能需要结合实验需求和实际情况进行调整。

医学生物学研究技术与实验实验报告实验名称：细胞总蛋白的制备,SDS-PAGE，Western Blot一、实验目的1. 掌握SDS直接裂解细胞法提取蛋白质2. 掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理3. 掌握SDS-PAGE分离蛋白质的原理和技术4. 掌握半干转移的操作和Western Blot 的原理和技术二、实验原理1. 蛋白质提取常见裂解方法极其原理。

蛋白质的抽提是指破碎过程中，将生物材料在水，缓冲液或稀盐溶液等适当溶剂中浸泡，使胞内的蛋白质等内容物释放到溶剂中。

血浆，消化液和分泌液等体液中可溶性蛋白质，可不经抽提，直接进行分离。

细胞内一般蛋白质的抽提，应先将细胞膜或细胞壁破碎，然后用适当溶剂将蛋白质溶出，再用离心法除去不溶物，得到出抽提液。

膜蛋白的抽提比较复杂。

膜蛋白按其所在位置分为外周蛋白和固有蛋白。

外周蛋白通过次级键和膜外侧脂质的性头部鳌和在一起，应选则适当离子强度及PH的缓冲液，其中要好友EDTA，将其抽出。

固有蛋白嵌和在膜脂质双层中，通过疏水键于膜内侧脂质层的疏水性尾部结合。

在抽提固有蛋白时，要减弱器与膜脂的疏水性结合，又要使其保持部分疏水基暴露在外的天然状态，这一过程叫增溶作用。

较为理想的增溶剂是去垢剂。

目前用的去垢剂分为阴离子型，阳离子型，两性离子型，非离子型。

增溶后的膜蛋白抽提剂有较好的均一性，便于进一步纯化。

纯化后的膜蛋白，可通过透析法去除去垢剂，进行膜蛋白重组。

抽提蛋白质的理想条件是尽可能促进蛋白质在溶剂中溶解，而减弱蛋白水解酶活力，以减少细胞的自溶过程。

主要是通过选择适当PH，温度，或溶剂，以及加适当蛋白水解酶抑制剂。

常见裂解方法有：1 低渗裂解，2 冻融法，3 Triton100或者NP-40等非离子去污剂（比较温柔），4 脱氧胆酸钠、SDS、Triton100 （强烈），5 上样缓冲液（含SDS）＋细胞沸水浴5 min，6 匀浆器。

2. Lowry法测定蛋白质浓度1. 蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色蛋白质-铜复合物；2. 紫红色复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸和磷钨酸，产生深蓝色，呈色强度与蛋白质浓度呈正相关，分光光度计测A750吸光度，做标准曲线3.SDS-PAGE分离蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白分析中最经常使用的一种方法.它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS）及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部及肽键之间的二硫键被还原，肽键被打开，打开的肽键靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。

蛋白纯化技术路线
1.寻找来源：确定需要纯化的蛋白质所在的生物样品，可以是细胞提取物、细菌发酵液、动物组织等。

2.预处理：对样品进行预处理来去除非目标蛋白质和杂质，使目标蛋白更容易纯化。

常见的预处理方法包括超声破碎、离心、滤过等。

3.亲和层析：使用亲和层析柱选择性地结合目标蛋白质。

亲和层析柱可以根据目标蛋白质的性质选择，例如亲和剂可以是金属离子、抗体、某种结构域等。

目标蛋白质被结合到柱子上后，其他非目标蛋白质可以通过洗脱步骤洗脱下来。

4.尺寸排阻层析：利用蛋白质的分子量差异进行分离。

此步骤常用于去除亲和层析步骤中残留的杂质和非目标蛋白质。

5.离子交换层析：利用蛋白质在不同离子浓度条件下的电荷差异来实现分离。

在正负电荷基质之间的交换，可以根据蛋白质的电荷特性进行选择性结合和洗脱。

6.亲水性层析：利用蛋白质的亲水性差异进行分离。

亲水性层析可以通过调整盐浓度和pH值来选择性结合和洗脱目标蛋白质。

7.透析：用于去除层析步骤中使用的缓冲剂、杂质与目标蛋白之间的物质交换。

8.浓缩：用于将目标蛋白溶液浓缩至适当的浓度，以便于后续的研究操作。

9.纯化效果验证：使用蛋白质分析方法（如SDSPAGE、Westernblot等）来验证纯化的效果和目标蛋白质的纯度。

前言蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。

蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。

蛋白质提纯的总目标是设法增加制品纯度或比活性，对纯化的要求是以合理的效率、速度、收率和纯度，将需要蛋白质从细胞的全部其他成分特别是不想要的杂蛋白中分离出来，同时仍保留有这种多肽的生物学活性和化学完整性。

能从成千上万种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质的原因，是不同的蛋白质在它们的许多物理、化学、物理化学和生物学性质有着极大的不同，这些性质是由于蛋白质的氨基酸的序列和数目不同造成的，连接在多肽主链上氨基酸残基可是荷正电的、荷负电的、极性的或非极性的、亲水的或疏水的，此外多肽可折叠成非常确定的二级结构（α螺旋、β折叠和各种转角）、三级结构和四级结构，形成独特的大小、形状和残基在蛋白质表面的分布状况，利用待分离的蛋白质与其它蛋白质之间在性质的差异，即能设计出一组合理的分级分离步骤。

可依据蛋白质不同性质与之相对应的方法将蛋白质混合物分离：1．分子大小不同种类的蛋白质在分子大小方面有一定的差别，可用一些简便的方法，使蛋白质混合物得到初步分离。

1．1透析和超滤透析在纯化中极为常用，可除去盐类（脱盐及置换缓冲液）、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。

透析膜的截留分子量为5000左右，如分子量小于10000的酶液就有泄露的危险，在纯化中极为常用，可除去盐类、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。

超滤一般用于浓缩和脱色1．2离心分离置换缓冲液许多酶富集于某一细胞器内，匀浆后离心得得到某一亚细胞成分，使酶富集10~20倍，再对特定的酶进行纯化。

差速离心，分辨率较低，仅适用于粗提或浓缩。

速率区带法，如离心时间太长所有的物质都会沉淀下来，故需选择最佳分离时间，可得到相当纯的亚细胞成分用于进一步纯化，避免了差速离心中大小组分一起沉淀的问题，但容量较小，只能用于少量制备。

蛋白质提取常用试剂及操作方法一、原料选择和前处理（一）原料的选择早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。

但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。

原料的选择主要依据实验目的定。

从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。

尽量要新鲜原料。

但有时这几方面不同时具备。

含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。

一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。

要事前调查制备的难易情况。

若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。

如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。

但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。

研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。

可能时尽量用全年均可采到的原料。

对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。

（二）前处理1.细胞的破碎材料选定通常要进行处理。

要剔除结缔组织及脂肪组织。

如不能立即进行实验，则应冷冻保存。

除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。

不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。

如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。

⑴机械方法主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。

常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。

生物化学研究进展论文蛋白质提纯文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-生物化学研究进展作业题目蛋白质的提取、纯化姓名学号班级专业题目：蛋白质的提取、纯化姓名：专业：摘要：本文综述了蛋白质的提取原理及方法，蛋白质纯化的意义、基本原则及方法，蛋白质纯化的前景展望。

关键词：提取原理提取方法水溶液有机溶剂双水相萃纯化意义基本原则方法溶解度带电性质电荷数配体特异性前景正文：1 蛋白质样品的提取1．1蛋白质样品的提取原理提取蛋白质的基本原理主要有两方面：一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离目的，如电泳、超速离心、超滤等。

1．2 蛋白质样品的提取方法1．2．1 水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液是提取蛋白质最常用的溶剂。

通常用量是原材料体积的1—5倍，提取时需要均匀地搅拌，以利于蛋白质的溶解。

提取的温度要视有效成分性质而定，一般在低温(5℃以下)下操作。

另外，蛋白质和酶是两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH值范围内。

一般来说，在避免极端pH值的前提下，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液提取。

此外，稀浓度可促进蛋白质盐溶，并且盐离子与蛋白质部分结合，能够保护蛋白质不易变性。

因此可在提取液中加少量NaC1等中性盐，一般以0．15 mol／L浓度为宜。

1．2．2 有机溶剂提取法一些和脂质结合牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶都不溶于水、稀盐溶液、稀酸或碱，可溶于乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，具有一定的亲水性和较强的亲脂性，并且不会残留在产品中，容易蒸发除去，密度低，与沉淀物质的密度差大，便于离心分离。

但不足的是用有机溶剂来提取蛋白质比用盐析法更容易引起蛋白质变性。

细胞的总蛋白质提取全过程及经验公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]细胞的总蛋白质提取全过程及经验如果你要自己裂解细胞的时候，需要注意的事项：师兄给你的细胞要赶紧裂解，当然了，你还要看是带瓶子给你还是消化好给你的。

一般我使用的时候，是将细胞统一从几个培养瓶中消化收集起来，然后赶紧4 度下离心，用预冷的PBS 或者生理盐水洗涤细胞。

也有人喜欢在培养瓶中直接加裂解液，这个一般都是做 western 什么用的，需要的蛋白量不是很多，而且大部分时候都是要有活性的蛋白的。

一般1000rpm 足够离心了，转速太快，细胞会破碎，然后会损失蛋白。

PBS 洗涤的最后一遍，记得将细胞转移到超声管中，也许是由于普通的10mL 离心管有可能承受不了超声的能量吧，我们师兄师姐一般都用超声管来自装细胞，然后加入裂解液直接超声。

3s 每次，间歇3s 60 次，400W，重复工作复位2 次，总共超声180 次就差不多了。

裂解后的细胞要赶紧在2500g 下离心30-60min，超声管是没有盖子的，可以直接在上面加一层封口膜离心。

在离心的时候，去配制沉淀液，丙酮：无水乙醇：冰乙酸=50:50:，体积比。

一般我加的是裂解液体积的5 倍。

沉淀液要预冷，我喜欢将沉淀液放在-20 度下。

细胞离心后，上清液加入到沉淀液中，就会看到比较多的白色沉淀出现，-20 度沉淀>2h，然后就可以高速沉淀下蛋白了。

这里我们用的体积比较大，一般的离心管不能用，要用 beckman 专用的那种50mL 离心管，25000g，15-30min。

Beckman 离心管比较大，底部是平的，所以蛋白在底部并不是很牢固，在弃去上清液的时候，一定要注意用枪头缓慢的吸出！然后用5mL 做有的丙酮洗涤一遍，再用75%酒精将蛋白转移到4mL 的离心管中，当然，如果你的蛋白很少，的EP tube 也可以使用。

之所以用4mL 是因为我每次提取的蛋白量大概>10mg，而冻干后的蛋白复溶后测定浓度，一般要求在5-6mg/mL 之间，所以buffer 的体积也会比较的大。

动物细胞或组织的蛋白质抽提步骤步骤一：收集和处理样品首先，需要收集要研究的动物细胞或组织样品。

样品可以是从细胞培养物中收集的细胞，也可以是从动物体内收集的组织。

在收集样品之前，可以用生理盐水冲洗样品，以去除与研究无关的物质。

步骤二：细胞破碎和组织研磨接下来，需要将细胞破碎或组织研磨，以释放细胞内或组织内的蛋白质。

对于细胞破碎，可以使用一些方法，如机械破碎、超声波破碎或冻融破碎等。

对于组织研磨，可以使用搅拌器或研磨器等工具进行研磨。

步骤三：离心步骤四：蛋白质提取将经过离心的上清液取出，即为蛋白质提取物。

蛋白质提取液可以选择不同的组成，以适应研究的目的。

一般来说，一个典型的蛋白质提取液可能包含以下成分：蛋白酶抑制剂（如PMSF）、还原剂（如DTT或β-巯基乙醇）、溶解剂（如甲醇或异丙醇）、洗涤剂（如Triton X-100或Tween-20）以及缓冲液（如磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液）等。

这些成分对于蛋白质的稳定性、可溶性和抽提效果起着重要作用。

步骤五：蛋白质浓缩为了浓缩蛋白质，可以使用一些方法，如醋酸沉淀、有机溶剂沉淀或钙盐沉淀等。

这些方法可以使蛋白质从提取液中沉淀下来，以减少液体体积并提高蛋白质浓度。

步骤六：蛋白质分析最后，可以对蛋白质抽提物进行分析。

常用的蛋白质分析方法包括SDS-凝胶电泳、Western blotting、质谱分析等。

这些方法可以用于分析蛋白质的分子质量、浓度、结构和功能等。

总结起来，动物细胞或组织的蛋白质抽提步骤包括：收集和处理样品、细胞破碎和组织研磨、离心、蛋白质提取、蛋白质浓缩和蛋白质分析。

这些步骤的选择和优化将根据具体的实验目的和要求进行调整。

蛋白质组学蛋白提取
蛋白质组学是研究生物体内蛋白质的全套组成及其功能的一门
学科。

蛋白质提取是蛋白质组学研究的第一步，其目的是从生物样
本中提取出蛋白质，并为后续的分离、鉴定和定量分析做准备。

蛋
白质提取的方法和步骤多种多样，常见的方法包括物理破碎、化学
溶解和生物学方法等。

在蛋白质提取的过程中，首先需要选择合适的样本，例如细胞、组织或血清等，然后进行细胞破碎或组织研磨等操作，以释放蛋白质。

接着，需要选择合适的提取缓冲液，常用的包括Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液等，以维持蛋白质的天然构象和活性。

随后，还
需要加入蛋白酶抑制剂和还原剂来保护蛋白质免受降解和氧化的影响。

蛋白质提取的方法还包括离心、超声波破碎、冷冻-解冻等步骤，以确保蛋白质的完整性和纯度。

此外，还可以利用亲和层析、离子
交换层析、凝胶过滤层析等技术进一步纯化蛋白质。

最后，可以利
用SDS-PAGE、Western blot、质谱等技术对提取的蛋白质进行分析
和鉴定。

总的来说，蛋白质提取是蛋白质组学研究中至关重要的一步，其质量和效率直接影响后续的实验结果和数据解读。

因此，在进行蛋白质提取时，需要根据具体的样本特点和研究目的选择合适的提取方法，并严格控制实验条件，以确保蛋白质的完整性和纯度。

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原核细胞分泌蛋白的合成和运输过程要写一篇关于原核细胞分泌蛋白的合成和运输过程的文章，我们可以从一个轻松幽默的角度来展开。

首先，让我们简单明了地了解一下原核细胞的蛋白质合成与运输的全过程，像讲故事一样，让你对这个生物学话题感兴趣。

1. 蛋白质的合成：从“头”到“尾”原核细胞里的蛋白质合成，简单说就是细胞如何生产这些对它们生活至关重要的“工人”。

一开始，细胞里的DNA像一本厚重的食谱书，里面写满了制作不同蛋白质的配方。

细胞里有个叫做“转录”的过程，简单来说，就是把这本食谱上的内容抄到一张便条纸上，这张便条纸叫做mRNA。

接着，这张便条会被送到细胞的工厂里——也就是核糖体。

核糖体就像是工厂的生产线，它根据mRNA上的“说明书”来拼装蛋白质。

想象一下，一个厨师根据菜谱做菜一样，只不过这儿的原料是氨基酸。

氨基酸就像是菜谱里的各种配料，厨师需要把它们一一混合、加热、调味，最终完成美味的蛋白质。

整个过程虽然看似简单，但每一步都要精准无误，不能出现一丝差错。

2. 从工厂到外面的世界：蛋白质的运输好了，蛋白质做好了，接下来就是如何把它们送到需要它们的地方。

原核细胞不像真核细胞那样有复杂的运输系统，它们通常通过简单的方式完成这项任务。

完成的蛋白质会被“包装”到细胞膜上的小泡泡里，这些小泡泡叫做“分泌泡”。

分泌泡就像是快递公司，用来运输蛋白质到细胞外。

这些分泌泡会和细胞膜融合，把里面的蛋白质释放到外面。

就像你把快递箱从家里送到门口，分泌泡把蛋白质送到细胞外。

这个过程可能看起来很简单，但实际上，需要细胞膜和分泌泡之间的精准配合，才能保证蛋白质顺利到达目的地。

3. 过程中的“微小细节”：从“开始”到“结束”在这整个过程中，有许多微小的细节需要注意。

比如，在蛋白质合成的过程中，氨基酸的顺序必须完全正确，否则蛋白质的功能就会受到影响。

这就好比做一道复杂的菜肴，配料的比例和顺序都至关重要。

任何一点差错，都可能导致做出来的菜肴味道大打折扣。

一、实验目的1. 掌握细胞总蛋白提取的基本原理和方法；2. 熟悉实验操作流程，提高实验技能；3. 为后续的蛋白质分析、鉴定等实验提供优质蛋白样品。

二、实验原理细胞总蛋白提取是指从细胞中提取出全部蛋白质的过程。

实验中，通过细胞裂解、离心、沉淀等步骤，将细胞内的蛋白质分离出来。

蛋白质提取过程中，常用的裂解液有RIPA、SDS-PAGE样品缓冲液等。

本实验采用RIPA裂解液进行细胞总蛋白提取。

三、实验材料1. 细胞：实验所用的细胞种类及数量；2. 裂解液：RIPA裂解液；3. PBS缓冲液；4. 离心机；5. 离心管；6. 移液器；7. 冰箱；8. 细胞培养皿；9. 细胞刮刀；10. 蛋白质浓度测定试剂盒；11. 蛋白质定量标准品。

四、实验步骤1. 准备工作：将细胞培养皿置于培养箱中，待细胞生长至适宜密度后，取出细胞培养皿。

2. 细胞裂解：（1）弃去上层清液，用PBS缓冲液清洗细胞培养皿两遍；（2）将多余的PBS缓冲液吸干净，加入RIPA裂解液；（3）将细胞培养皿平放在碎冰上，静置5min；（4）用细胞刮刀来回刮培养皿底部，直至培养皿底部干净；（5）吸取培养皿内的液体，转移到EP离心管内；（6）在碎冰上静置15min。

3. 离心分离：（1）将EP离心管放入低温超高速离心机内；（2）离心速度和时间根据细胞裂解程度和蛋白质特性确定；（3）取出离心管，将上清液转移到新的EP管中。

4. 蛋白质定量：（1）按照蛋白质浓度测定试剂盒说明书，进行蛋白质定量实验；（2）将样品与标准品进行对比，计算样品蛋白质浓度。

五、实验结果与分析1. 通过细胞裂解、离心等步骤，成功提取出细胞总蛋白；2. 蛋白质定量结果显示，样品蛋白质浓度为X mg/mL。

六、实验总结1. 本实验成功提取了细胞总蛋白，为后续蛋白质分析、鉴定等实验提供了优质蛋白样品；2. 在实验过程中，注意操作规范，确保实验结果的准确性；3. 提高实验技能，为今后的科研工作打下坚实基础。

组织蛋白提取步骤标题：组织蛋白提取步骤：从样本收集到蛋白质溶解的全面解析引言：组织蛋白提取是生物学和生物化学领域中非常重要的实验步骤之一。

它是为了研究组织中的蛋白质表达、功能和相互作用而必不可少的前提。

本文将从样本收集到蛋白质溶解的全过程，详细介绍组织蛋白提取的步骤和要点，旨在帮助读者更全面、深入地了解该领域的相关内容。

第一部分：样本收集与处理1.1 样本预处理：在进行组织蛋白提取前，首先需要进行样本预处理。

这包括以无菌的方法收集样本，如组织切片、细胞培养等，同时需避免样本受到污染和降解。

1.2 样本保存：为了保持蛋白质的完整性和稳定性，样本应尽快保存在适当的温度下，如低温或液氮中。

选择合适的保存缓冲液也是至关重要的。

第二部分：样品裂解与溶解2.1 细胞破碎：细胞破碎是为了破坏细胞膜，释放细胞内的蛋白质。

可以选择化学法、物理法或酶解法等方法进行细胞破碎，其中磁珠法和超声法是常用的技术。

2.2 组织破碎：与细胞破碎类似，组织破碎旨在释放组织内的蛋白质。

取决于样本特性，可以使用搅拌器、研钵、超声或高压等方式进行组织破碎。

2.3 组织裂解：组织裂解是将细胞或组织中的蛋白质从细胞核、细胞器等结构中溶解出来。

常用的方法有机械法、酸法、碱法以及使用细胞裂解液等。

具体的选择取决于研究的目的和样本特性。

2.4 蛋白质溶解：蛋白质溶解是将裂解后的蛋白质完全溶解于适当的缓冲液中，以便后续的实验操作，如电泳、质谱等。

在溶解过程中，需要注意取决于蛋白特性而添加的表面活性剂、螯合剂和保护剂。

第三部分：总结与回顾在本文中，我们详细介绍了组织蛋白提取的各个步骤。

我们强调了样本收集和处理的重要性，包括样本预处理和正确的保存方法。

我们着重介绍了细胞破碎和组织破碎的常用方法。

我们强调了组织裂解和蛋白质溶解的关键环节。

通过了解和掌握这些关键步骤，我们可以更好地提取和保护样本中的蛋白质，为后续的实验操作提供高质量的样品。

这对于研究蛋白质组学、蛋白质功能研究以及药物研发等领域都具有重要意义。

WB原理步骤及总结范文实验原理蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上，然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，SDS是阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。

SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4:1，由于SDS带有大量的负电荷，与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋白质带有相同密度的负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。

因此，利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线，可以求得未知蛋白的相对分子质量。

电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。

方法有两种：①水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电10~30min可完成②垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电2~4h或过夜可完成。

固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。

蛋白质转移到固定化膜上之后，通过蛋白质染料如丽春红S检测膜上的总蛋白，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。

用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为4步：①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜上，出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物，适当保温，膜上便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。

主要溶液10%分离胶水 3.3mL、30%丙烯酰胺混合液 4.0mL、1.0mol/LTri（pH8.8）2.5mL、10%SDS0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED0.004mL5%浓缩胶水2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/LTri0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵0.04mL、TEMED0.004mL1某Tri–甘氨酸电泳缓冲液Tri碱3.03g、甘氨酸18.77g、SDS1g，用去离子水定容至1L2某SDS凝胶加样缓冲液Tri-HCl（pH6.8）100mmol/L，β-巯基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚蓝，10%SDS转移缓冲液Tri2.45g，甘氨酸11.25g，甲醇100mL，加去离子水至1LTBSTTri1.21gNaCl8.77g，Tween-201mL，加去离子水至1LStripping1.3mLTri（pH6.8），4mL10%SDS，140μlβ-巯基乙醇，用水定容到20mL实验步骤1SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶配置①分离胶的配置：将配置好的分离胶液混匀后迅速倒入胶槽中，至距离短玻璃板顶端约2cm处，停止灌胶。