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蛋白提取方法蛋白是生物体内一种重要的有机化合物，具有多种生物学功能。
在生物医学研究、食品工业、药物研发等领域，蛋白的提取和纯化是非常重要的工作。
本文将介绍几种常见的蛋白提取方法，希望能对相关领域的研究人员有所帮助。
1. 细胞裂解法。
细胞裂解法是一种常见的蛋白提取方法，它通过破坏细胞膜，释放细胞内的蛋白质。
通常采用机械方法（如超声波破碎、高压破碎）或化学方法（如洗涤剂裂解）来实现细胞裂解。
这种方法操作简单，提取效率较高，适用于大多数类型的细胞。
2. 亲和层析法。
亲和层析法是一种通过蛋白与特定配体之间的亲和作用来实现蛋白提取的方法。
常用的亲和层析配体包括金属离子、抗体、亲和标记物等。
通过将这些配体固定在固定相上，再将混合蛋白溶液通过柱子进行层析，从而实现对目标蛋白的选择性提取。
这种方法对蛋白的纯化效果较好，但成本较高。
3. 凝胶过滤法。
凝胶过滤法是一种通过分子大小差异实现蛋白提取的方法。
通常采用多孔性凝胶作为固定相，将混合蛋白溶液通过凝胶柱进行层析，从而实现对蛋白的分离和提取。
这种方法操作简单，对蛋白的形态和功能影响较小，适用于对蛋白分子大小要求较高的应用场景。
4. 盐析法。
盐析法是一种通过蛋白与盐溶液中离子相互作用的差异实现蛋白提取的方法。
在盐浓度逐渐增大的过程中，蛋白质的溶解度会发生变化，从而实现对蛋白的分离和提取。
这种方法操作简单，成本较低，适用于对蛋白的选择性提取要求不高的场景。
5. 超滤法。
超滤法是一种通过膜的孔径大小选择性分离蛋白的方法。
通常采用超滤膜将混合蛋白溶液进行过滤，从而实现对蛋白的提取。
这种方法操作简单，对蛋白的分离效果较好，但需要注意膜的选择和操作条件的控制。
总结。
蛋白提取是生物医学研究、食品工业、药物研发等领域中的重要工作。
本文介绍了几种常见的蛋白提取方法，包括细胞裂解法、亲和层析法、凝胶过滤法、盐析法和超滤法。
每种方法都有其特点和适用场景，研究人员可以根据具体的实验要求选择合适的方法进行蛋白提取工作。
蛋白提取实验步骤：1、细胞总蛋白提取A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。
如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B、对于贴壁细胞:a、用TBS冲洗细胞2-3次。
最后一次彻底吸干残留液。
b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。
期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。
加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。
如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。
冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复冻融。
蛋白提取实验步骤：1、细胞总蛋白提取A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。
如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B、对于贴壁细胞:a、用TBS冲洗细胞2-3次。
最后一次彻底吸干残留液。
b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。
期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。
加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。
如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。
冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复冻融。
蛋白提取实验步骤:1、细胞总蛋白提取A对于悬浮细胞：离心收集细胞，每106细胞加250 Ul RlPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。
如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B对于贴壁细胞：a用TBS冲洗细胞2-3次。
最后一次彻底吸干残留液。
b加入适当体积的RIPA （使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。
期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
C冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D 12000g离心5min,收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：A组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。
加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。
如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。
冰浴30min,期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C 12000g离心5min,收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80 C 冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200 μ l ）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80 C短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20 C保存，避免反复精品佳作，安心下载，放心使用冻融。
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细胞组织裂解(提蛋白)方法编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（细胞组织裂解(提蛋白)方法）的内容能够给您的工作和学习带来便利。
同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。
本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为细胞组织裂解(提蛋白)方法的全部内容。
蛋白匀浆缓冲液：50 mM Tris—HCl (pH7。
5) 150 mM NaCl 5 mM EDTA 1 % NP-40 1 mM PMSF操作步骤直接用这个进行组织匀浆然后于10000 rpm 离心20分钟收集上清作SDS－PAGE电泳从染色的情况来看所得到的总蛋白纯度都不错条带比较清晰。
我是作的小鼠八种常规组织也包括肾脏在内.将抽提好的蛋白分装后直接放在负八十保存。
上样大概3~8ul每孔都可以的具体看个人需要。
70v 浓缩,150v分离第二种方法裂解液配方: 尿素：8M CHAPS：4％DTT：65mM(现加) PMSF：1mM(现加）MiliQ 水操作步骤：取300mg样品在液氮环境下研磨，加入1ml裂解液混匀，室温静置1小时（实验证明改为匀浆更好，蛋白降解轻），15000g离心1小时，取上清测定蛋白质浓度。
在裂解液中加IPG buffer有两个作用:1，增强蛋白质的溶解性2,可以结合核酸，在沉淀的时候予以除去。
建议最好加,浓度从0。
5—2％不等（这取决于您样品蛋白质的难溶程度）。
IPG buffer 是载体两性电解质，IPG buffer另外一个作用是促进蛋白质溶解的，所以IEF前一定要加,裂解液中没有IPG buffer可以么？（可以的，最后上胶条的时候可以再加）不过，我觉得液氮研磨以后，最好是粗离心一下,把一些结缔组织给离心掉（150g既可)然后再加裂解液。
单层贴壁细胞总蛋白的提取1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2. 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。
平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
3. 【配制裂解试剂，现用现配制】按1ml RIPA + 25μl PMSF（100mM）+ 110μl Pi（PhosSTOP磷酸酶抑制剂），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）4. 每瓶细胞加100 μl的裂解液，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5. 裂解完后，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）6. 于4℃下12000rpm离心15 min。
（提前开离心机预冷）7. 将离心后的上清分装转移倒0.6ml的离心管中放于-80℃保存。
PhosSTOP磷酸酶抑制剂（stock solution）配制方法：1片PhosSTOP+1ml RIPA，充分溶解后按110ul封装9管。
-20℃保存有效期6月，4℃保存有效期1月。
BCA法测定蛋白浓度检测试剂准备：1．BCA工作液（室温）2．RIPA（1ml）（4℃）3．蛋白工作液（0.5mg/ml）（4℃）4．96-Well板5．冰盒6．待测样品（4℃）操作步骤：1. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。
2. 标准孔加样3. 待测样品稀释20倍，19μl RIPA + 1μl（待测样品）4. 测定本底，20μl RIPA加3孔，取平均值。
5. 各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置20分钟。
组织蛋白提取材料准备：组织、冰块、称、超声匀浆器、试剂各种试剂比例：PMSF：Lysis Buffer = 1:1001、将组织称重，减去EP管重量2、每100mg组织加入1mL(1mg ,10ul)试剂，冰上裂解半小时3、匀浆（注意低温操作），开20秒，关2秒，共打20次，每次用水冲洗，擦干，超声完后放冰上4、将匀浆液移至1.5mL预冷离心管5、离心，12000转，4℃，30分钟6、取上清至新的预冷的EP管7、BCA定量8、放入—80℃线粒体蛋白提取材料准备（放冰盒中）：线粒体试剂、EP管、EP管中的组织、枪头、PBS1、用冷PBS清洗细胞2次，洗后吸干上清2、加入A200uL，放冰上10分钟3、匀浆30-40次，每次用清水清洗匀浆器头4、离心500rpm，4℃，5分钟5、将上清移至离心管6、离心1100rpm，4℃，20分钟7、沉淀中加入200uLB，混匀8、离心1100rpm，4℃，20分钟9、弃上清10、加入80-150uL裂解液，放冰上20分钟，每隔5分钟高速震荡15秒，11、得线粒体蛋白12、定量后放-80℃冰箱。
细胞总蛋白提取材料准备：试剂（—20℃）、细胞培养板、EP管（已标记）均放置于冰盒中操作，以防止蛋白降解。
1、吸掉培基2、加入PBS，约1ml/孔左右，用手晃匀3、约5min后倒去PBS，并用枪将PBS尽量吸尽4、加入试剂，摇床振荡10分钟，再置冰上10分钟。
培养器皿面积（cm2）培养液量（ml）细胞量裂解液（ul）96 孔培养板0.32 0.1 10524孔培养板 2 1.0 5×10512孔培养板 4.5 2.0 1066孔培养板9.6 2.5 2.5×106803.5 cm 培养皿8 3.0 2×1066 cm 培养皿21 5.0 5.2×10632010 cm 培养皿55 10.0 13.7×10680025cm2培养瓶25 5.0 5×10675cm2培养瓶75 15～30 2×1075、用黄色枪头将各孔中cell刮下，保证孔底部分都要刮到，根据分组将细胞悬液吸入各个EP管中。
碧云天裂解液
对于培养细胞样品：
1. 融解RIPA裂解液，混匀。
取适当量的裂解液，在使用前数分钟
内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
(PMSF水中不稳定，60分钟完全降解，若实验超过60分钟，应补加PMSF)。
2. 对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液
洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。
按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。
用枪吹打数下（或者用细胞刮），使裂解液和细胞充分接触。
通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。
对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。
按照6孔板每孔细胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。
再用手指轻弹以充分裂解细胞。
充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。
如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。
3. 充分裂解后，10000-14000g 4℃离心10分钟，取上清，即可进
行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
wb蛋白提取步骤WB蛋白提取步骤一、引言WB（Western Blot）蛋白提取是一种常用的蛋白质分析方法，通过将样品中的蛋白质分离、定量和检测，可以研究蛋白质的表达水平、功能和相互作用等。
本文将介绍WB蛋白提取的步骤及操作要点。
二、样品准备1. 收集样品：根据研究目的，选择合适的样品进行提取。
样品可以是细胞、组织、血清、培养基等。
2. 样品处理：对于细胞和组织样品，可先用PBS缓冲液洗涤去除残留的培养基或组织液。
对于血清样品，可离心去除悬浮的细胞或血小板。
三、蛋白提取1. 细胞裂解：将细胞沉淀离心后，加入细胞裂解液，使细胞膜破裂释放蛋白质。
可以选择不同的细胞裂解液，如RIPA缓冲液、NP-40缓冲液等。
2. 组织裂解：将组织样品切碎后，加入组织裂解液，将组织细胞破碎并释放蛋白质。
组织裂解液可以选择RIPA缓冲液、Tris-HCl缓冲液等。
3. 蛋白质提取：将裂解液离心，收集上清液，即为蛋白提取物。
可以通过BCA方法或Lowry方法等测定蛋白质的浓度。
四、蛋白质分离与检测1. SDS-PAGE凝胶电泳：将蛋白样品加热变性，然后加载到凝胶孔中，施加电场使蛋白质在凝胶中进行分离。
常用的凝胶浓度为8%~15%。
2. 转膜：将凝胶中的蛋白质转移到膜上，常用的转膜方法有湿式转膜和半干式转膜。
常用的膜材料有PVDF膜和NC膜。
3. 阻断与孵育：将转膜后的膜放入阻断液中进行孵育，阻断非特异性结合位点，避免假阳性结果的产生。
4. 一抗和二抗孵育：将目标蛋白特异性抗体（一抗）孵育于膜上，然后孵育与一抗结合的二抗，二抗中带有标记物，例如辣根过氧化物酶（HRP）等。
5. 显色与成像：使用化学发光法或染色法，使膜上特定蛋白质形成显色带，然后使用成像系统进行成像和分析。
五、结果分析通过观察显色带的位置和强度，可以初步判断蛋白质的表达水平。
根据需要可以进行定量分析，使用专业软件测量带的强度，并与内参蛋白进行比较分析。
六、注意事项1. 样品保存：样品提取后应及时保存，避免蛋白质降解。
Trizol法提取细胞总蛋白
1.提取细胞总RNA吸去上清后，按0.3ml乙醇/1ml Trizol加入中间层和下层有机
相，混匀，室温静置3 min；
2.4℃，2000 rpm，离心5 min，取上清转移至新的EP管中（约0.8 ml）；
3.加入1．5 ml异丙醇沉淀蛋白质，室温放置10 min；
4.4℃，12000 rpm，离心10 min，弃上清；
5.用2 ml含有0．3 mol／L盐酸胍的95％乙醇洗涤蛋白质沉淀，室温放置20 min，
4℃，7500 rpm离心5 min；重复洗涤三次；
6.无水乙醇洗涤一次沉淀，室温放置20 min；
7.4℃，7500 rpm，离心5 min；
8.真空干燥沉淀，加入适量l％SDS，55℃振荡溶解3 h；
9.不溶物再以4℃，10000 rpm离心10 min，取上清即为细胞总蛋白溶液，分装
后于-80℃保存待用。
全程大约需配制试剂
0.3M盐酸胍95%乙醇溶液：2.866 g盐酸胍，加100 ml 95%乙醇。
1%SDS溶液：1g SDS 溶解于100 ml去离子水。
细胞蛋白提取实验步骤嘿，朋友们！今天咱就来讲讲细胞蛋白提取实验步骤，这可是个超级有趣的事儿呢！咱先得准备好各种东西呀，就像战士上战场得拿好自己的武器一样。
那得有新鲜的细胞样本，这可是咱的宝贝原料哦。
还有各种试剂，就像调料一样，缺了可不行。
然后呢，就开始操作啦！把细胞样本放进合适的容器里，这就好比给它们找了个家。
接着加入裂解液，这裂解液就像是一把钥匙，能把细胞的大门打开，让蛋白跑出来。
然后就晃呀晃呀，让它们好好地混合均匀。
这时候，你就想象一下，细胞们在里面被晃得晕头转向的，蛋白就趁机跑出来啦。
接下来，把这混合物放到冰上冷静冷静，让蛋白们也冷静一下，别乱跑。
之后呢，就是离心啦！把它们放到离心机里，离心机就像个大力士，呼呼地转起来，把蛋白和其他杂质分开。
这就像是在挑拣宝贝，把好的留下，不好的甩出去。
离心完了，取上清液，这上清液里可就有咱要的蛋白啦！就像在一堆沙子里找到了金子一样让人开心。
再接下来，可能得根据需要进行一些处理，比如浓缩呀或者纯化呀。
这就像是给蛋白们打扮打扮，让它们更漂亮更纯净。
你说这细胞蛋白提取实验像不像一场奇妙的冒险？每一步都充满了惊喜和挑战。
要是哪一步不小心出错了，哎呀，那可就麻烦啦，就像走在路上摔了一跤一样。
所以咱得小心翼翼地，认真对待每一个步骤。
在这个过程中，可不能马虎哦！要像爱护自己的宝贝一样爱护这些实验用品和样本。
要是不小心把试剂弄洒了，或者把样本搞坏了，那可就得不偿失啦。
而且呀，做实验的时候得有耐心，不能着急。
就像炖一锅好汤，得慢慢炖才能出味道。
这细胞蛋白提取实验也是，一步一步慢慢来，才能得到好结果。
总之呢，细胞蛋白提取实验步骤虽然有点复杂，但只要咱认真去做，肯定能成功的！加油吧，朋友们，让我们在这个奇妙的实验世界里畅游，发现更多的秘密和惊喜！。
细胞蛋白提取的方法
细胞蛋白提取是一种从细胞中分离出蛋白质的重要实验操作。
常用的细胞蛋白提取方法有以下几种：
1. 碱裂解法：将细胞用碱性溶液（如Tris-HCl）破碎，破坏细胞膜结构释放细胞内的蛋白质。
2. 高渗透法：通过增加高盐浓度或高甘油浓度的溶液来破坏细胞膜，使蛋白质释放到溶液中。
3. 离心法：将细胞用生理盐水或缓冲液洗涤后，利用离心的力将细胞沉淀下来，然后用溶液溶解细胞膜并释放蛋白质。
4. 超声法：利用超声波的机械作用力破碎细胞，将蛋白质释放到溶液中。
5. 高压法：利用高压力将细胞膜破裂，释放蛋白质。
6. 化学法：使用化学试剂破坏细胞膜结构，如氯仿、酚酸等。
7. 冻融法：通过冻结和解冻的循环操作破坏细胞膜，释放蛋白质。
以上方法根据实验需要和研究对象的不同，可以选择适合的一种或多种方法进行细胞蛋白提取。
细胞蛋白提取步骤
细胞蛋白提取是为了获取细胞中的可溶性蛋白质，以进行后续的分析和研究。
以下是一般的细胞蛋白提取步骤：
1. 细胞采集：选择需要提取蛋白的细胞种类，并通过离心等方法将细胞收集。
2. 细胞裂解：将细胞使用裂解缓冲液裂解，以释放细胞内的蛋白质。
常见的裂解缓冲液包括RIPA缓冲液、NP-40缓冲液等。
3. 超声处理：将细胞裂解液进行超声处理，以进一步破碎细胞结构，释放蛋白质。
超声处理可以通过超声波清洗机或超声波细胞破碎仪进行。
4. 离心：将超声处理后的细胞裂解液进行离心，以去除细胞碎片和其他杂质。
5. 收集上清液：将离心后的上清液转移至新的离心管中，作为细胞蛋白提取的样品。
6. 蛋白含量测定：使用蛋白含量测定方法（如BCA、Lowry 等）测定提取的蛋白质浓度，以便后续实验设计的参考。
细胞蛋白提取步骤可能因实验目的或细胞种类的不同而有所差异。
在进行细胞蛋白提取之前，可以参考相关文献或实验方案，选择适合自己研究的步骤和试剂。
细胞总蛋⽩提取⽅法细胞总蛋⽩提取⽅法⼀、溶液配制1.100mM NaF (NaF MW=41.99) 10ml称取NaF 41.99mg，超纯⽔8ml溶解后定容⾄10ml。
2.100 mM PMSF3.RIPA溶液100ml成分分⼦量终浓度Tris 121.14 0.6 g 5.0 mM (pH 7.4)NaCl 58.44 0.87 g 150 mMEDTA 372.24 37.22 mg 1 mMNP-40 1 ml 1%SDS 0.1 g 0.1% 脱氧胆酸钠0.5 g 0.5% 溶解于80 ml超纯⽔中，待溶解后加⼊HCl调pH值⾄7.4，定容⾄100 ml。
※使⽤前加⼊成分储存浓度加⼊量终浓度PMSF 100 mM 10µl/1ml 1 mMNaF 100 mM 10µl/1ml 1 mM Aprotinin 10µg/µl0.2µl/1ml 2µg/µlLeupetin 10µg/µl0.2µl/1ml 2µg/µl⼆、⽅法1.细胞收取1)细胞传代⾄60mm培养⽫中，待细胞融合约100%，收集细胞2)弃培养基，加⼊PBS 2ml清洗培养⽫⼀次，弃PBS。
3)加⼊0.05%胰酶2ml，37℃温育1min。
4)待细胞变形后，将细胞吹下转移⾄⼀个1.5mlependorf 管中，10,000rpm×3min，4℃5)弃上清，1ml预冷的PBS清洗沉淀，10,000rpm×3min，4℃6)重复PBS清洗⼀次7)弃上清，-80℃冻存待裂解2.蛋⽩提取1)向细胞沉淀中加⼊200µl RIPA缓冲液(含1mM PMS1mM NaF、2µg/ml Aprotinin、2µg/ml Leupetin)后冰上放置40mins10,000rpm×15min，4℃将上清转移⾄⼀个新的ependorf 管中（约250µl）三、注意事项1、低温可避免蛋⽩降解，所有离⼼管需预冷。
凯基全蛋白提取试剂盒Cat Number：For Research Use OnlyStore at 4℃ for one yearExpire date：一、 试剂盒说明本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取全蛋白， 用含有蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液Lysis Buffer匀浆裂解组织或细胞，作用温和，提取过程简便高效。
获得的全蛋白可用于Western Blot、免疫共沉淀等后续研究，但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀的研究，因本试剂盒中包括这两种酶的抑制剂。
二、 试剂盒组份组份 KGP250 （50 tests） KGP2100（100 tests）储存温度 Lysis Buffer 50 mL 100 mL 4℃磷酸酶抑制剂 250 μL 500μL -20℃蛋白酶抑制剂 50 μL 100 μL -20℃PMSF（100mM）500 μL 1000 μL -20℃L三、 操作步骤Ⅰ 实体组织蛋白的提取1． 在每1mL 冷Lysis Buffer加入5 μL磷酸酶抑制剂， 1 μL蛋白酶抑制剂和 5μL 100mM PMSF，混匀。
冰上保存数分钟待用。
2． 每100mg固体组织置于培养皿中，手术剪剪碎成3mm×3mm左右的小块，加入0.5～1 mL冷 Lysis Buffer，玻璃匀浆器上下手动匀浆15次，注意低温操作；3． 取组织匀浆液转移到1.5mL预冷的离心管，离心10000转/分，4℃离心5 min；4． 取上清转移至新的预冷的离心管中，即为全蛋白提取物，蛋白定量（Bradford法、BCA法）；5． 分装保存于-70℃,避免反复冻融。
Ⅱ 培养细胞蛋白提取1． 贴壁培养的细胞，吸去培养基后，加入10mL/150mm培养板的冷PBS洗两次，每次振摇数次以尽量去除培养液；2． 悬浮培养的细胞或用细胞刮子刮下的贴壁细胞，将细胞及培养液移至离心管中， 1000转/分离心10 min，再用10mL/150mm培养板的冷PBS，1000转/分离心5 min洗两次；3． 在每 1mL冷 Lysis Buffer加入5μL磷酸酶抑制剂， 1μL蛋白酶抑制剂和5μL 100mM PMSF，混匀。
T r i z o l法提取细胞总蛋
白
集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#
Trizol法提取细胞总蛋白
1.提取细胞总RNA吸去上清后，按乙醇/1ml Trizol加入中间层和下层有机相，混匀，
室温静置3 min；
2.4℃，2000 rpm，离心5 min，取上清转移至新的EP管中（约 ml）；
3.加入1．5 ml异丙醇沉淀蛋白质，室温放置10 min；
4.4℃，12000 rpm，离心10 min，弃上清；
5.用2 ml含有0．3 mol／L盐酸胍的95％乙醇洗涤蛋白质沉淀，室温放置20 min，
4℃，7500 rpm离心5 min；重复洗涤三次；
6.无水乙醇洗涤一次沉淀，室温放置20 min；
7.4℃，7500 rpm，离心5 min；
8.真空干燥沉淀，加入适量l％SDS，55℃振荡溶解3 h；
9.不溶物再以4℃，10000 rpm离心10 min，取上清即为细胞总蛋白溶液，分装后于-
80℃保存待用。
全程大约需配制试剂
盐酸胍95%乙醇溶液： g盐酸胍，加100 ml 95%乙醇。
1%SDS溶液：1g SDS 溶解于100 ml去离子水。
细胞全蛋白提取步骤
①吸取培养基，预冷PBS清洗细胞三次，细胞刮刮脱细胞，收集至离心管，1000rpm离心5分钟。
洗涤后的细胞转移至洁净EP管，
②冰上操作，配制细胞裂解液，1ml Lysis,Buffer中加入10 μl磷酸酶抑制剂、
1 μl蛋白酶抑制剂、5μl 100mM的PMSF。
混匀后冰上保存数分钟待用。
③在洗涤好的细胞中按照每107个细胞加入1ml细胞裂解液的比例，加入细胞裂解液。
200μl移液器反复吹打，至蛋白析出。
④4℃摇床，温和振摇15分钟。
⑤14000rpm，4℃离心15分钟，上清即为细胞全蛋白提取物。
⑥BCA法测蛋白浓度。
蛋白分装后保存于-70℃冰箱，避免反复冻融。
提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷，防止蛋白降解。
